牛病毒性腹泻-粘膜病病毒地方株动物回归试验

【目的】自流产奶牛粪便及血液中分离得到的非细胞病变型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV),为了解分离毒株的特性,进行回归动物试验;【方法】将此分离毒回归2月龄健康犊牛,接毒25天后扑杀剖检,观察临床症状及病理变化。自犊牛体内采取脾、骨髓、肠淋巴结及血液接种MDBK细胞进行培养,分离病毒,进行细胞传代,将此细胞毒进行RT-PCR检测;【结果】犊牛表现为典型的急性病毒性腹泻症状和病变。自病料分离病毒经MDBK细胞盲传至第9代,均未出现细胞病变。将此细胞毒进行RT-PCR检测,扩增出相应的665bp的片段;【结论】将分离株接种易感犊牛以复制出BVD-MD病症,并从试验牛体内分离得到BVDV,从而进一步确证分离到的毒株属BVDV。     

牛病毒性腹泻病毒RT—PCR检测方法研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测牛病毒性腹泻病毒抗原的RT-PCR方法;【方法】根据已发表的牛病毒性腹泻病毒株(BVDV)5’端非编码区保守序列设计合成了两条引物,应用RT-PCR技术对两株BVDV标准株(OregonC24V and NADL)进行基因扩增,对扩增产物进行酶切鉴定。同时设猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK细胞作对照;【结果】两株BVDV标准株均扩增出了长度为325bp的片段,扩增产物经酶切后形成长度为111bp和214bp两条片段,而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK正常细胞扩增均为阴性,与预期结果一致。【结论】PCR检测方法可以快速准确地对牛病毒性腹泻-黏膜病作出诊断。该方法的敏感性可高达10-1TCID50。     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因克隆及序列分析

【目的】对牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因进行克隆及序列分析，为阐明本病致病机理，更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据。【方法】以牛病毒性腹泻病毒河北分离株（HB-DCZ）基因组RNA为模板，扩增BVDV HB-DCZ株基因组NS2-3片段cDNA。将PCR产物克隆后进行PCR及双酶切鉴定。克隆产物进行序列测定及分析。【结果】HB-DCZ cDNA体外扩增获得特异性条带，大小约为665bp，表明该分离毒株基因组中无插入序列。PCR产物克隆，提取重组质粒，扩增获得特异性的DNA条带，长度约为665bp，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，获得两条DNA片段，长度分别为2600bp和702bp左右，与理论值相符。序列测定结果表明，克隆得到的NS2-3重要区扩增片段共665核苷酸，NS2-3重要区的蛋白质由208个氨基酸残基组成。HB-DCZ毒株NS2-3重要区核苷酸序列与已公开发表的BVDV其他毒株相比的同源性依次为184株99.1%，ZM195株97.4%，Osloss株92.3%，C24V株77%，NADL株76.4%。HB-DCZ在NS2-3扩增区域中既没有外源序列的插入，也没有基因重组、重排或缺失，但存在某些核苷酸的替换。【结论】HB-DCZ与Osloss株、国内的184株、ZM195株遗传距离较近，与C24V株、NADL株遗传距离较远。HB-DCZ株应为BVDV Ib基因亚型。     

BVDV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法与RT-PCR方法的建立与应用

利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过对RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出250 bp的特异性片段,对牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腺病毒、呼肠孤病毒的扩增结果均为阴性,对BVDV C24V株、GSTZ株、Av69株、S183株和BVDVⅡ型扩增结果为阳性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,RT-PCR的灵敏性为10-1TCID_(50)/mL,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的灵敏性为3.4×102copies/μL。应用2种方法对临床血清样本进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的流行病学监测、实验室检测以及诊断。     

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒地方株的分离及RT-PCR鉴定

自疑似牛病毒性腹泻-粘膜病的流产奶牛粪便及血液中分离得到一株不产生细胞病变的病毒，经双抗体夹心ELISA检测及RT-PCR扩增进一步证实该病毒为牛病毒性腹泻-粘膜病病毒。     

