大豆孢囊线虫不同寄主种群的形态变异及对大豆寄主的适应性差异分析

在对大豆、烟草与地黄寄主上14 个大豆孢囊线虫（SCN）种群形态与分子鉴定的基础上, 对雌虫的孢囊和阴门锥进行形态观察和测计。结果表明：烟草SCN和大豆SCN的各测量值之间无明显差异（P＞0.05）, 地黄SCN的阴门窗长（43.8μm）和宽（33.9μm）显著小于其他两者（P＜0.05）; 同一寄主不同SCN种群之间的形态也存在一定差异; 阴门裂长和下桥长具有稳定性, 可以作为鉴定大豆孢囊线虫可靠的形态特征。3 种寄主种群侵染大豆（‘荷豆12号’）的试验表明, 大豆SCN能侵染大豆并能形成雌虫, 而烟草SCN和地黄SCN未能侵染大豆和形成雌虫。本研究结果表明SCN不同寄主种群存在形态变异, 而它们对大豆的寄主适应性也不相同。     

陕西省小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS区序列与RFLP分析

 采用线虫通用引物TW81和AB28对采自陕西的20个小麦禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行PCR扩增、克隆和测序。利用Mega软件的UPGMA方法分析了陕西省小麦禾谷孢囊线虫群体及其与GenBank公布的近缘种的系统发育关系,结果表明陕西省小麦孢囊线虫群体的rDNA-ITS区片段的长度为1 045 bp,且均为禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）,ITS区序列同源性为99.56%,只有3处碱基存在差异。其ITS区同中国河南（EU106175）、北京（AY148382）、山东（HM370427）的禾谷孢囊线虫H. avenae,澳大利亚的H. australis（AY148395）及俄罗斯的H. pratensis（AY148351）的亲缘关系最为接近。利用8种限制性内切酶Ava Ⅰ（Eco88 Ⅰ）、Alu Ⅰ、Hha Ⅰ（Cfo Ⅰ）、Hae Ⅲ（BsuR Ⅰ）、Hind Ⅲ、Hinf Ⅰ、Rsa Ⅰ和Mva Ⅰ（Bst N1）对20个陕西省CCN群体的ITS区PCR扩增产物进行限制性内切酶谱（RFLP）分析,结果表明8种限制性内切酶酶切ITS-PCR产物后共产生22个酶切片段,20个种群的PCR-RFLP谱型一致,表明陕西省小麦禾谷孢囊线虫是同一个群体且与已报道的中国CCN群体的“C”型一致,有别于欧洲的“A”型群体和印度的“B”型群体。这是首次报道陕西省小麦禾谷孢囊线虫种群的分子特征。     

青海、陕西部分地区禾谷孢囊线虫 rDNA-ITS-RFLP的特征分析

 采自我国青海、陕西等省地11个寄生小麦的孢囊线虫群体经形态学鉴定为禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)。用PCR技术扩增获得的rDNA-ITS片段长度约为1 060 bp。用Hinf Ⅰ、Taq Ⅰ、Hpa Ⅱ、Hae Ⅲ、Pst Ⅰ、Alu Ⅰ 等6种限制性内切酶酶切ITS扩增产物;青海10群体YBT10A、HY65A、HY61B、ZHZ162B、HY5B、HHX8A、GH132A、HY92A、HY127B、DT142A 的6个酶的RFLP图谱完全一致;陕西YL4A群体的Hae Ⅲ、Hinf Ⅰ和Hpa Ⅱ酶切结果与青海群体的上述3种酶切结果相同,但Alu Ⅰ和 Pst Ⅰ的酶切结果比青海孢囊线虫群体都多1条1 060 bp片段,而YL4A群体Taq Ⅰ酶切结果较为复杂。对比已知Avenae组成员RFLP图谱,青海群体与北京房山H.avenae群体的RFLP图谱一致;而陕西YL4A的Alu Ⅰ图谱与H.avenae法国群体一致,Pst Ⅰ和Taq Ⅰ却与Avenae组成员已知酶切结果均不一致。河南3个禾谷孢囊线虫群体除Taq Ⅰ酶切结果比青海CCN群体多1条520 bp片段以外,其他5种酶的RFLP都一致,而与澳大利亚的禾谷孢囊线虫H.avenae群体的RFLP图谱一致。     

