柑橘衰退病毒柚分离株的p25/Hinf1 RFLP分析

对123个柑橘衰退病毒柚分离株进行p25/Hinf1 RFLP分析明确:样品中,单一p25/Hinf1 RFLP组群样品占样品总量的82.9%,说明我国田间受侵染柚类中柑橘衰退病毒株系相对较为单一;RFLP组群6的样品占样品总量的79.7%,说明目前柚类生产上的优势流行株属于p25/Hinf1 RFLP组群6,初步认定为强毒株系;柑橘衰退病毒株柚分离株S102、S104、S106、S108属于p25/Hinf1 RFLP组群5,初步认定是弱毒株系。     

引起重庆主栽柑桔品种衰退病的病毒株系组群分析

 柑桔衰退病毒(CTV)存在着许多生物学特性不同的株系。通过铲除感染强毒株植株或利用弱毒株交叉保护的方式来防治柑桔衰退病都需要对CTV株系进行准确、可靠的鉴定。本文根据对CTV衣壳蛋白基因(CPG)的限制性片段长度多态性(RFLP)分析,发现在重庆主栽柑桔品种的衰退病毒主要以CP/Hinf I RFLP第1、3和6组群为主,并且在田间以多株系混合感染为主。     

4种柑橘衰退病毒源单蚜传毒分离株CP基因的分子特征

 对4种柑橘衰退病毒源及其31个单蚜传毒分离株的CP基因做了限制性片段长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)分析,并对其中8个单蚜传毒分离株的CP基因进行了序列分析。实验明确了所研究柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)的CPG/Hinf I RFLP组群和CPG/SSCP模式,二者能较好地对应并有效验证了单蚜传毒对CTV毒源的分离纯化作用;CP基因序列分析结果表明,相同CPG/Hinf I RFLP组群的单蚜传毒分离株间具有高度的序列相似性,而不同CPG/Hinf I RFLP组群单蚜传毒分离株间则存在较大差异;通过与已知生物学特性CTV分离株比较,初步建立了上述CP基因分子特征与病毒生物学特性之间的联系。     

重庆地区柑桔衰退病毒多态性研究

柑桔衰退病毒(CTV)存在着复杂的株系分化现象.在使用弱毒株交叉保护防治柑桔衰退病时需要对田间病毒株系组成进行分析,并对选用的株系进行单蚜分离纯化.作者运用限制性片段长度多态性和单链构象多态性对田间获得的168个CTV样品和2个蚜传毒株的外壳蛋白基因进行分析,了解重庆市田间CTV组群构成情况,发现田间CTV以多株系混合发生为主,其中主要是CP/HinfⅠRFLP第1、3和6组群,约占总数的90%,并以强毒株混合感染为主.甜橙中CP/HinfⅠRFLP的组群构成最为复杂.单头褐色桔蚜从柚类至甜橙传播CTV的效率低(不足1%),该蚜的取食可改变CTV的株系组成.     

6种柑橘类植物对柑橘衰退病毒分离株TR-L514变异的影响

 柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)存在复杂的株系分化现象,运用弱毒株交叉保护防治柑橘衰退病时需了解不同类型柑橘对CTV构成的影响。作者将CTV分离株TR-L514嫁接接种到6类柑橘植物上获得了18个亚分离株,并对这18个亚分离株和TR-L514进行了指示植物鉴定,p25基因的限制性片段长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)分析,p23基因的序列比较。结果表明,CTV株系对不同柑橘类植株的适应性存在差异。TR-L514嫁接到不同柑橘类植株其构成会发生变化,在甜橙上可以同时检测出p25//HinfⅠ RFLP第1和6组群,并具有比在其它4类柑橘上更为复杂的SSCP谱型构成,因此甜橙可能更适宜于CTV的增殖。TR-L514及18个亚分离株的p23基因序列差异可能与不同类柑橘植株的适应性有关。     

广西柑橘衰退病和黄脉病调查及其病原病毒的遗传多样性分析

为明确柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus, CTV)和柑橘黄脉病毒(citrus yellow vein clearing virus, CYVCV)在广西柑橘上的发生?分布及其遗传变异情况, 于2020年至2021年对百色?北海?崇左?贵港?桂林?河池?贺州?来宾?柳州?南宁?梧州和玉林等12个柑橘产区进行了病毒病调查?采用RT-PCR对采集样品进行了病毒检测, 并基于病毒分离物外壳蛋白(coat protein, CP)基因的核苷酸序列进行比对分析, 构建系统发育树?结果表明:采集的737份柑橘样品中, CTV的检出率为20.62%, CYVCV检出率为18.32%, CTV的检出率略高于CYVCV?病毒复合侵染的现象在采集的柑橘样品中普遍存在, CTV和CYVCV复合侵染率高达34.50%?对RT-PCR产物测序共获得12个CTV分离物和6个CYVCV分离物的CP基因序列?遗传多样性分析发现, CTV和CYVCV的CP基因序列都较保守, CTV分离物的遗传进化与地理来源?寄主来源均没有明显相关性, 但CYVCV分离物的遗传进化与地理位置具有相关性, 而与寄主来源无明显相关性?上述研究结果可为深入了解CTV和CYVCV在广西的流行情况以及柑橘病毒病的检疫和防控提供参考?     

