大豆铁结合蛋白基因在旱稻中的表达及铁含量分析

【目的】尝试利用转基因方法提高旱稻铁含量。【方法】采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良旱稻品种“旱稻297”和“旱稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株T0～T3代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。     

大豆铁结合蛋白基因在早稻中的表达及铁含量分析

【目的]尝试利用转基因方法提高早稻铁含量。【方法]采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良早稻品种“旱稻297”和“早稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株R～T。代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。     

抗虫基因Cry1C转化大豆的研究

[目的]将对鳞翅目害虫具有抗性的抗虫基因Cry1C转入大豆中,获得对田间鳞翅目害虫具有抗性的大豆材料.[方法]利用农杆菌介导法将抗虫基因CrylC转入大豆品种Williams82中,并通过Bar试纸条及PCR方法对所获得的转化苗进行鉴定.[结果]获得28株阳性大豆转化植株.[结论]初步认定CryIC基因已整合到大豆基因组中.     

用农杆菌介导法将大豆球蛋白基因导入水稻

在克隆水稻谷蛋白基因Gt1启动子的基础上,以农杆菌双元载体pCAMBIA1301为起点,构建出以该启动子带动大豆球蛋白A1aB1b亚基基因表达的双元载体,并用农杆菌介导法转化水稻获得转基因植株.经PCR检测和后代分析,大豆球蛋白基因已整合入水稻基因组,并在后代中稳定遗传.     

超级稻DAD1基因正反义植物表达载体的构建及转化菊花的研究

将水稻DAD1基因插入Ti质粒,构建成该基因的正反义植物表达载体pWM-DAD1,pWM-antisense DAD1,转入根癌农杆菌LBA4404后,利用农杆菌介导的叶盘法转化菊花,经Hyg抗性筛选,并诱导愈伤组织和分化成苗,得到转基因菊花植株,通过PCR检测,从部分转基因植株中检测出预期的目的基因的存在.     

一种利用花粉管结合农杆菌介导方法将iaaM基因导入玉米自交系的研究

[目的]利用花粉管结合农杆菌介导方法将iaaM基因导入玉米自交系。[方法]利用电击转化法将iaaM基因的表达载体转入农杆菌LBA4404菌株中,通过花粉管通道法将验证正确的菌株直接转化京24玉米自交系,最后通过除草剂筛选及PCR检测得到阳性植株。[结果]试验共得到12株抗性植株,其中10株为阳性植株。[结论]该研究成功建立了一种无需组织培养体系,直接利用花粉管通道进行农杆菌介导的玉米转化方法。     

水稻蜡质合成相关基因 OsCER4 自身启动子驱动的反义RNA转化植株获得

水稻OsCER4基因编码脂肪醛脱羧酶,与拟南芥CER1基因高度同源,是否参与植物表面蜡质合成尚不清楚,为了探讨其功能,扩增了OsCER4基因起始密码子ATG上游约2 kb的序列作为该基因的启动子,以常规技术将启动子和OsCER4基因反义片段克隆到pCAMBIA双元载体1380中,采用农杆菌介导法转化粳稻品种中花11,并进行了转化苗OsCER4蛋白的表达量变化分析.结果表明,成功构建了由OsCER4自身启动子驱动的反义RNA载体,并通过农杆菌介导法成功转入水稻中花11中,多数OsCER4基因反义转化植株为阳性转化植株,后代分离比符合3∶1,反义RNA转化植株在蛋白水平上的表达量下降.     

植物人工启动子研究进展

以矮牵牛无菌苗叶片作为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系。通过农杆菌介导法将水稻反义类黄酮3''-羟化酶基因（F3''H）转入矮牵牛中,抗性植株经PCR 检测均为阳性植株,初步表明反义F3''H 基因已整合到矮牵牛基因组中;对阳性植株进行半定量RT-PCR 检测,与非转基因植株相比,阳性植株中F3''H 基因的表达减弱,表明导入的反义F3''H 基因抑制了内源基因的表达。     

根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系的研究

采用根癌农杆菌介导法将苏云金氏芽孢杆菌毒蛋白B.t基因cryIA转入甘蔗胚性愈伤组织中,建立农杆菌转化甘蔗的遗传转化体系,获得13棵再生植株。经GUS及PCR检测,cryIA确实已转移到甘蔗幼苗中,GUS在再生植株中也得到瞬时表达。     