河南郑州小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)的核糖体基因ITS序列和RFLP分析

 采用PCR技术对河南郑州禾谷孢囊线虫群体的核糖体基因(ribosomal DNA,rDNA)内转录间隔区(Internal Transcribed Spacers,ITS)进行扩增,获得片段长度约为1040bp。利用UPGMA方法分析了河南郑州禾谷孢囊线虫群体与近缘种的系统发育关系,结果表明:中国Heterodera avenae群体,H.australis和H.pratensis亲缘关系很近。8种限制性内切酶(Restriction Enzyme,RE)酶切禾谷孢囊线虫ITS的扩增产物,其中HindⅢ、AvaⅠ不能酶切PCR产物;Alu Ⅰ酶切PCR产物,获得560bp和480bp2个片段;RsaⅠ和Hinf Ⅱ酶切后分别得到3个片段(700、320、20bp和820、180、40bp);CfoⅠ是3个酶切位点(740、150、110、40bp);HaeⅢ和MvaⅠ能分别清晰地观察到3个片段(420、350、180bp和400、340、280bp),但有微小片段无法清晰观察到。9个种群所得RFLP图谱一致,说明郑州禾谷孢囊线虫群体可能是同一种群且不同于欧洲群体(typeA)和印度群体(typeB)的C型。     

甘肃小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3区序列特征及ITS-RFLP分析

禾谷孢囊线虫是危害禾谷类作物的重要病原,严重威胁我国小麦主产区的小麦产量和品质。利用通用引物对甘肃、河南、安徽禾谷孢囊线虫群体28SrDNA-D2/D3区和rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列测定,利用UPG-MA方法分析了甘肃省7个种群、河南1个种群、安徽1个种群的禾谷孢囊线虫群体D2/D3区和ITS区的系统发育关系;用9种限制性内切酶对7个甘肃禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行了RFLP分析。结果表明:中国甘肃的禾谷孢囊线虫rDNA-D2/D3区片段长度约为780bp,rDNA-ITS片段长度约为1040bp。7个甘肃禾谷孢囊线虫群体、1个河南安阳群体、1个安徽蚌埠群体的D2/D3区和新西兰的H.aucklandica群体亲缘关系很近;其ITS区同澳大利亚的H.australis、北京通州的H.avenae(AY148382)的亲缘关系很接近。RFLP分析表明,9种限制性内切酶酶切禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS共产生了22个酶切片段,不同酶切的RFLP分布型在7个种群间没有差异。甘肃省禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区具有高度的保守性,与中国的C型群体相近,但不同于欧洲的A型群体和印度的B型群体。这是首次报道甘肃CCN种群分子特征。     

格木寄生线虫中国新记录种——卡勒萨隐皮孢囊线虫Cryphodera kalesari

在对广东省主要珍贵树种上的线虫进行调查时从格木Erythrophleum fordii上分离到一种隐皮孢囊线虫,经形态特征观察和测量数据分析,将其鉴定为卡勒萨隐皮孢囊线虫Cryphodera kalesari。其诊断特征为:雌虫椭圆形至近球形,头部具有1个唇盘和2～3个唇环,口针长33.6～37.8μm,阴门唇突出,阴门与肛门之间区域凹陷,肛阴距为42～72μm;2龄幼虫头部具1个明显的唇盘和3个唇后环纹,口针长24.8～29.5μm,口针基部球前缘凹陷,侧区3条侧线,尾长圆锥形,长38～53.5μm,尾末端细圆,透明尾长17.1～25.1μm,侧尾腺孔位于肛门后2～5环;雄虫未发现。本研究首次获得了卡勒萨隐皮孢囊线虫的rDNA(LSU D2D3和ITS)序列,为此线虫的鉴定提供了可靠的分子数据。本研究还分析了卡勒萨隐皮孢囊线虫与本属其他种类的系统进化关系。卡勒萨隐皮孢囊线虫为中国的地理新记录种。格木为隐皮孢囊线虫的新寄主。     

孢囊线虫中国新纪录种—朝鲜孢囊线虫（Heterodera koreana）

 孢囊线虫属（Heterodera）线虫目前大约有80种,该线虫分布广泛,是对农作物危害最严重的植物病原线虫之一［1］,对我国的农业生产和粮食安全造成极大的威胁。如,寄生大豆的大豆孢囊线虫（H. glycines）,寄生小麦的禾谷孢囊线虫（H. avenae, H. filipjevi）［1,2］及湖南省水稻上新发现的日本孢囊线虫（H. elachista）［3］。为明确孢囊线虫在中国南方地区的种类及分布,2007~2011年结合形态学和分子生物学技术开展了孢囊线虫调查鉴定,在江西省发现朝鲜孢囊线虫（H. koreana）。该线虫为首次在中国发现。     