柑橘衰退病毒含量对其蚜传效率的影响

为明确毒源植株和蚜虫中柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)的发生情况与蚜虫传播CTV能力的关系,将褐色橘蚜、棉蚜、橘二叉蚜和绣线菊蚜置于分别感染了4个CTV分离株的锦橙上取食24 h后,运用巢式RT-PCR和实时RT-PCR检测蚜虫和锦橙的带毒情况,并分析蚜虫的传毒能力。结果显示,蚜虫中CTV的平均带毒率为0.76~0.84,其中棉蚜的最高,其次为绣线菊蚜、褐色橘蚜和橘二叉蚜。锦橙中各CTV分离株的含量差异不大,与蚜虫传毒效率间无显著相关性;也未发现蚜虫带毒率与其传播CTV能力之间存在相关性。蚜虫体内CTV的含量为5.36×103±2.33×103~2.01×106±3.67×105拷贝,褐色橘蚜中含量最高,其次为棉蚜、橘二叉蚜和绣线菊蚜;且高蚜传能力CTV分离株在褐色橘蚜体内的含量远高于低蚜传能力分离株。表明蚜虫体内CTV的含量可能与蚜虫传毒能力有关。     

不同来源的柑橘衰退病毒分离物基因组5'端A、F变异区序列克隆及分析

 柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)组群自然条件下存在株系分化现象。本研究利用RT-PCR技术扩增、克隆了来自我国不同地区的21个柑橘衰退病毒分离物的5'端A、F变异区。通过分析发现,不同来源的各分离物在5'端A、F区存在较大的变异。21个分离物A区序列相似性最低为85.8%,最高可达99.8%,平均为95.9%;与GenBank中9个代表性株系的平均相似性为84.2%。F区序列相似性较A区高,为98.0%;相似性最低为94.3%,最高达99.1%。结果显示不同来源的CTV分离物5'端序列A、F区变异较大。     

用滚环扩增技术检测双生病毒

 本文报道了利用滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)放大双生病毒的靶核酸信号,进而利用限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)检测不同类型双生病毒的新技术体系。研究结果表明,利用RCA-RFLP对于已知的单组份和双组份以及带有卫星的菜豆金色花叶病毒属病毒都能够有效检测,对采自浙江杭州地区的田间样品进行RCA-RFLP检测的结果与利用简并引物PA和PB进行PCR扩增的结果相吻合。相比传统的PCR检测方法,用RCA-RFLP体系检测双生病毒灵敏性更高,操作更简便。     

柑橘衰退病、裂皮病和碎叶病的多重RT-PCR检测方法研究

 本研究以广东省农业科学院果树研究所隔离网室内通过嫁接分别感染CTV、CEVd和CTLV的柑橘树皮为实验材料,建立了以oligo(dT)为反转录引物的RT-PCR检测体系,成功检测到在病毒RNA 3'末端带有ploy_(A)加尾的CTV和CTLV。实验过程中,发现不具有ploy_(A)加尾的环状类病毒CEVd,同样可以用oligo(dT)反转录的RT-PCR检测出来,通过测序分析,其同源性在96%以上,并发现在CEVd序列中有一个富含A的区段。在此基础上,进一步研究了同时检测CTV、CEVd和CTLV的多重RT-PCR检测体系,该方法能为这3种病害的检测简化步骤、节省时间、降低成本。     

应用多重PCR技术同步检测柑橘4种重要嫁接传播病原

 柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV),柑橘碎叶病毒(Citrus tatter\|leaf virus,CTLV),柑橘裂皮病类病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)和柑橘黄龙病(Huanglongbing, HLB)亚洲种病原(Candidatus liberobacter asiaticus)是重要的柑橘嫁接传播病原。本文建立了同时检测HLB病菌、CTV、CEVd 和CTLV 4种柑橘嫁接病原的一步法、双温多重PCR检测技术体系,同时在体系中设置内参基因。应用该体系快速评价了4种嫁接传播病原在田间侵染情况,结果表明28个田间样品CTV、CEVd、CTLV和HLB感染率分别为89.3 %、17.9 %、10.7 %和28.6 %,接近半数样品为混合感染。并且将该方法应用于快速评价茎尖嫁接苗病毒的脱除情况。     

