禽副粘病毒I型引起鹅副粘病毒病的诊断

用鹅胚和鸡胚从山东、安徽两地患病鹅群的病鹅肝、脾中分离到2株病毒,代号分别为SD20和AH20。经电镜观察、血凝试验和血凝抑制试验、理化特性鉴定等试验表明,2株分离毒符合禽副粘病毒I型特征,单克隆抗体介导的间接ELISA检测结果表明,SD20和AH20分离株都能与禽副粘病毒I型单克隆抗体发生反应。     

鹅Ⅰ型禽副粘病毒融合蛋白基因3‘端cDNA片段的分子克隆

参考禽副粘病毒的融合蛋白基因（Ｆ基因）ｃＤＮＡ序列，设计并合成了１对引物，以他离到对鹅有致病力的Ⅰ型禽副粘病毒ＧＰＭＶ／ＱＹ９７－１株的核酸（ＲＮＡ）为模板，用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）对其融合蛋白基因３＇端进行扩增，获得了预计的８８４ｂｐ左右的片段。将该片段克隆进ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ质粒载体，获得重组质料Ｔ－ＧＰＭＶＦ３＇，采用限制性内切酶和ＰＣＲ方法对该重组质粒进行鉴定，证明所克隆的     

鹅副粘病毒感染的研究

１９９７年以来,在江苏省苏南、苏北许多县、市的鹅群中发生一种具有高度发病率和死亡率的鹅病,已造成一定损失,威胁着养鹅业的健康发展。经流行病学调查,各种年龄鹅均具有易感性,年龄越小发病率和死亡率越高。这种以消化系统为主要临床症状和病变为特征的鹅病,经病毒分离及主要特性和形态学等方面的研究,已确定本病为副粘病毒所致的鹅的一种新病。为了尽快解决生产上的问题,在研究病原的同时,进行防制手段的研究,已研制出了防制本病的生物制剂。１　流行病学调查１９９７年７月至１９９８年１２月先后调查江都、仪征、邗江、高邮…     

鹅副粘病毒感染鸡试验

本室分离的鹅副粘病毒是一侏对鹅具有料强致病毒，它也能实验感染雏鸡，且雏鸡感染后发病率均为１００％，死亡率５０％以上。人工感染的鸡其症状和病理变化均与鹅自然发病的病变相类似。从感染途径看，注射接触（混养）均能感染发病，并且在感染发病及死亡时间上也与鹅感染情况相似，因此该病毒感染鹅同时又能实验感染雏鸡，而且传播之迅速，危害之严重必须引起养禽户的重视。     

鹅副粘病毒的分离和鉴定

采集疑似鹅副粘病毒病的鹅病料,通过鸡胚接种传代分离到1株病毒(HZ株).该分离病毒经鸡红细胞凝集(HA)试验、凝集抑制(HI)试验、电镜形态学观察等,结果表明与NDV极为相似,属禽Ⅰ型副粘病毒.经动物回归试验,结果说明分离到的副粘病毒为临床疫病病原,毒力较强,能使15日龄的鹅、鸡、番鸭等禽类感染发病,发病率与死亡率均为100%.     

鹅副粘病毒的人工感染试验

鹅副粘病毒是最新发现的,能引起各种年龄鹅发病的并致死的一种病毒。我们通过ＳＰＦ鸡胚分离的病毒尿囊液第４代,对鹅进行人工感染试验。结果表明,人工感染后,成年鹅群的发病率达到１００％,死亡率达３０％,１５日龄雏鹅感染后发病率和死亡率均达到１００％,这与自然发病鹅群的发病率和死亡率基本相同,而且人工感染后不管成年鹅还是雏鹅其临床病状和病理变化均与自然发病的鹅的病理变化相同,从而证实了该病理分离株的致病性及病原性。     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株ＹＧ９７经１０日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒的基因组ＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出与预期设计的１．７ｋｂ大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入ｐＣＥＭ＾Ｒ载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒Ｆ基因的阳性克隆。将所获得的阳性重组质粒进一步进行了序列鉴定。序列分析表明扩增的Ｆ基因片段的长度为１６９５ｂｐ,共编码５３３个氨基酸,Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸顺序为＾１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｋ－Ｐ－Ｆ＾１１７,与ＮＤＶ强毒株特征相符,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性实验结果相符,同源性分析表明,与国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的核苷酸同源性为８６％,与国内外其它毒株的核苷酸同源性在８２％～８９％之间,表明该毒株相对于经典的ＮＤＶ在Ｆ片段上发生了较大的变异。     

