木薯MeERF1.2基因克隆及表达分析

【目的】乙烯响应因子（Ethylene response factor,ERF）是乙烯信号转导通路的重要成员，克隆并分析其在木薯块根采后生理性变质（Post-harvest physiological deterioration,PPD）过程中的表达情况，能为进一步研究乙烯信号在木薯PPD过程中的功能提供参考。【方法】以木薯栽培品种华南8号（SC8）为材料，采用RT-PCR技术克隆木薯MeERF1.2基因，对其进行相关生物信息学分析，如遗传进化关系、结构域、蛋白质结构预测、理化性质等。对MeERF1.2基因在细胞中的亚细胞定位进行确认，并用qRT-PCR技术分析MeERF1.2基因在木薯块根PPD过程中的表达水平。【结果】克隆得到的MeERF1.2基因全长为660 bp，编码的氨基酸残基数为219，分子量和等电点分别为25.04 kD和5.61，含有AP2家族结构域，和橡胶HbERF1B-like的亲缘关系最近，序列相似性达到88.74%。MeERF1.2基因定位于细胞核。和对照0 h相比，MeERF1.2基因的表达量在木薯块根的采后过程中表现为显著上升趋势，即MeERF1.2基因的表...     

白菜TLP基因家族鉴定及表达分析

已有研究表明TLP(Tubby-like protein)蛋白在植物应对非生物胁迫方面具有重要作用。本研究利用生物信息学方法在白菜中鉴定得到14个TLP家族基因，并对其理化性质、基因结构特征、蛋白保守性、系统进化关系、组织表达模式及对盐胁迫的响应情况进行了初步分析。结果表明，该家族基因分布在白菜10条染色体中的7条。蛋白分子量介于38 735.69～52 747.34 D,等电点介于9.16～9.88。基因结构分析表明，有1个TLP基因含有9个CDS,绝大多数基因CDS为4～5个。亚细胞定位预测结果表明，该基因家族成员主要定位在细胞核、线粒体和细胞质基质。启动子顺式作用元件分析表明，该基因家族成员含有包括光响应元件、脱落酸应答元件、厌氧反应应答元件在内的大量逆境胁迫应答元件。组织特异性表达分析发现大多数BrTLPs在花中表达量较高，在茎、叶片和果荚中的表达量与根相似；绝大多数白菜TLP基因对盐胁迫都有不同程度的响应，其中BrTLP14对盐胁迫反应最强烈，暗示该基因可能在白菜响应盐胁迫过程中发挥重要作用。     

硒诱导的黄瓜耐镉转录本鉴定分析及表达载体构建

以黄瓜乙烯响应因子CsERF7转录本为研究对象，通过外源硒缓解黄瓜镉胁迫试验分析其表达及黄瓜生长状况，并克隆CsERF7基因，构建过表达载体转化拟南芥，同时分析CsERF7的理化性质和功能。结果表明，外源硒显著升高了镉胁迫引起的黄瓜生长指标的降低，CsERF7在镉处理下的表达丰度是对照的56%,而镉+硒比单独镉处理上调表达4.53倍，与RNA-seq结果相符，此基因可能在硒调控黄瓜镉胁迫响应中起作用。同时，成功构建超表达载体pEGOEP35S-H-ERF7-GFP,转化拟南芥获得转基因株系。生物信息学分析表明，黄瓜CsERF7基因属于AP2/ERF家族的AP2亚家族，开放阅读框ORF长度588 bp,编码196个氨基酸，有1个AP2结构域；该蛋白属于非跨膜亲水性蛋白，亚细胞定位预测定位在线粒体中，存在22个氨基酸磷酸化位点；其二级结构主要由α-螺旋和延伸链构成，与三级结构预测结果高度一致，所得蛋白序列与黄瓜、甜瓜同源性最高。     

木薯PYL13基因克隆及表达分析

[目的]解析木薯脱落酸(ABA)受体PYR/PYL/RCARs家族基因(MePYL13)在木薯块根采后生理性变质(PPD)过程中的功能作用,为后续探索ABA信号通路在木薯PPD中的功能及作物抗逆育种打下基础.[方法]从木薯品种SC8中克隆MePYL13基因,应用生物信息学分析方法对其编码蛋白的理化性质、亲疏水性、保守结构域及二、三级结构等进行预测,对基因上游启动子进行元件分析,通过亚细胞定位观察MePYL13蛋白在植物细胞中的定位情况,并利用实时荧光定量PCR检测MePYL13基因在木薯PPD过程中的相对表达量.[结果]克隆获得的MePYL13基因编码区(CDS)长度663 bp,编码220个氨基酸,蛋白分子量23.957kD,理论等电点(Ip)为6.74.MePYL13蛋白与巴西橡胶树(XP 021654464.1)PYL家族蛋白的氨基酸序列同源性最高,为91.55%,表明MePYL13蛋白氨基酸序列具有高度保守性.从MePYL13基因启动子鉴定获得与非生物胁迫逆境相关的响应元件,包括厌氧诱导元件(ARE,AAACCA)、光响应元件(ATCT-motif,AATCTAATCC)、干旱MYB元件(MBS,TAACTG)及ABA应答元件(ABRE,AAACAGA)和分生组织表达相关元件(CAT-box,GCCACT)等;MePYL13蛋白在木薯细胞的细胞核和细胞质上均有表达.随着PPD进程的推移,MeP YL13基因相对表达量整体上呈上升趋势,至PPD后期(48 h)其相对表达量是0h时(PPD前)的16倍,即MePYL13基因受木薯块根PPD的显著诱导.[结论]MePYL13基因是PYR/PYL/RCARs家族成员,可能在木薯块根PPD过程中发挥正向调控作用,为培育木薯PPD改良品种提供了潜在基因资源.     