柑橘三种蚜虫取食行为的EPG分析

为探究柑橘3种蚜虫取食行为差异,利用刺吸电位图谱(electrical penetration graph,EPG)技术对褐色橘蚜Toxoptera citricida(Kirkaldy)、棉蚜Aphis gossypii Glover和绣线橘蚜Aphis citricola van der Goot在椪柑上的取食行为进行了测定。结果表明:3种蚜虫均产生8种取食波形,依次为非刺探波(np波)、路径波(A、B、C波)、电位下降波(pd波)、韧皮部分泌唾液波(El波)、韧皮部被动吸食波(E2波)以及木质部主动吸食波(G波)。棉蚜开始取食的第1次刺探时间最早,绣线橘蚜刺探的次数最多,且C波时间最长。褐色橘蚜pd波出现的次数最少,棉蚜次之,绣线橘蚜最多,显著高于褐色橘蚜。与其它2种蚜虫相比,绣线橘蚜于木质部主动吸食汁液(G波)时间最长,有G波的个体比例最高。3种蚜虫E1波次数和总持续时间差异均不显著,但褐色橘蚜E2波的持续时间217.01±27.56 min显著长于棉蚜142.49±27.85 min和绣线橘蚜116.64±20.05 min。初步推断3种蚜虫对柑橘衰退病毒的传毒效率与E2波有关。     

河南郑州小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)的核糖体基因ITS序列和RFLP分析

 采用PCR技术对河南郑州禾谷孢囊线虫群体的核糖体基因(ribosomal DNA,rDNA)内转录间隔区(Internal Transcribed Spacers,ITS)进行扩增,获得片段长度约为1040bp。利用UPGMA方法分析了河南郑州禾谷孢囊线虫群体与近缘种的系统发育关系,结果表明:中国Heterodera avenae群体,H.australis和H.pratensis亲缘关系很近。8种限制性内切酶(Restriction Enzyme,RE)酶切禾谷孢囊线虫ITS的扩增产物,其中HindⅢ、AvaⅠ不能酶切PCR产物;Alu Ⅰ酶切PCR产物,获得560bp和480bp2个片段;RsaⅠ和Hinf Ⅱ酶切后分别得到3个片段(700、320、20bp和820、180、40bp);CfoⅠ是3个酶切位点(740、150、110、40bp);HaeⅢ和MvaⅠ能分别清晰地观察到3个片段(420、350、180bp和400、340、280bp),但有微小片段无法清晰观察到。9个种群所得RFLP图谱一致,说明郑州禾谷孢囊线虫群体可能是同一种群且不同于欧洲群体(typeA)和印度群体(typeB)的C型。     

江西亚洲柑橘木虱的种群遗传结构研究

亚洲柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama是芸香科Rutaceae植物新梢期的重要害虫,也是黄龙病Huanglongbing的主要传播媒介,严重威胁江西柑橘产业的发展。本文利用线粒体基因标记,研究江西10个地点亚洲柑橘木虱的种群遗传结构和多态性。扩增了2个线粒体COⅠ基因片段,长度为1 431 bp。其中多态性位点2个(均为非同义突变,A/G转换),单倍型3个(Hap-1,Hap-2和Hap-3)。最常见的单倍型是Hap-1(占总样本数的91.7%),发生在所有采样点;其次为Hap-3(6.3%),分布在大余和崇义;Hap-2(2.0%)仅在兴国出现。单一直线型的单倍型网络结构模式、小而不显著的HR(Harpending’s raggedness)指数值,以及单峰型错配分布曲线均表明:江西地区的亚洲柑橘木虱是近期入侵并经历了快速的种群动态扩张。     

苹果茎沟病毒柑橘碎叶株系的分布与序列分析

为明确苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)柑橘碎叶株系(citrus tatter leaf virus,CTLV)在中国柑橘产区的发生分布及其分子特性,于2017—2021年对我国12个柑橘主产区开展系统调查,并采用多重比对以及系统发育分析法对CTLV的全序列进行分析。结果表明,从12个柑橘主产区采集的2 012份疑似样品中检测出413份感CTLV阳性样品。除陕西省外,其余11个柑橘主产区样品中均检测出CTLV,并且柚类样品中CTLV的检出率最高,达到32.31%。对分离获得的22株CTLV毒株和已知的7株CTLV以及5株ASGV毒株进行全序列分析,发现所有34株毒株的核苷酸序列相似性为78.6%～99.8%,且CTLV序列的保守性较高。此外,与其他4株ASGV毒株相比,本研究中22株CTLV毒株与ASGV-MK毒株(GenBank登录号为MZ127820.1)具有更近的亲缘关系。推测CTLV中国毒株间的亲缘关系可能与其采样地和寄主品种有关。     

