牛分枝杆菌MPB64基因的克隆及序列分析

以牛分枝杆菌ValleeⅢ染色体DNA为模板,以MPB64成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得了642 bp的DNA片段。通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体。经鉴定证实,成功地构建了pGEM-T-64克隆载体。序列分析结果表明:该基因序列与Mycobacterium bovis BCG Tokyo的MPB64成熟蛋白基因序列同源性为100%。     

牛结核杆菌mpb-83基因的扩增和表达

采用PCR方法扩增牛结核杆菌mpb-83基因,并将其连接到T3克隆载体,然后克隆到原核表达载体PET-32a中,构建重组质粒PET-32a—mpb-83。以重组质粒转化大肠杆菌BL21,用NI柱纯化,最后纯化产物在SDS—PAGE中检测。结果得到约664bp的目的片段,且MPB-83可在大肠杆菌BL21中高效表达。     

牛分枝杆菌ag85b-esat-6融合基因的克隆表达

利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、esat-6基因和ag85b-esat-6融合基因,克隆到真核载体pcDNA3.1( )上,构建重组质粒pCAE,将该重组质粒体外转染小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0细胞),间接免疫荧光试验检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功构建了真核表达质粒pCAE,转染后的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明ag85b-esat-6融合基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达,为进一步研制牛结核病DNA疫苗奠定了基础.     

蚯蚓MT基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了研究蚯蚓金属硫蛋白的生物学功能,采用RT-PCR方法从镉诱导后的赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)中克隆到蚯蚓金属硫蛋白基因cDNA。将其克隆入原核表达载体pET-DsbA中,然后转化至大肠杆菌表达受体菌BL21(DE3)中进行表达。产物经SDS-PAGE进行分析,可见约32.4 kD的融合蛋白。Zn2+抗性测定表明含pET-DsbA-efMT的重组菌较含空载体pET-DsbA的对照菌重金属抗性有所提高。     

牛分枝杆菌ag85b基因的瞬时表达

[目的]为牛结核病DNA疫苗的研制提供参考。[方法]利用PCR技术扩增出牛分枝杆菌ag85b基因片段,克隆到真核载体pcD-NA3.1(+)上,构建重组质粒pcAg85B,将重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验检测该基因的表达情况。[结果]结果表明:在转染了重组质粒pcAg85B的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明ag85b基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达。[结论]为研究牛分枝杆菌ag85b DNA疫苗奠定了基础。     

牛分枝杆菌广西分离株CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的克隆与序列分析

根据GenBank上牛分枝杆菌（M.bovis）CFP-10、ESAT-6、MPB70的基因序列,设计并合成了3对扩增CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的特异性引物,扩增片段大小分别是321、306、582bp。对牛分枝杆菌广西分离株MBT359进行以上3个基因的克隆、序列测定及分析,结果显示,可以从广西分离株MBT359扩增出大小与预期相符的基因片段,经测序证实,扩增出的片段即为3个目的基因片段。序列分析表明,广西分离株MBT359的CFP-10、ESAT-6、MPB70基因片段与国际标准强毒株AF2122/97相应基因核苷酸同源性为100％。该研究结果为广西牛分枝杆菌流行株主要基因测序、建立广西牛结核病流行株遗传多态性数据库奠定了基础。     

牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu/67株gD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从感染牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu／67株的MDBK细胞中扩增gD基因，将之克隆到pGEM-T Easy载体。根据对gD基因的结构分析，设计合成3对引物，以获得的克隆质粒为模板，PCR扩增gD胞外域基因，将之分别亚克隆到pGEX-4T-2和pET-32a表达载体中构建成表达质粒pGEX-4T—gDQ、pGEX-4T—gDQB、pGEX-4T—gDHB和pET—gDQ、pET—gDQB、pET—gDHB，利用上述质粒分别转化大肠杆菌BL21和BL21（DE3），IPTG诱导后SDS—PAGE检测，结果pGEX-4T—gDQ、pGEX-4T—gDQB、pGEX-4T—gDHB和pET—gDQ四个表达质粒出现表达且符合预期大小，Western blot表明表达产物均有抗原性。     

鸡γ干扰素基因的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank已发表的鸡γ干扰素cDNA基因序列设计一对引物,以血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆出鸡γ干扰素基因,把它与融合表达载体pET32a相重组。通过对阳性宿主菌的不同时间的诱导摸索出最佳表达时间。     

牛分枝杆菌RecA基因的克隆与序列分析

以牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)Valleelll株染色体DNA为模板,以RecA基因特异性引物进行PCR扩增,获得约240 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMDTM18-T Vector中,通过α-互补法筛选、质粒PCR鉴定及序列分析鉴定,成功构建出了重组质粒pMDTM18-T-RecA,为进一步研究RecA基因及其在牛结核病诊断中的应用奠定了基础.     