甘肃小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3区序列特征及HS-RFLP分析

禾谷孢囊线虫是危害禾谷类作物的重要病原,严重威胁我国小麦主产区的小麦产量和品质.利用通用引物对甘肃、河南、安徽禾谷孢囊线虫群体28S rDNA-D2/D3区和rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列测定,利用UPG-MA方法分析了甘肃省7个种群、河南1个种群、安徽1个种群的禾谷孢囊线虫群体D2/D3区和ITS区的系统发育关系;用9种限制性内切酶对7个甘肃禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行了RFLP分析.结果表明:中国甘肃的禾谷孢囊线虫rDNA-D2/D3区片段长度约为780 bp,rDNA-ITS片段长度约为1 040 bp.7个甘肃禾谷孢囊线虫群体、1个河南安阳群体、1个安徽蚌埠群体的D2/D3区和新西兰的H.aucklandica群体亲缘关系很近;其ITS区同澳大利亚的H.australis、北京通州的H.avenae(AY148382)的亲缘关系很接近.RFLP分析表明,9种限制性内切酶酶切禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS共产生了22个酶切片段,不同酶切的RFLP分布型在7个种群间没有差异.甘肃省禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区具有高度的保守性,与中国的C型群体相近,但不同于欧洲的A型群体和印度的B型群体.这是首次报道甘肃CCN种群分子特征.     

我国小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae Wollenweber)鉴定研究

 1989-1990年对湖北省天门县、潜江县、仙桃市、新洲县,河北、河南、山西等省及北京市郊等地的矮黄麦株根、根围田土的直接检查和漂浮分离检查,都查到褐或黑褐孢囊,内有大量可育卵,经用光学显微镜和扫描电镜对孢囊阴门锥膜孔特征,二龄幼虫头部细微结构等的观察及对其有关体值的测量,鉴定为禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae Wollenweber 1924,后有名Bidera avenae(Wollenweber,1924)Krall & Krall,1978)亦即燕麦孢囊线虫。其主要形态特征为孢囊较大,阔柠檬形,色深褐,长709(601-903)μm,宽523(436-612)μm,阴门锥顶为典型双膜孔型,无下桥,阴门锥下方有许多排列不规则的泡状突;二龄幼虫长550(477-602)μm,头骨架发达,口针长24μm,唇盘伸长与亚背唇和亚腹唇融合形成一近肾形唇区结构。禾谷孢囊线虫是世界性重要病原线虫,已在32个产麦国家被发现,本研究在我国小麦上初次发现,为我国孢囊线虫一新记录种;明确了我国南北两类型麦区一些小麦矮黄不长、根系分叉多,细而乱,甚至纠结成团,开花前后,根侧露出微小如粉末的发亮颗粒状物(孢囊),产量往往骤减,即系其危害所致;从而纠正了以前多归因于施肥不匀、生理失常的错误认识;对进一步正确诊断、调查、研究其在我国的发生分布、危害规律、生物学特性及控制方法具有理论意义和实用价值。     

拟悬铃木根结线虫及其相似种的rDNA-ITS-RFLP分析

本文用特异性引物F195和V5367,对拟悬铃木根结线虫和花生根结线虫的核糖体DNA内转录间隔区（rDNA-ITS）进行了PCR扩增,扩增产物用5种限制性内切酶Taq Ⅰ、Rsa Ⅰ、Msp Ⅰ、Cla Ⅰ、HaeⅢ进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析.Taq Ⅰ、Rsa Ⅰ、Msp Ⅰ、Cla Ⅰ酶切拟悬铃木根结线虫的rDNA-ITS扩增产物所获得限制性酶谱与花生根结线虫的限制性酶谱一致,只有HaeⅢ酶切拟悬铃木根结线虫和花生根结线虫的rDNA-ITS产物所得酶谱不同.rDNA-ITS扩增产物的HaeⅢ酶切图谱可以区分拟悬铃木根结线虫和花生根结线虫.     