根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系的研究

采用根癌农杆菌介导法将苏云金氏芽孢杆菌毒蛋白B.t基因cryIA转入甘蔗胚性愈伤组织中,建立农杆菌转化甘蔗的遗传转化体系,获得13棵再生植株。经GUS及PCR检测,cryIA确实已转移到甘蔗幼苗中,GUS在再生植株中也得到瞬时表达。     

转铁蛋白基因水稻抗Fe2+能力分析

[目的]研究转铁蛋白基因水稻对Fe2+胁迫的生理响应。[方法]采用溶液培养法,对参试水稻进行Fe2+胁迫(200 mg/L)处理,测定其株高、生物量、Fv/Fm及质膜伤害。[结果]Fe2+胁迫下,参试水稻生长受到明显抑制,株高和生物量下降,Fv/Fm下降,MDA含量和电解质渗漏增加。与非转基因对照相比,转铁蛋白植株各测定参数受Fe2+胁迫影响较小,差异显著(P0.05)。[结论]水稻中铁蛋白的表达可降低过量Fe2+对植株光合作用的影响和对叶片质膜的损伤,从而减轻Fe2+胁迫对植株生长的抑制作用,提高了植物抗铁毒的能力。     

外源铁蛋白基因NtFerl对粳稻生理影响的研究

[目的]验证铁蛋白基因的功能,提高转基因粳稻的含铁量和转基因粳稻对盐胁迫和生物胁迫的抗性。[方法]利用农杆菌介导法将烟草铁蛋白基因mnrl导入粳稻基因组。[结果]对T0、T1代卡那霉素抗性植株PCR、Southern杂交、Northern杂交和RT—PCR检测分析表明,外源基因已整合到粳稻基因组中,并能够稳定遗传表达。转基因粳稻超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性和叶绿素相对含量高于对照,丙二醛（MDA）含量低于对照,其根、叶片和糙米中铁含量均高于对照。接种稻瘟病病菌后转基因植株叶瘟指数低于对照。[结论]转入外源铁蛋白基因NtFerl能够提高粳稻的含铁量和转基因粳稻对盐胁迫和生物胁迫的抗性。     

过量表达OsAPX1基因增强水稻的抗热和抗氧化能力

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)是植物体内活性氧清除的关键酶,在植物逆境应答中发挥着重要作用。通过构建水稻OsAPX1基因的过表达植物载体,利用根癌农杆菌介导法导入水稻品种日本晴获得转基因植株。半定量RT-PCR分析表明,转基因植株中OsAPX1表达水平明显提高。田间T0代过表达转基因植株在高温条件下的秕谷率显著低于野生型。热激胁迫实验显示,转基因株系比野生型具有更强的耐热性。在过氧化氢胁迫下,转基因植株也表现出更强的抗氧化能力。该结果表明水稻OsAPX1基因在活性氧清除中发挥功能,过量表达OsAPX1能够增强水稻的高温抗性。     

Agrobacterium-mediated Transformation of Rice (Oryza sativa L.) with Atrazine Chlorohydrolase Gene (atzA)

Atrazine chlorohydrolase gene (atzA) was cloned from Arthrobacter sp. AD1. A plant expression plasmid was constructed under the control of CaMV35s promoter and was used in rice transformation. The target gene was successfully introduced into mature embryos of a japonica rice cultivar Jindao 107 by Agrobacterium- mediated transformation and hundreds of transgenic plants were obtained. The exogenous atzA gene in the transgenic plants that expressed atrazine resistance was confirmed by Southern blot hybridization. The resistance experiments by spraying transgenic rice plants with 0.133% atrazine shown that most of the transgenic rice plants exhibited the resistance to herbicide atrazine. The segregation of exogenous atzA gene in T1 progeny corresponded to the Mendelian ratio.     

反义Wx基因导入我国常规籼稻品种的研究

经农杆菌介导，将自行克隆并构建的反义Wx基因导入4个高直链淀粉含量的常规籼稻品种绿黄占、清芦占11号、三芦占7号和特青中，经潮霉素抗性筛选获得抗性植株。聚合酶链反应(PCR)和Southern杂交检测证明反义Wx基因已整合进转基因水稻植株的基因组中。对成熟种子直链淀粉含量的分析表明，部分转基因水稻植株T1或T2代种子中的直链淀粉含量有不同程度的下降，最低的已降至16．52％，较对照下降了40．5％；在此基础上筛选获得了部分转基因纯合株系。研究结果还表明，盲链淀粉含量的改变会导致相应稻米的胶稠度和糊化温度的变化。     

