大肠杆菌中的表达

 在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）cry2Ac4基因；笔者以含有Bt WB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板，利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因，进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接；成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109，从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4，再转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，经IPTG诱导后，对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测；cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

生物信息学分析

 不同来源的苏云金芽孢杆菌能产生多种多样的晶体(Cry)蛋白。基于这个特性,人们可以通过基因工程的手段向工程菌中转入编码多种Cry毒素的基因来控制虫害。通过DNA重组技术,从Bt HZM2菌株中克隆出了cry1Ea基因,对其进行了生物信息学分析,同源比对结果表明,cry1Ea8基因的核苷酸序列与已知cry1Ea的同源性为99.77%~99.91%,对应的氨基酸序列同源性为99.49%~99.74%。对cry1Ea8基因的分析还揭示出了cry1Ea8及其编码蛋白的一些生物和理化性质。结构域预测表明,Cry1Ea8由3个结构域组成,其中N-末端螺旋状结构域与膜插入与孔隙形成有关,而第二和第三个结构域与受体的结合有关。该研究为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了新的基因来源。     

陆地棉纤维中 GhGMPase2基因克隆、序列分析及原核表达

从陆地棉纤维中克隆GDP-甘露糖焦磷酸化酶（ GhGMPase2）基因,并进行序列分析及原核表达。利用RT-PCR技术进行基因克隆,构建原核表达载体pET28a- GhGMPase2并转化大肠杆菌BL21（DE3）进行蛋白体外诱导表达,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。研究结果表明,从陆地棉花纤维中克隆得到棉 GhGMPase2基因,该基因的开放读码框为1 086 bp,编码包含362个氨基酸的蛋白质,分子质量约为40 ku。序列分析结果表明,GhGMPase2蛋白具有较高的保守性,具有典型的糖酰基转移酶转移酶A家族（GT-A）结构域和左手平行的β-的螺旋（LbetaH或LBH）域,它们分别属于糖酰基转移酶家族2（GT-2）超家族和LBH超家族。进化树分析的结果显示,棉花 GhGMPase2与烟草NtGMPase在进化上亲缘关系较近。经过原核表达载体pET28a- GhGMPase2的诱导表达和SDS-PAGE分析显示,获得分子质量约为40 ku的重组GhGMPase2蛋白。 GMPase2基因的克隆、序列分析及原核表达为进一步研究其参与棉花纤维发育过程中的重要功能奠定基础。     

玉米E3泛素连接酶类基因ZmGW2-1的克隆及表达分析

提高玉米产量是玉米育种的重要目标,而籽粒大小和粒重是禾谷类作物产量的重要构成因子。本研究根据水稻中已克隆的决定籽粒产量的主效基因OsGW2（RING型E3泛素连接酶）的序列信息,利用3’-RACE和RT-PCR技术从玉米基因组中分离出其直系同源基因,并对克隆的目的基因进行序列及组织表达特异性分析。结果表明,克隆得到的玉米同源基因编码区长为1287 bp,编码428 个氨基酸残基。Blastx功能分析发现该基因编码E3泛素连接酶类蛋白,该基因的编码序列与OsGW2的编码序列相似度高达83%,将其暂时命名为ZmGW2-1,且ZmGW2-1在雌穗中高度表达,表明该基因可能参与玉米雌穗的发育调控。该基因的克隆为进一步分析其功能奠定了基础。     

枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的克隆与表达分析

为探究枸杞查耳酮异构酶CHI1基因在不同组织中的表达模式和功能,利用同源克隆的方法获得1个枸杞（Lycium chinense）LcCHI1基因（Genbank No. OR026273）,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对其组织表达的特异性进行分析,并进行原核表达分析。结果表明：1）枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的cDNA序列全长695 bp,开放阅读框为633 bp,编码210个氨基酸,含有１个保守的Chalcone_3 family结构域。2）氨基酸序列比对显示,LcCHI1蛋白符合Chalcone蛋白结构特征且与其他物种Chalcone蛋白具有高度的相似性。聚类分析表明,LcCHI1蛋白与茄科的CHI蛋白单独聚成一支。3）LcCHI1在枸杞花、嫩叶与嫩枝中表达量较高,在根中表达量较低。随着枸杞果实的发育,LcCHI1表达呈先升高后降低趋势,在变色果中表达量最高。4）在原核表达载体中构建LcCHI1重组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析在63 ku处出现表达蛋白。综上,LcCHI1基因在枸杞花和变色果中表达较高,并能进行原核蛋白表达,研究结果为枸杞类黄酮合成途径中CHI基因的功能验证奠定基础。     