小麦禾谷胞囊线虫(Heterodera avenae)的核糖体基因(rDNA)限制性片段长度多态性研究

 采用PCR技术扩增出中国和摩洛哥禾谷胞囊线虫群体的核糖体基因(rDNA)的内转录间隔区(ITS)片段的长度约为1 060 bp。用11种限制性内切酶(RE)酶切禾谷胞囊线虫ITS扩增产物,共产生27个酶切片段。用AluI和RsaI酶切ITS扩增产物证明中国禾谷胞囊线虫ITS属于"B型",而摩洛哥禾谷胞囊线虫ITS属于"A型"。用HinfI酶切后,7个中国禾谷胞囊线虫群体产生2个RFLP片段(860和200 bp),而摩洛哥群体产生3个RFLP片段(520、340和200 bp),HinfI揭示出中国与摩洛哥禾谷胞囊线虫ITS之间存在差异。AvaI和HindⅢ不能酶切禾谷胞囊线虫ITS。用CfoI、Bsh1236I、MsrFI、ScrFI、HaeⅢ和MvaI 6种RE酶切中国和摩洛哥禾谷胞囊线虫群体的rDNA-ITS,均分别得到相同类型的RFLP分布型,因此这6种RE不能揭示中国与摩洛哥群体的rDNA-ITS的差异。     

贵州省大豆孢囊线虫的发生与分布

大豆孢囊线虫病是威胁大豆生产的重大病害之一。2015-2016年,采用随机取样的方法对贵州省大豆孢囊线虫的发生和分布情况进行了调查。调查范围包括贵阳、六盘水、安顺、毕节、黔西南和遵义等6个地区下辖的14个县(区),共采集土样287份。调查结果表明,贵州省大豆孢囊线虫的总检出率为28.2%,其中毕节地区的大方县和赫章县孢囊检出率最高,分别达到46.7%和45.0%,而在遵义市、贵阳市和黔西南州孢囊检出率为0。六盘水地区的水城县孢囊发生量最大,平均孢囊数为3.4个/200g土,最大孢囊数达到17个/200g土;安顺地区的镇宁和关岭县大豆孢囊线虫发生程度最轻,每200g土样平均孢囊数分别为0.3和0.2个,最大孢囊数仅为2个/200g土。分离的孢囊主要形态特征与大豆孢囊线虫一致,并且ITS序列与甘肃大豆孢囊线虫种群序列一致性达100%。根据形态学观察和ITS序列分析比对,将贵州省采集到的孢囊线虫鉴定为大豆孢囊线虫。本研究结果可为有效防控贵州省大豆孢囊线虫病提供依据。     

河北省大豆孢囊线虫分子鉴定及其分布

2003年,在河北省邯郸、邢台、石家庄、保定、秦皇岛、唐山、张家口等地采集大豆根际土壤样品65份,应用大豆孢囊线虫特异性引物对采集的孢囊线虫进行了分子鉴定,结果表明从邯郸的永年、磁县、峰峰,邢台的南和、广宗、清河,保定的南大园、西马池、望都、定州,石家庄的栾城、鹿泉、平山及石家庄市郊,秦皇岛的抚宁、昌黎,唐山的迁西、迁安、丰润的大豆和张家口的红云豆上采集的孢囊线虫的孢囊及其二龄幼虫均为大豆孢囊线虫;卢龙和滦县的样品中没有发现大豆孢囊线虫的孢囊及其二龄幼虫,且孢囊的检出率与二龄幼虫的检出率的趋势一致。     

Note: Molecular identification of three entomopathogenic nematodes from turkey by PCR-RFLP of the ITS regions

Molecular identification methods are widely used for the classification of organisms worldwide. Entomopathogenic nematodes are the most often isolated insect parasitic nematodes in the tropical and subtropical regions. In our investigation, PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction — Restriction Fragment Length Polymorphism) of the ITS region (Internal Transcribed Spacer) on the ribosomal (r) DNA of three entomopathogenic nematodes isolated from Ankara, Turkey, was analyzed for identification. The ITS region of rDNA was amplified by PCR and then digested with the following nine restriction enzymes: Alu I, Dde I, Hae III, Hha I, Hind III, Hinf I, Hpa II, Rsa I and Sau 3AI. The amplified and restricted sequences of the ITS regions were separated by agarose gel electrophoresis and the RFLP patterns of these three species were shown in this study. According to our results, these species were identified asSteinernema feltiae, Steinernema carpocapsae andHeterorhabditis bacteriophora. http://www.phytoparasitica.org posting Nov. 4, 2005.     