鹅副粘病毒F和HN基因的克隆及原核表达载体的构建

根据发表的鹅副粘病毒SF02株全基因组序列,分别设计合成一对引物和二对引物,分别采用RT-PCR方法和RT-套式PCR扩增出与预期设计大小相符的F基因和HN基因特异性条带.将扩增出的DNA片段克隆到pMD18-T载体中,转化TGI感受态细胞,经AMP/IPTG/X-Gal平板筛选,酶切鉴定,获得阳性重组质粒.对重组质粒进行序列测定,结果表明:鹅副粘病毒JS/1/97/Go株F基因全长1662bp,编码553个氨基酸残基;F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV的强毒株特征相符.HN基因全长1716bp,编码571个氨基酸残基.将F基因插入到原核表达质粒pGEX-6P-1的EcoR Ⅰ、Xho I多克隆位点之间,转化到TGI感受态细胞中,获得了表达F基因的阳性亚克隆重组质粒;将HN堪因插入原核表达质粒pProEX HTb的XBaⅠ、XhoⅠ多克隆位点之间,转化到TGI感受态细胞中,获得了表达HN基因的阳性亚克隆重组质粒.     

鹅副粘病毒F基因的克隆及遗传变异分析

以鹅副粘病毒LN-7-02株基因组RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出F基因片段,并克隆至T载体.经质粒PCR及酶切鉴定后,对阳性克隆进行测序.测序后拼接得到F基因上游539bp核苷酸序列,并推导出ATG后1～374bp氨基酸序列.序列分析表明,LN-7-02株F蛋白裂解位点区的氨基酸组成为112R-R-Q-K-R-F117,与禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-1)强毒株特征相符.将LN-7-02与AMPV-1株CH2000、F48E9和LaSota进行同源性比较,结果LN-7-02与CH2000、F48E9和LaSota的同源性分别为91.8%、86%和84%,表明该毒株相对于经典的AP-MV-1在F基因上已发生了较大变异.根据国内外70株APMV-1的F基因核苷酸序列绘制系统发育进化树,结果疫苗株Lasota属于基因Ⅱ型,经典株F48E9属于我国特有的基因Ⅸ型,而LN-7-02株与鹅副粘病毒JS-9-01、ZJ-100和GD-QY97同属于APMV-1基因Ⅶ型.     

鹅副粘病毒的组织嗜性

用单克隆抗体介导的免疫过氧化物酶（MC－IP）技术，对21只鹅副粘病毒病鹅体内的病毒抗原进行定位，结合组织病理学观察结果，探讨了鹅副粘病毒的组织嗜性。结果显示，除脑和心脏未检测到病毒外，在气管、肺、食道、肝脏、腺胃、胰腺、肠、哈氏腺、胸腺、脾脏、法氏囊、肾脏等器官都能检测到病毒，病毒抗原定位于上述器官的各种上皮细胞，淋巴细胞、网状细胞和巨噬细胞的胞浆内，其中以胃肠粘膜上皮细胞和法氏囊、胸腺、脾脏的淋巴细胞和网状细胞内检出率高，阳性反应强。这些结果提示，鹅副粘病毒是一种泛嗜性病毒，胃肠粘膜上皮和淋巴组织是其主要侵嗜部位。     