不同树种林分对空气负离子浓度的影响

为科学选择城镇造林或绿化树种,对浙江省嘉兴市新塍镇13 个树种林分内的空气负离子浓度进行日变化监测研究。结果表明：不同树种林分的空气负离子浓度具有一定差异,樱花Cerasus serrulata+小叶黄杨Buxus sinica var. parvifolia混交林、红枫Acer palmatum ‘Atropurpureu’纯林内空气负离子浓度相对较高,黄山栾树Koelreuteria paniculata与无患子Sapindus mukorossi纯林内空气负离子浓度较低。不同结构林分的空气负离子浓度差异明显,表现为乔灌混交林＞灌木林＞乔木林,其空气负离子浓度日变化趋势较为一致,均在上午10 : 00左右出现 1个峰值,在下午16 : 00 － 18 : 00呈上升趋势。对空气负离子与环境因子的相关性分析显示,空气负离子与相对湿度呈极显著正相关（P＜0.01）,而与温度极显著负相关（P＜0.01）,与紫外线强度显著负相关（P＜0.05）。对空气负离子与林分因子的相关性分析显示,空气负离子浓度与林分密度呈显著正相关（P＜0.05）。图2表5参14     

基因克隆及序列分析

 采用Trizol法提取高质量小麦总RNA,并运用RT-PCR方法克隆了小麦GAPDH （甘油醛三磷酸脱氢酶）基因的部分序列(EU022331),长度为604 bp,核苷酸序列比对结果表明,该序列与大麦(M36650)、玉米(AY109397)、番茄(BT012693)GAPDH核苷酸序列的同源性分别为95%、86%和84%。GAPDH基因的克隆为在禾谷类作物研究的应用提供了一个较好的对照基因。     

芦笋AoAMS的表达及编码蛋白与AoTDF1间的互作分析

拟南芥（Arabidopsis thaliana）ABORTED MICROSPORES （AMS）基因是调控绒毡层和花粉壁发育的关键基因。芦笋（Asparagus officinalis）中与AMS同源的基因尚未报道。本研究通过同源比对、系统进化树构建及基因表达量的综合分析,预测了芦笋的AMS候选基因并命名AoAMS;进一步以四倍体‘紫色激情’两性株自交后代中两性株花蕾为材料,通过RT-PCR分别扩增并获取AoAMS及与拟南芥DEFECTIVE IN TAPETAL DEVELOPMENT AND FUNCTION1 (TDF1)同源的基因（ AoTDF1）全长CDS序列,开展AoAMS编码蛋白亚细胞定位,与AoTDF1 间的互作分析及不同性别的芦笋花发育早期的无性别分化期（T1）、性别分化早期（T2）和晚期（T3）的表达分析。结果显示：AoAMS是具细胞核定位特征且与AoTDF1有互作的蛋白;AoAMS基因在雄花和两性花早期T1、T2、T3期发育的花冠、花药绒毡层、以及花粉中均有表达,但在雌花中相应时期及部位均无表达。研究结果表明AoAMS是专一性地在芦笋雄花或两性花中表达,并且可以与AoTDF1形成互作复合物,通过调控绒毡层及花粉正常发育相关基因的表达而在芦笋性别分化中行使促雄的功能。     