鸡肾型传染性支气管炎山西地方株的生物学特性研究

通过ＳＰＦ鸡胚接种,盲目传代的方法从山西省１５个养鸡集中采集有典型肾炎病变的病鸡气管,肾脏病料,分离并鉴定出９株鸡肾型传支野毒株。从分离株的致病性、细胞培养特性,血凝活性、理化特性、免疫原性、毒力测定、遗传性能等方面对９株分离毒的生物学系统作了详细的系统分析。     

猪圆环病毒河南株的分离鉴定

【研究目的】为了研究猪圆环病毒的分子生物学特征及其发病机理和致病机制,【研究方法】将疑似猪圆环病毒2型的猪脾脏、淋巴结用胰蛋白酶消化处理后接种PK-15细胞,盲传6代后,病毒已经适应PK-15细胞,【研究结果】然后设计一对特异性引物利用PCR技术扩增出ORF2片段中540 bp的基因。第6代细胞病毒液经间接免疫荧光检测表明,在荧光显微镜下可见PCV特征的荧光斑,表明毒株具有感染性。【结论】将病毒纯化后进行电镜观察,病毒粒子直径约17nm,圆形,无囊膜,研究结果表明分离的病毒为猪圆环病毒。     

河南部分地区H9亚型禽流感病毒的分离鉴定及交叉免疫攻毒保护试验

为了分离鉴定河南漯河、郑州H9亚型禽流感病毒及交叉免疫攻毒保护试验。于2011年用SPF鸡胚从河南漯河、郑州疑似感染H9亚型禽流感病毒的病料中分离出2株病毒,通过血凝及血凝抑制试验和RT-PCR方法进行鉴定,确定为AIV H9亚型;用河南省动物性食品安全重点实验室于2001年分离的2株H9亚型禽流感病毒分别制成油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,然后再用上述4株病毒对免疫鸡群进行交叉攻毒,进行交叉免疫保护试验,测定其交叉免疫保护作用。结果表明：成功分离出2株H9亚型禽流感病毒;用2001年分离毒株所制备出的灭活疫苗免疫鸡后,试验鸡体内抗H9亚型禽流感HI抗体效价均明显上升,平均HI效价均大于11log2,不同毒株所诱导产生的HI抗体效价存在一定的差异;不同时期及地点分离的H9亚型禽流感流行毒株间均产生了较好的交叉保护,且同一地区的保护率更高,2001年的分离株对目前的流行毒株仍有很好的保护作用。     

H1N1亚型猪流感病毒分离鉴定

用SPF鸡胚从2005-2006年采集自天津地区猪群样品中分离出3株猪流感病毒,测定了分离病毒的部分理化特性和生物学特性.3个猪流感病毒分离株均能凝集1%鸡红血球,将其制成琼脂扩散抗原与猪流感标准阳性血清反应均出现清晰白色沉淀线;经中国动物卫生与流行病学中心系统鉴定,3个毒株均为H1N1亚型,分别命名为A/Swine/...     

鸡传染性法氏囊病病毒的分离鉴定与培养特性研究

为研究鸡传染性法氏囊病病毒在不同宿主上的培养特性,从河南省某疑似感染鸡传染性法氏囊病病毒的鸡场采集病料,通过琼脂免疫扩散试验初步筛选出IBDV毒株,并将毒株回归易感鸡,在SPF鸡胚及DF1细胞上培养。结果显示：培养出的病毒作为抗原与标准阳性血清之间均出现阳性沉淀线;回归SPF鸡试验显示发病率达100%,死亡达60%,病死鸡只出现法氏囊肿大、出血甚至出现紫葡萄样;该毒株能引起鸡胚CAM增厚、胚体出血,引起DF1细胞变圆脱落;ELD50与TCID50分别为10-4.6/0.1 mL、10-5.5/0.1 mL。试验证实IBDV分离株,属于超强毒株,该毒株可以在鸡胚和DF1细胞上适应增殖,将其命名为HN12号分离株。     