鹅副粘病毒毒力特性的研究

新城疫病毒毒力的判定标准是根据国际上规定的三项指标,即最小致死量致病鸡胚平均死亡时间（ＭＤＴ）、１日龄雏鸡脑内接种致病指数（ＩＣＰＩ）和６周龄非免疫雏鸡静脉接种致病指数（ＩＶＰＩ）＾「１」等加以评价。作者从实验室分离到的１１株鹅副粘病毒中选取了其中的３株,即ＨＧ９７Ｃ５、ＹＧ９７Ｆ１１、ＹＧ９８－２Ｃ４,按照新城疫病毒毒力判定的标准方法进行了一系列病性试验,结果３株鹅副粘病毒的ＭＤＴ分别为５６．７、５２．０、５３．２,ＩＣＰＩ分别为１．６４、１．６９、１．７０,ＩＶＰＩ分别为１．６２、２．６、２．６,表明这３株鹅副粘病毒均具有与新城疫病毒速发型相类似的毒力。同时,我们也应用鹅胚和鹅按照研究新城疫病毒毒力的方法进行了相应的毒力试验,结果,这３株鹅副粘病毒最小致死量致死１３日龄鹅胚的平均死亡时间分别为６８．８、６７     

鹅副粘病毒油乳剂灭活疫苗的研制

鹅副粘病毒(Goose’s Paramyxovirus)病是1997年扬州大学王永坤教授等发现的一种新的鹅的烈性传染病,该病使10日龄以内的雏鹅发病率和死亡率均达到100%,平均发病率和死亡率分别为27.7%和18.2%。用含该病毒的鸡胚尿囊液做成水相制出油包水型油乳佐剂灭活疫苗。从该疫苗的免疫结果来看,疫苗在免疫后第7d即可产生抗体(平均为4 1og2),第15 d可达到91og2;从免疫保护试验看,免疫后15 d,用强毒攻击,免疫组全部保护,而对照组.20只鹅全部发病,其中有18只死亡。从区域性中试调查结果来看,该苗安全、有效,能较好地控制该病的发生。     

鹅副粘病毒分离株生物学特性的研究

鹅副粘病毒病是一种新发现的由副粘病毒引起的能引起不同年龄鹅发病、以消化系统损害为主的传染病。本研究对－野毒株（NA－1）应用鸡胚传代、电镜形态学观察、红细胞凝集－红细胞凝集抑制试验、鹅体回归试验、实验免疫保护试验等进行了研究，并进行了三项毒力指标的测定。依据国际上判定新城疫病毒毒力的标准，NA－1毒株均具有与新城疫病毒速发型相似的毒力，属于强毒力的毒株。应用NA－1毒株制备的油乳剂灭活苗实验免疫雏鹅，表明有良好的保护率。     

一株鹅副粘病毒的研究

由鹅体分离到一株病毒，针对该病鹅的主要症状及病理变化初步诊断为鹅副粘病毒病。本文主要通过实验室诊断，包括病毒分离，血清学诊断和致病性试验。最终对该病进行确诊，证明其确实为鹅副粘病毒。     

鹅副粘病毒NP基因的原核表达及表达产物抗原性检测

根据GenBank中发表的GPMVSF02株的NP基因的核苷酸序列设计合成一对引物，通过RT-PCR扩增JS／1／97／Go株的NP基因，将其克隆人pMDl8-T载体，序列测定和分析表明：所扩增的NP基因的核苷酸长为1470bp，共编码490个氨基酸。再将NP基因定向亚克隆至原核表达载体pGEX-6P的多克隆位点，经酶切鉴定后将含有NP基因的阳性亚克隆重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，用诱导荆IPTG分别以不同的浓度进行诱导，并在不同的诱导时间进行采样，样品经处理后通过SDS-PAGE、Westernblot和Dot-ELISA进行分析。结果显示：以终浓度为1mmol／LIPTG进行诱导4h表达可达到高峰。表达的融合蛋白大小约为80kD，并具有良好的抗原性。     