柑橘叶斑驳病毒研究进展

柑橘叶斑驳病毒(citrus leaf blotch virus, CLBV)于20世纪70年代在美国加利福尼亚洲首次发现,之后许多国家陆续报道CLBV侵染不同寄主植物。2016年,我国在猕猴桃中首次检测到CLBV,随后在甜樱桃、柑橘、芍药、苹果、桑树和南天竹中发现CLBV,现已在多个地区普遍发生流行。本文系统梳理了CLBV的研究进展,重点综述了CLBV的发生分布、传播为害、分子变异、检测技术、基因组特征、基因功能等,以期为抗CLBV作物育种、病害综合防控及致病机理的研究提供基础支撑。     

来源于猕猴桃的柑橘叶斑驳病毒的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)为柑橘病毒属(Citrivirus)代表种。本研究采用RT-PCR技术从我国栽培猕猴桃上首次检测到CLBV,总检出率为13.3%。测定了5个CLBV分离物的外壳蛋白基因(coat protein gene,cp)序列,全长均为1 092核苷酸(nt),分离物间cp基因核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为83.2%~99.7%和91.9%~98.9%,这些分离物与新西兰报道的CLBV猕猴桃分离物M3-A核苷酸序列相似性仅为83%左右,与来源于柑橘及近缘种的CLBV分离物cp基因核苷酸序列相似性为84%~86%。在基于该病毒cp基因核苷酸序列的系统进化树中,本研究所测定的CLBV猕猴桃分离物与新西兰报道的除M3-A外的猕猴桃分离物聚在同一组群。研究结果为进一步明确CLBV在我国猕猴桃上的侵染和危害特点及建立该病毒的分子检测技术提供了重要信息。     

青海、陕西部分地区禾谷孢囊线虫 rDNA-ITS-RFLP的特征分析

 采自我国青海、陕西等省地11个寄生小麦的孢囊线虫群体经形态学鉴定为禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)。用PCR技术扩增获得的rDNA-ITS片段长度约为1 060 bp。用Hinf Ⅰ、Taq Ⅰ、Hpa Ⅱ、Hae Ⅲ、Pst Ⅰ、Alu Ⅰ 等6种限制性内切酶酶切ITS扩增产物;青海10群体YBT10A、HY65A、HY61B、ZHZ162B、HY5B、HHX8A、GH132A、HY92A、HY127B、DT142A 的6个酶的RFLP图谱完全一致;陕西YL4A群体的Hae Ⅲ、Hinf Ⅰ和Hpa Ⅱ酶切结果与青海群体的上述3种酶切结果相同,但Alu Ⅰ和 Pst Ⅰ的酶切结果比青海孢囊线虫群体都多1条1 060 bp片段,而YL4A群体Taq Ⅰ酶切结果较为复杂。对比已知Avenae组成员RFLP图谱,青海群体与北京房山H.avenae群体的RFLP图谱一致;而陕西YL4A的Alu Ⅰ图谱与H.avenae法国群体一致,Pst Ⅰ和Taq Ⅰ却与Avenae组成员已知酶切结果均不一致。河南3个禾谷孢囊线虫群体除Taq Ⅰ酶切结果比青海CCN群体多1条520 bp片段以外,其他5种酶的RFLP都一致,而与澳大利亚的禾谷孢囊线虫H.avenae群体的RFLP图谱一致。     

小麦禾谷胞囊线虫(Heterodera avenae)的核糖体基因(rDNA)限制性片段长度多态性研究

 采用PCR技术扩增出中国和摩洛哥禾谷胞囊线虫群体的核糖体基因(rDNA)的内转录间隔区(ITS)片段的长度约为1 060 bp。用11种限制性内切酶(RE)酶切禾谷胞囊线虫ITS扩增产物,共产生27个酶切片段。用AluI和RsaI酶切ITS扩增产物证明中国禾谷胞囊线虫ITS属于"B型",而摩洛哥禾谷胞囊线虫ITS属于"A型"。用HinfI酶切后,7个中国禾谷胞囊线虫群体产生2个RFLP片段(860和200 bp),而摩洛哥群体产生3个RFLP片段(520、340和200 bp),HinfI揭示出中国与摩洛哥禾谷胞囊线虫ITS之间存在差异。AvaI和HindⅢ不能酶切禾谷胞囊线虫ITS。用CfoI、Bsh1236I、MsrFI、ScrFI、HaeⅢ和MvaI 6种RE酶切中国和摩洛哥禾谷胞囊线虫群体的rDNA-ITS,均分别得到相同类型的RFLP分布型,因此这6种RE不能揭示中国与摩洛哥群体的rDNA-ITS的差异。