西瓜渗调蛋白ClOsm基因克隆及其编码蛋白的抑菌活性

【目的】克隆西瓜（Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. et Nakai）渗调蛋白基因ClOsm,明确该基因编码蛋白的抑菌活性,为进一步研究ClOsm基因功能并开展西瓜抗病分子育种奠定基础。【方法】采用同源克隆法,克隆西瓜ClOsm基因,分析其序列特征,并构建系统进化树。利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术分析ClOsm基因的表达特征。利用原核表达系统表达并纯化His-ClOsm重组蛋白,检测其对枯萎病菌、蔓枯病菌、白粉病菌、茄病镰刀菌和轮枝镰刀菌的体外抑菌活性。【结果】从枯萎病菌侵染的西瓜根系组织中克隆到渗调蛋白基因ClOsm（GenBank登录号为MF445019）,其长度为768 bp,编码255个氨基酸,预测蛋白质分子质量为27.52 ku,等电点为7.78。氨基酸结构分析显示,ClOsm含有TLP蛋白的保守结构域。系统进化分析表明,ClOsm与冬瓜BhOsm蛋白的亲缘关系最近,相似度达95%,且归为osmotin类型的类甜蛋白。实时荧光定量分析显示,ClOsm基因在西瓜根、茎、叶组织中均有表达,根中表达量最高;枯萎病菌侵染能够显著诱导ClOsm基因的表达,在侵染120 h时表达量最高。融合蛋白His ClOsm体外抑菌活性检测结果表明,ClOsm蛋白可以显著抑制枯萎病菌、蔓枯病菌、白粉病菌、茄病镰刀菌和轮枝镰刀菌等病原菌的生长,抑制率分别为70.2%,60.8%,65.3%,55.4%和46.6%。【结论】克隆了西瓜ClOsm基因,并纯化得到ClOsm重组蛋白,该蛋白能够显著抑制病原真菌的生长。     

远缘植物试管嫁接及ISSR分析

为了探明植物远缘嫁接的模式和分析嫁接后代的遗传特性,以大岩桐Sinningia speciosa,鸡冠花Celosia cristata,长寿花Kalanchoe blossfeldiana,黄色马蹄莲Zantedeschia elliottiana,百合Lilium longiflorum,苹果Malus domestica和阳桃Averrhoa carambola等7种植物为研究对象,采用试管嫁接的方法,进行了草本与木本植物、单子叶与双子叶植物、草本与草本植物的远缘嫁接,并对嫁接成活苗进行简单重复序列区间扩增多态性（inter-simple sequence repeat,ISSR）分析。结果显示,远缘植物之间的不同嫁接组合,嫁接的成活率有很大的差异,草本与草本植物之间、单子叶与双子叶植物之间进行嫁接较草本与木本植物之间的嫁接容易。ISSR分析表明,在大岩桐（接穗） ＋ 鸡冠花（砧木）,鸡冠花 ＋ 大岩桐,长寿花 ＋ 大岩桐,长寿花 ＋ 鸡冠花4个组合中检测到部分嫁接成活苗有来自砧木与接穗的扩增位点,同时还具有不同于两者的特异扩增位点。图2表2参12     

毛竹KDO8PS的原核表达纯化及晶体生长

3-deoxy-D-manno-octulosonate(KDO)8-phosphate synthase(KDO8PS)[EC 4.1.2.16]是KDO生物合成途径中的关键酶。采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以毛竹Phyllostachys edulis新鲜实生苗为材料,分离得到竹子KDO8PS基因。通过对不同物种来源的KDO8PS进行氨基酸序列比对分析和半定量RT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析。将PeKDO8PS基因构建入原核表达载体pET-28a,并在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了KDO8PS的可溶性高表达。经nickel亲和层析和分子筛纯化2种方法对表达蛋白进行纯化。结果分析表明:该基因编码区全长876 bp,可编码291个氨基酸。PeKDO8PS与拟南芥Arabidopsis thaliana等植物来源的KDSA2的基因有很高序列一致性,而与微生物来源的KDO8PS序列一致性较低。分析毛竹各组织中KDO8PS基因的表达结果表明,该基因在根、茎和叶片中均有表达,但在根中相对表达量较高,此表达模式亦同拟南芥AtKDSA2类似。另外,发现KDO8PS在溶液(30 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0,200 mmol·L-1氯化钠)中以二聚体的形式存在,并且初步筛选出该酶晶体生长条件。此结果为PeKDO8PS蛋白的最终结构分析奠定了基础。     