鹅副粘病毒HZ株F蛋白基因的克隆及序列分析

以鹅副粘病毒HZ株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出F基因片段,然后将其克隆到pUCm-T载体中。经转化、筛选、酶切和PCR鉴定后,初步获得含鹅副粘病毒F基因的阳性克隆,并进行序列测定验证。结果表明,该基因由1 662个核苷酸组成,共编码553个氨基酸。与GenBank下载的9株参考毒株的F基因作同源性比较,发现HZ株与ZJ1、F48E9、Lasota等毒株的核苷酸同源性分别为98.3%、85.4%、82.7%;氨基酸同源性分别为97.8%、90.6%、88.1%。说明HZ株与经典的鸡新城疫病毒(NDV)在F基因上存在很大的差异,而与近年来的分离株亲缘关系较近。     

鹅源I型禽副粘病毒JG97株F基因的分子特性分析

根据GenBank中鸡新城疫病毒（NDV）基因序列合成了1对引物,通过RT-PCR扩增出了鹅源I型禽副粘病毒（AMPV-1）或NDV JG97株的F基因。将扩增片段克隆到pGEM-T载体中,并进行了序列测定。该片段含1个完整的、长1662bp的F基因开放阅读框（ORF）,编码的F蛋白长553个氨基酸,其中含有12个半胱氨酸残基和6个潜在的糖基化位点,其裂解位点的氨基酸顺序为^112R-R-Q-K-R-F^117,与NDV强毒株特征相符。同源性分析表明,JG97株与LZ-NDV、NA-1、SF02、Taiwan95和YG97株的核苷酸和蛋白氨基酸的同源性分别为94．6％-99．6％和96．6％-99．5％,与LaSota株的核苷酸和氨基酸的同源性仅为84．6％和88,8％。结果表明JG97株与LZ-NDV、NA-1、SF02、Taiwan95和YG97等5个毒株的遗传关系较近,而与LaSota株差异较大。     

鹅副粘病毒F基因的克隆测序及核苷酸序列分析

以鹅副粘病毒 (GPV) SF0 2株的基因组 RNA为模板 ,通过 RT- PCR的方法扩增出 F基因片段 ,然后将其克隆至 T载体中。经 PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序。测序后拼接得出 F基因的全序列。与 Gen Bank下载的 9株参考毒株比较 F基因编码区全核苷酸序列 ,发现所测 GPV- SF0 2毒株与参考毒株 L Z- NDV核苷酸序列同源性为 96 %,与F48E9同源性为 92 .5 %,与 L a Sota为 88%。     

鹅副粘病毒HN基因的克隆与序列分析

以鹅副粘病毒GPV-SF02毒株的基因组RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增出HN基因片段，然后将其克隆至T载体中。经PCR鉴定后，对阳性克隆进行测序；测序后拼接得出HN基因的全序列。经分析HN基因编码区核苷酸序列，所测GPV-SF02毒株与参考毒株NL-96核苷酸序列的同源性为86%。     

鹅副粘病毒感染的诊断与防治

鹅副粘病毒病是自1997年以来出现的一种新的鹅的病毒性急性传染病。国外学者认为禽副粘病毒一般不会感染鹅,即使感染也不会发病。但我国学者王永坤和辛朝安分别报道了由鹅副粘病毒引起的疾病暴发,他们分别在江苏和广东等地的病例中分离到了对鹅具有强致病力的副粘病毒。随后,在上海、安徽、吉林、山东、浙江、江西、福建、广西、四川等地也陆续报道发生鹅副粘病毒病。近年来,我省的流行病学调查结果表明,自1999年以来我省已有二十余个鹅场发生副粘病毒病,而且逐渐呈流行趋势。2005年5月2日,兰西县星火乡羊场村刘忠孝养鹅场,从远大禽业公司购…