大豆孢囊线虫大豆和烟草群体寄生性比较分析

通过盆栽试验,测定大豆孢囊线虫(Heterodera glycines,soybean cyst nematode,SCN)大豆群体(SCNS)和烟草群体(SCN_T)对5个大豆品种(SCN生理小种鉴别寄主)和9个烟草栽培品种的寄生性。结果发现,SCNS在5个大豆品种上的平均繁殖系数(Rf=P_f/P_i)为0.60(0.14~1.90),在感病对照品种‘Lee’上平均Rf高达1.90;SCN_T在5个大豆品种上的平均Rf为0.18(0.06~0.44),在感病对照品种‘Lee’上Rf为0.44。SCNS对9个烟草品种几乎无寄生性,平均Rf为0.06(0.00~0.10);SCN_T则能寄生9个烟草品种,平均Rf为1.26(0.45~1.95)。接种35d后,在不同大豆品种根内SCNS和SCN_T的幼虫数量均极少,侵染率基本相同;在不同烟草品种根内SCNS的幼虫数量均为0,而SCN_T的幼虫数量平均为26.5(14.6~57.0)。研究表明,供试SCNS属于14号生理小种,但供试SCN_T与之寄生性差异大,属于新的SCN致病类型。     

山东省烟草孢囊线虫的群体动态和世代发生特点

为探究烟草孢囊线虫Heterodera glycines的田间侵染循环特点,2012年从山东省诸城市某烟田定点定期取样,对土壤和根组织中的线虫进行分离和染色后镜检并计数。结果显示,4月29日至9月9日在土壤中均检出烟草孢囊线虫2龄幼虫（J2）,有4个发生高峰,最大密度在7月9日,为7.3条/100 g土壤。5月13日至8月13日在根组织中出现J2,有3个明显高峰,最大密度在7月15日,为30条/10 g根;年轻雌虫在5月21日至8月30日形成,有3个明显高峰,最大密度在7月2日,为54条/10 g根。研究表明,烟草孢囊线虫 1年发生4代,平均世代历期27 d;后两代存在明显世代重叠现象;第4代线虫侵染量很少,且根内线虫发育不良。     

Identification of the Beet Cyst Nematode Heterodera schachtii by PCR

PCR-RFLPs of ITS-rDNA and PCR with species-specific primers were developed for identification of cysts and juveniles of the beet cyst nematode Heterodera schachtii. Restrictions of PCR product by MvaI or ScrFI distinguish H. schachtii, H. betae, H. trifolii and H. medicaginis. RFLP profiles with eight restriction enzymes for these four nematode species are presented. Based on Internal Transcribed Spacer sequences of populations from several Schachtii group species, a specific primer for H. schachtii was designed, permitting amplification of the target sequence from juveniles and cysts of the beet cyst nematode. A duplex PCR protocol tested with a wide range of nematode samples is described.     

沙地葡萄茎痘相关病毒的RT-LAMP检测方法

 本研究建立了一种用于沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting-associated virus, GRSPaV）的RT-LAMP检测方法。以GRSPaV的RdRp基因序列（GenBank登录号：GQ478314）为靶序列,设计3组RT-LAMP引物,从中筛选出1组有效引物,并确定了适宜的反应温度和反应时间。对RT-LAMP产物进行Hha Ⅰ酶切,酶切片段与理论片段大小一致,证明了RT-LAMP产物的特异性。RT-LAMP方法能够检测出GRSPaV的RNA最大稀释倍数为10^-4,与RT-PCR方法相比更为灵敏。田间葡萄样品RT-LAMP检测结果与已知样品带毒情况相同,表明RT-LAMP检测GRSPaV具有较好的可靠性。在RT-LAMP反应产物中加入染料SYBR Green Ⅰ （×1000）可直接观察反应结果。建立的GRSPaV RT-LAMP检测方法具有简便、快速、灵敏、可视化等特点,尤其适合基层使用,具有良好的应用前景。     

半轮线虫属新种——拟中华半轮线虫Hemicriconemoides parasinensis sp. nov.的描述

 拟中华半轮线虫新种(Hemicriconemoides parasinensis sp. nov.)模式标本采集于辽宁省沈阳市沈阳农业大学校园的丁香(Syringa oblata)根际土中,在河南省安阳市安阳公园的小叶女贞(Ligustrum quihoui)根际土中也有分布。主要鉴别特征是虫体头区圆形,头环2个,第1头环略小于或等于第2头环,排泄孔位于肠的前端(Rex=29~33),体长中等,口针中等(76~86 μ m),体环数R值中等(96~110),卵巢单生前伸,受精囊长圆形,尾部宽圆锥形、尾端半球形圆;幼虫具指状的棘片,约12~16排,后翻;雄虫未见。该新种虫体形态特征与中国半轮线虫(H. sinensis Vovlas,1988),芒果半轮线虫(H. mangiferae Siddiqi,1961)和微小半轮线虫(H. minutus Esser,1960)相近似。