烟草多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

多酚氧化酶(PPO)在高等植物中广泛存在,其利用分子氧催化氧化酚类物质为醌,对植物的抗虫和抗病起着一定的作用,同时它介导的酶促反应也是烤制中烟草褐变的主要原因。本文采用RT-PCR,成功地从野生烟草(Nicotiana tabacum)叶片中克隆出了PPO c DNA序列。序列分析表明,烟草PPO基因ORF长为1773 bp,编码590个氨基酸,基因登陆号为KC540916,烟草与其他物种PPO的核苷酸序列与氨基酸序列同源性达80%以上,并包含两个高度保守的铜离子结合区域。烟草PPO基因的克隆为烟草的抗性研究和褐化反应的控制研究提供了良好的理论基础。     

荔枝、龙眼采后酶促褐变反应化学机理研究进展

荔枝、龙眼采后果皮极易褐变,主要是果皮细胞中多酚氧化酶（PPO）与酚类底物的酶促反应所致。文章系统综述了荔枝与龙眼果实采后PPO酶促褐变机理、褐变底物种类确定与化学结构鉴定、外界条件对酚类底物性质的影响及贮藏期间底物含量变化规律等方面的研究进展,发现除花色素苷类物质外,有关荔枝、龙眼果皮中其他酚类褐变底物理化性质的研究鲜见报道。今后需进一步研究探讨有关酶促褐变底物种类及其化学结构鉴定、外界环境因素如何影响PPO底物性质和酶活性变化、外界环境因素与不同品种褐变过程差异的关系、贮运期间PPO底物含量的变化规律等,为控制荔枝、龙眼果实采后贮运过程中果皮酶促褐变提供理论依据。     

新开发的禾本科通用性分子标记的检测与评估

为开发更多的适用于禾本科Poaceae植物通用性分子标记, 丰富竹类植物的遗传信息, 依据禾本科单拷贝同源基因(COSⅡ)已知序列的保守区域设计了14对引物, 以此引物对刚竹属Phyllostachys植物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增, 并对部分扩增产物进行测序。结果所有引物可以在至少1个材料中得到特异性扩增, 其中7对引物在5个供试材料中均能扩增到产物, 13对引物在5个样本中表现出多态性, 占引物总数的92.9%。对部分扩增产物进行测序, 所测序列均为特异性扩增序列。同一引物在不同样本中的扩增片段间存在单核苷酸多态性(SNP)位点, 部分SNP位点会导致氨基酸序列提前终止或酶切位点变化。对有合适内切酶存在的变异位点进行PCR-RFLP验证, 验证结果与测序结果一致。利用NTsys 2.10e软件, 对5个供试竹种材料进行了亲缘关系分析, 毛竹Phyllostachys edulis与绿粉竹Phyllostachys virdiglaucescens亲缘关系最近, 紫竹Phyllostachys nigra与其他4个竹种亲缘关系最远。所开发的14个COSⅡ引物在刚竹属植物中具一定通用性, 同时挖掘出更多竹类植物中的遗传信息。     

曲酸对鲜切马铃薯与莲藕的褐变及其相关酶活性的影响

以马铃薯(Solanum tuberosum)、莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn)为试材,研究了0.1%、0.3%和0.5%曲酸处理鲜切马铃薯片及莲藕片在模拟货架期(4℃)的色泽及相关酶活性变化。结果表明,曲酸能不同程度地抑制马铃薯与莲藕的多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性。其中,0.3%和0.5%曲酸处理在保持鲜切马铃薯片及莲藕片色泽,抑制PPO,POD,PAL活性的效果好于未经处理的对照及1%柠檬酸的参比处理。未经处理的马铃薯片、莲藕片外观品质保持为5~6d或4~6d,0.3%和0.5%曲酸处理后的马铃薯片与莲藕片的货架期分别达10d或12d,1%柠檬酸的参比处理分别是8~10d或6~8d。     

橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因HbCP2的克隆与表达特性分析

根据EST和基因组序列设计引物,应用RT-PCR技术从橡胶树的根组织中分离到1条长1056 bp的cDNA,该序列包含了1023 bp的开放读码框（ORF）,17 bp的5’UTR和16 bp的3’UTR;ORF预测编码340个氨基酸,理论分子量为37.52 kD,等电点为5.25,属于液泡定位的分泌型蛋白;蛋白含有1个Inhibitor_I29和1个Peptidase_C1A结构域,隶属于木瓜蛋白酶C1家族;蛋白与蓖麻、杨树中同源蛋白的相似性均在80％以上,将基因命名为Hb CP2。表达分析显示,在所分析的根、树皮、木质部、芽、叶片、叶柄和乳管等组织中,HbCP2仅在根中被检测到,表现出明显的组织特异性。     

热激处理对蝴蝶兰组培褐变的抑制及其生理机制

以蝴蝶兰品种Phalaenopsis amabilis BL.‘Jude Butterfly’（B3）组培苗为材料,研究了热激处理对蝴蝶兰叶片外植体组培褐变程度、酚类物质及活性氧代谢相关生理指标的影响,初步探讨了热激处理抑制蝴蝶兰组培褐变的生理机制。结果表明:经热激处理的蝴蝶兰叶片外植体组培褐变程度明显减轻,总酚含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及多酚氧化酶（PPO）活性降低,但对过氧化物酶（POD）活性的抑制效果不明显,说明热激处理通过降低组培叶片的PAL及PPO活性,抑制酚类物质合成及氧化,从而减少褐变产物——醌类物质的形成;另一方面,热激处理可在短时间内提高抗氧化酶活性（主要是超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX））,进而减少丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）的产生,保护了细胞膜结构的完整性,最终有效抑制褐变发生。      

Construction and transformation for the antisense expression vector of the polyphenol oxidase gene in Yali pear

To inhibit the browning process in fruits of Yali pear, in this paper, antisense gene techniques were used to reduce the expression of PPO gene. A cDNA fragment of 450 bp, which is located at the 3′ terminal of the polyphenol oxidase (PPO) gene, was amplified from Yali pear using the RT-PCR method, then the antisense expression vector was constructed by inserting the fragment of the Yali pear PPO gene between the CaMV promoter and NOS terminator of the expression vector pBI121 in a reverse orientation. After that, with the agrobacterium-mediated method, the PPO antisense gene was transformed into Yali pear shoots. Northern blot analysis and enzyme activity assay showed that the PPO activities in the transgenic Yali pear shoots were significantly decreased, compared with the non-transformed Yali pear shoots. This lays a good foundation for breeding new varieties of pears with browning resistance in the future.     

野桑蚕酚氧化酶原基因PPO1的克隆及其特征(英文)

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆野桑蚕(Bombyx mandarina)酚氧化酶原基因PPO1,获得其cDNA序列;该序列长2 086bp,含有一个2 058bp的完整开放阅读框,编码一个由685个氨基酸残基组成的蛋白质;该基因推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO1基因相应的氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的PPO基因所共有的典型特征。RT-PCR检测分析表明该基因仅在野桑蚕的头部和血液中表达,而Northern杂交检测表明该基因仅在血液中有表达。这些结果为进一步研究该基因的功能提供了分子基础。     

不同采烤方式对烤烟上部叶脂质褐变的影响

【目的】明确烤烟上部叶不同采烤方式对烟叶褐变的影响,探索适宜的采烤方式,为提高上部叶可用性提供理论指导。【方法】以正常采烤处理烟叶（CK）、2片叶带茎烘烤（T1）、4片叶带茎烘烤（T2）和6片叶带茎烘烤（T3）的上部叶为试验材料,利用透射电镜、扫描电镜和基因表达量分析技术从细胞结构和基因分子水平层面,探讨采烤方式对上部...