cry基因保守序列克隆及其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达

[目的]对cry基因保守序列进行克隆,并使其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。[方法]根据NCBI数据库信息设计引物序列,采用PCR技术从抗虫棉基因组DNA中扩增出抗虫基因cry的保守序列,构建重组载体并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中,利用pGEX原核表达系统诱导蛋白表达。同时,分析了不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响。[结果]扩增出抗虫基因cry的两段保守序列,长度分别为304和853 bp;SDS-PAGE检测结果显示,经IPTG诱导后重组质粒pGEX-4t-1-304和pGEX-4t-1-853成功地表达了大量GST融合蛋白,分子量分别为39和62.4 kDa,与预期结果一致;确定了IPTG最佳诱导浓度为0.15 mmol/L,最佳诱导时间为7h。[结论]为今后检测转Bt基因农作物奠定了基础。     

Cloning and expression of Mycobacterium bovis secreted protein MPB51 in Escherichia coli

The purpose of this study is to clone, identify, and express the mature secreted protein MPB51 from Mycobacterium bovis and to lay a good foundation for the diagnosis of M. bovis, for applying M. bovis vaccine into clinical practice, and for detection of immunity effectiveness. The gene encoding MPB51 was amplified from M. bovis Vallee111 chromosomal DNA by using PCR technique, PCR product was approximately 800 bp DNA segment. Clone vector pGEM-T-51 was successfully constructed by the PCR product that was cloned into pGEM-T vector by using T-A clone technique. pGEM-T-51 and pET28a(+) were digested by BamH I and EcoR I double enzymes. The prokaryotic expression vector pET28a-51 was constructed by using the purified MPB51 gene that was subcloned into the expression vector pET28a(+). Plasmid containing pET28a-51 was transformed into competence E. coli BL21 (DE3). The bacterium was induced by IPTG and its lysates were loaded directly onto SDS-PAGE. An approximately 30 kDa exogenous protein was observed on the SDS-PAGE. The protein was analyzed by using Western-blotting and it had the antigenic activity of M. bovis. These results could serve as a basis for further studies on the usefulness of the gene and its expression product in the development of subunit vaccine and DNA vaccine against bovine tuberculosis. __________ Translated from Acta Microbiologica Sinica, 2005, 45(2): 298–300 [译自: 微生物学报]     

牛结核分支杆菌MB1916c基因的克隆和原核表达

构建牛结核分支杆菌MB1916 c的原核表达载体,获得了高纯度的融和表达蛋白。以牛结核分支杆菌DNA为模板,利用PCR方法扩增出牛结核分支杆菌MB1916 c基因片段,将回收纯化后的产物克隆到pGEM-T载体,测序分析鉴定为阳性的质粒,经SacⅠ/KpnⅠ双酶切后与同样条件下双酶切后的pET-30a( )载体连接,再转化到E.coliBL21(DE3)表达菌株中,经菌落PCR快速筛选克隆,以SacⅠ/KpnⅠ双酶切和测序分析鉴定。确定正确的阳性菌株IPTG诱导后,收集菌体进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果显示:以牛结核分支杆菌DNA为模板,PCR后得到了MB1916 c目的基因片段,经克隆、亚克隆、序列分析和SacⅠ/KpnⅠ双酶切鉴定,获得了牛结核分支杆菌MB1916 c原核表达菌株,IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见约26 ku蛋白表达条带,West-ern-blotting分析证实所获得的蛋白具有牛结核分支杆菌的抗原性。本实验构建了pET-30a( )-MB1916 c原核表达载体,得到融合6个组氨酸残基的MB1916c蛋白纯度大于95%,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

油菜乙酰羟基酸合酶基因BnAHAS1的克隆及其重组蛋白质的原核表达

利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜宁油16号(Brassica napus L.)中克隆到乙酰羟基酸合酶基因BnAHAS1的cDNA序列,该序列含有1个1 968 bp的开放阅读框,编码蛋白质655个氨基酸,分子量约为7.1×104,预测等电点为6.16。将该基因克隆到原核表达载体pCold II中,经酶切和测序鉴定后,将正确的重组质粒pCold IIBnAHAS1导入大肠杆菌BL21(DE3)。在15℃下以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导12 h后,获得预期大小的重组蛋白质His-BnAHAS1,并用Western blot确定此重组蛋白质为目的蛋白质。     

牛白细胞介素15基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBankTM中发表的牛IL-15基因序列设计并合成了特异性引物,以经LPS和ConA刺激的牛外周血单个核细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度约500 bp的目的基因片段,并将该基因克隆到pMD18-T载体上.酶切、PCR及序列测定结果表明,获得了牛IL-15全长基因的克隆.进一步通过PCR方法得到缺失其N端48个氨基酸的信号肽序列的牛IL-15成熟蛋白基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a上,构建重组表达质粒pET-IL-15,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,该菌表达以包涵体形式存在的相对分子质量约为33 000的融合蛋白.用Ni螯合层析方法纯化表达的蛋白.Western-blot试验显示表达的重组融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应,同时也能与鼠抗猪IL-15的多克隆抗体发生明显交叉反应.     

牛型布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的克隆与原核表达

根据GenBank中登录的牛型布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因序列,设计了1对引物,采用PCR技术,牛流产病例分泌物为模板,扩增bp26的编码基因,得到1条753 bp的片段.将其连入Simple-T载体中进行酶切和测序鉴定.测序正确后,将该基因插入到pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,将此重组质粒转化到Roset...