农杆菌介导的细菌阿特拉津氯水解酶基因对水稻的遗传转化

 研究构建了植物表达载体p1301-atzA,使来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)AD1菌株的阿特拉津氯水解酶基因atzA受控于CaMV35s启动子下表达。用农杆菌介导法将植物表达载体p1301-atzA导入粳型保持系津稻107中,经潮霉素抗性筛选,得到可育的再生植株。转基因植株总DNA经PCR和Southern检测表明atzA基因已整合到水稻的基因组中。对转基因植株进行除草剂阿特拉津抗性检测,在喷施浓度为0.133％的阿特拉津溶液后,对照植株和敏感植株死亡,而转基因植株表现出对阿特拉津的抗性,     

铁蛋白超表达增强水稻的铁胁迫耐受性研究

采用溶液培养法,对铁蛋白(ferritin)超表达水稻植株进行过量Fe2+(150mg/kg,250mg/kg)胁迫处理,测定其苗高、生物量、叶绿素含量及质膜透性。结果表明,铁胁迫条件下,供试植株生长受到明显抑制,苗高和生物量下降、叶绿素含量减少、质膜透性增加。胁迫组中,转基因植株苗高下降21%,地上部和根系干重分别下降41%和11%,叶绿素含量下降21%,质膜透性增加50%;非转基因植株苗高下降41%,地上部和根系干重分别下降65%和70%,叶绿素含量下降60%,质膜透性增加99%。相比之下,转铁蛋白植株生长受铁胁迫影响较小,其苗高、生物量、叶绿素含量、质膜透性变化幅度均比对照小。由此可见,铁蛋白超表达减轻了过量Fe2+对植株叶绿素含量的影响和对叶片质膜的损伤,从而缓解了铁胁迫对植株生长的抑制作用,增强了水稻植株的铁胁迫耐受性。     

水稻脂氧合酶-3基因启动子的特性分析

从栽培水稻品种越光中克隆了水稻脂氧合酶-3基因(Lox-3)的启动子,长度为1343bp,其序列与日本晴对应的序列完全相同。生物信息学分析表明,该启动子序列中包含受信号诱导的元件(G-box)、温度响应元件(CCGAAA)和水分胁迫响应元件(CACATG)等顺式作用元件;进一步构建了Lox-3基因启动子与gus和gfp基因的融合表达载体并获得转基因植株,发现报告基因在转基因植株的根、茎、叶、花药、种胚及种皮中均有表达,在萌发种子的胚和胚芽中也有表达,但在胚乳中不表达。此外,经ABA、NaCl及人工陈化处理后对报告基因的表达进行了定量分析,发现这些非生物胁迫可能通过诱导启动子顺式元件致使报告基因表达活性增强。     

花粉管介导的转抗冻蛋白基因(AFP)水稻

低温和冷害在世界范围内广泛发生,对水稻的产量和品质造成严重影响。创造和培育具有强耐低温特性的水稻品种,对提高水稻产量具有重要的意义。本研究将从胡萝卜中克隆的抗冻蛋白基因(AFP)构建到植物表达载体pB I121(pB I121∶AFP)后,利用花粉管通道法将其转入籼稻品种NR158,获得了转基因后代。对T3代和T4代转基因植株的苗期耐冷性鉴定和PCR鉴定结果表明,部分转基因植株后代已经整合并且AFP基因得到了表达,获得了不同程度的耐低温性。     

转hrfAXoo基因水稻对白叶枯病的抗性

将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv．oryzae)编码harpinxoo的hrfAxoo基因连接到双元载体pBI121上，构建成含hrfAxoo基因的植物表达质粒pBMH9。以粳稻R109成熟胚诱导愈伤组织，由根癌农杆菌EHA105介导，将含有hrfAxoo基因的重组质粒pBMH9转化水稻愈伤组织。用G-418抗生素做抗性筛选，产生抗性愈伤组织的频率为85％，转化植株的再生频率为53％。根据hrfAxoo基因两端序列和pBMH9中外源片断的旁侧序列设计2对引物，通过PCR扩增验证转化水稻中的靶基因序列。对部分转基因水稻进行RT—PCR和Northern blot分析，结果显示hrfAxoo基因在转基因水稻中能正常表达。抗病性鉴定结果表明，转基因水稻在，ID、T1和T2代对水稻白叶枯病有较好的抗性；在转基因系中水稻白叶枯病菌的生长明显受到抑制。因此，本研究获得对水稻白叶枯病抗性提高的转基因水稻。