温度对黄粉虫生物学特性的影响

【研究目的】黄粉虫为江苏吴江地区蔺草制品的主要仓储害虫之一,对其生物学特性研究为有效控制其危害具有重要意义。【方法】笔者采用有效积温法研究不同温度下黄粉虫的发育历期、发育速率、发育起点温度、有效积温。【结果】结果表明,温度对黄粉虫的影响为温度升高,各发育历期缩短,发育速率加快。蛹期发育起点温度最高,为11.8816℃,而卵期的发育起点温度最低,为8.0021℃。幼虫期有效积温最高,为67.6078℃?d。在24℃下,完成一个世代需要的时间为47.02天,而在28℃下,完成一个世代需要38.01天。【结论】因此,可以辅助利用低温或者高温处理蔺草制品控制黄粉虫的为害。     

猪瘟胶体金免疫层析快速诊断法的建立及应用

笔者运用胶体金免疫层析技术,建立一种操作简单、灵敏度高、特异性好,能区分强弱毒感染,适合临床诊断的检测猪瘟病毒的方法。本试验利用大肠杆菌表达猪瘟病毒E2蛋白作为弱毒抗原,利用PK15细胞培养纯化后的猪瘟病毒强毒用作强毒抗原,研制了胶体金免疫层析猪瘟病毒抗体检测试纸条。结果显示,经过37℃破坏,该试验方法制备的试纸条仍具有很好的稳定性;与间接血凝法、美国IDEXX酶免试剂比较,发现该试纸条灵敏度在一定程度上优于前者;用多种病毒、病原菌阳性血清考核,显示该试纸条亦具有较高特异性。该试纸条的研制为猪瘟的快速诊断提供了一种更加实用的方法。     

甘薯病毒病防控措施研究进展与展望

甘薯病毒病是甘薯生产中面临的严重威胁,对我国甘薯产业的发展具有极大的危害。目前,生产上常用的防控甘薯病毒病的措施有切断病毒传染源、杀灭病毒传播的生物介质、脱毒甘薯的培养及应用、抗病毒制剂的使用、抗病毒育种、弱毒株系交叉保护等。综述了甘薯病毒病的防控措施、抗病虫农药的发展、抗病毒新品种的培育,及其应用前景。     

Identification of Pathogenicity Defective Mutants from a T-DNA Insertion Mutant Library of Verticillium dahliae

[Objective] Our research aimed to identify pathogenicity defective mutants from a T-DNA insertion mutant library of Verticillium dahliae strain Vd991 and to analyze pathogenicity-related genes. [Method] In total, 294 T-DNA insertion mutants of V. dahliae were tested for their virulence using a cotton infection assay. Southern blot assays were performed to identify the T-DNA insertion copy number of each pathogenicity defective mutant. DNA sequences flanking the T-DNA insertional sites of each mutant were analyzed by high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR. [Result] Based on the virulence assay, the disease indices of cotton plants inoculated with each mutant decreased very significantly in comparison with the index of those inoculated with Vd991. The Southern blot assay revealed that only one mutant contained two T-DNA insertions, while the remaining eight mutants harbored a single T-DNA insert. An analysis of biological characteristics found that the growth and conidial production of these mutants were impaired by the T-DNA insertions compared with the wild type Vd991. The T-DNAs' insertion position and distribution in each mutant were identified by comparison with genome sequences of strain VdLs.17. Furthermore, the pathogenicity-related genes were cloned from strain Vd991. [Conclusion] The screening and identification of T-DNA insertion mutants is an effective method to identify the pathogenicity-related genes of V. dahliae on a genome-wide scale. This laid a foundation for the further breeding of disease-resistant cotton varieties and will promote the study of the pathogenic molecular mechanisms of V. dahliae.     

2株放线菌的抗菌活性及分类学地位

旨在对2株放线菌HD-103和HD-109的抗菌活性和发酵液稳定性进行比较分析,并明确2株菌的分类学地位。以13种植物病原真菌为靶标菌,利用琼脂柱法分析2株生防菌的抗菌谱;以尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.glycines)为指示菌,利用杯碟法检测2株生防菌发酵液的热稳定性、pH稳定性及紫外稳定性,并进行比较分析;在此基础上采用多相分类法对2株菌进行鉴定。研究结果显示：2株菌的抗真菌谱均较广,其中HD-103对禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearumf.sp.Glycines)的抑制效果最显著,抑菌圈直径达到23.7mm,HD-109对烟草赤星病菌(Alternariaalternate)抑制效果最好,抑菌圈直径达25.0mm;HD-103的抗菌活性物质较HD-109的活性物质更为稳定;分类学鉴定结果表明,菌株HD-103与HD-109为微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)的2个菌株。菌株HD-103与HD-109能够抑制多种植物病原真菌,其发酵液具有较好的热稳定性和酸碱稳定性,具有开发为新型生物农药的潜力。     

鹿蹄草内生真菌生物学特性研究

内生真菌对鹿蹄草的生长、抗逆等具有重要意义。笔者对1株鹿蹄草内生真菌R25（Nectria sp.）的生物学特性进行报道,旨在为该菌株在鹿蹄草等园林绿化植物引种驯化中的应用提供依据。研究发现：R25在培养的1～2天生长缓慢,3～10天生长迅速,11天后生长趋于稳定。该菌的适宜生长温度为10～25℃,最适生长温度为20℃;在pH 4.0～8.0之间均能生长,最适生长pH为5.0～6.0;在各光照条件下均能生长,但黑暗对生长更有利;该菌株能利用多种碳、氮源,其中最适碳、氮源分别为葡萄糖、硝酸钾,且在OMA培养基中产孢能力最强。     

1株野生茶树菇的鉴定及其母种培养条件研究

为更好地开发利用茶树菇,同时丰富国内茶树菇种质资源,以采自贵州的1 株野生茶树菇NC1 菌株为材料,对其进行内转录间隔区ITS(internal transcribed spacer)鉴定和母种培养条件研究,包括对菌丝生长的最适碳源、氮源、C/N 比、最适温度、最适pH 等。结果表明：该菌株为柱状田头菇(Agrocybe aegerita),其菌丝生长的最适碳源为玉米淀粉,其次为葡萄糖或果糖,最适氮源为酵母粉,其次为蛋白胨,最适C/N 比为30/1~40/1,最适温度为29℃,最适pH 5.0~6.0。研究结果可为野生茶树菇NC1 菌株进一步驯化栽培和开发利用提供参考。     

动物饲用益生菌LPF-2对大肠杆菌抑制作用的培养条件优化

[研究目的]对畜禽大肠杆菌具有抑制作用的动物饲用益生菌短短芽孢杆菌LPF-2的培养条件进行优化.[方法]以抑菌圈为指标,从时间、温度、摇床转速和培养基pH值研究短短芽孢杆菌LPF-2的最适培养条件,以获得短短芽孢杆菌LPF-2最佳的抑菌效果.[结果]短短芽孢杆菌LPF-2培养24～84h的抑菌圈为10.00～13.00 mm,在24～39℃下培养的抑菌圈为9.00～14.00 mm,转速在90～210 r/min下培养的抑菌圈为13.75～15.00 mm,pH 6.0～8.0下培养的抑菌圈为10.50～14.50 mm.[结论]动物益生菌短短芽孢杆菌LPF-2的最适培养条件为培养基pH 7.5、培养温度30℃、培养时间48 h,摇床转速在90～210 r/min范围内均可.