烟草WRKY-R1基因的克隆及瞬时表达分析

以烟草根尖组织cDNA为模板,RT-PCR结合电子克隆得到NtWRKY-R1基因的完整ORF,序列分析显示,NtWRKY-R1具有WRKY转录因子家族典型的WRKYGQK保守结构域及C2H2的锌指结构,属于WRKY转录因子家族第Ⅱ类。采用生物信息学方法对NtWRKY-R1蛋白的理化性质、进化关系和磷酸化位点进行预测和分析,结果表明,NtWRKY-R1与茄科植物保守结构域的同源性及系统进化关系最近;磷酸化位点分析显示该蛋白可能通过磷酸化作用修饰,进而对其相应的代谢活动进行调节。通过构建真核表达载体、建立瞬时表达分析体系,结果显示,NtWRKY-R1基因的过表达导致JA信号途径标记基因PDF1.2及烟碱合成关键酶基因PMT1表达量降低,推测NtWRKY-R1基因影响JA信号途径,进而调控烟碱合成。     

木薯赤霉素途径DELLA蛋白基因克隆及其对干旱胁迫的响应

赤霉素(GA)信号转导途径是通过DELLA抑制蛋白来调控的.笔者利用拟南芥DELLA蛋白基因序列,通过电子克隆方法首次克隆了1个木薯DELLA蛋白基因,长度为1 857 bp,具有完整的蛋白编码框的cDNA序列,命名为MeGAI.生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥DELLA蛋白一样的保守结构域,如DELLA结构域、VHYNP结构域、POLY(S/T)结构域、核定位信号、VHVID结构域、亮氨酸结构域、GRAS结构域;该基因在干旱胁迫下的表达模式研究结果表明,该基因在干旱胁迫下是下调表达的;GA生物合成重要基因GA20-氧化酶基因在干旱胁迫下的表达模式研究结果表明,两者在干旱胁迫下的表达模式具有良好的相关性,这说明GA途径可能参与木薯抗旱机制.     

木薯ERF转录因子调控的靶基因筛选与表达分析

为解析乙烯响应因子（ERF, Ethylene Response Factor）在木薯（Manihot esculenta）生长发育过程中的调控通路,本研究从木薯全基因组数据库中,筛选出启动子区含有GCC-box顺式作用元件的基因204个,利用生物信息学手段对这些基因进行染色体位置分布分析、病原菌侵染下表达模式分析以及启动子结构预测,部分候选基因的qRT-PCR结果表明:Manes.02G189600,Manes.03G039700,Manes.06G002000,Manes.09G063700,Manes.14G141600,Manes.15G181900可能参与调控植物的抗病途径,同时在乙烯介导的信号传递途径中也起重要作用。     

木薯SR45亚家族基因鉴定及表达

目的 精氨酸和丝氨酸富集蛋白(Arginine/serine-rich proteins,SR)为剪接复合体的主要成员,不仅参与植物前体mRNA可变剪接过程,在植物非生物胁迫中也具有相当重要的作用。SR45基因为SR基因亚家族成员之一。本研究旨在分析木薯SR45亚家族成员蛋白结构特征与表达模式,为进一步了解该亚家族基因在木薯中的功能提供理论支持。方法 利用生物信息学技术重新构建木薯SR基因家族进化树,对木薯SR45亚家族蛋白理化性质、基因结构、保守结构域进行分析,同时利用转录组数据分析低温与干旱胁迫下SR基因表达变化,运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)研究各基因成员在不同组织中的特异性表达以及对低温胁迫的响应。结果 木薯SR基因家族共7个大类26个成员,SR45亚家族共有5个成员;SR45亚家族基因编码蛋白长度为135~423 aa,相对分子质量为14970~47210,等电点为5.19~12.34;预测其主要定位于细胞核和叶绿体;SR45编码RS结构域和RRM结构域,具有Motif 3、Motif 6、Motif 2和Motif 1保守基序。转录组数据和RT-qPCR分析表明,SR45基因均响应木薯低温胁迫,且MeSR45-2显著上调表达,MeSR45-4、MeSR45-5在木薯根和叶中有较高表达量。结论 木薯SR45亚家族基因显著响应低温胁迫;将MeSR45-2基因列为调控低温逆境变化的候选基因,将根和叶列为研究SR45基因亚类成员的主要组织。本研究为探索木薯SR45基因奠定了理论基础,并为进一步研究木薯SR45基因逆境胁迫应答过程指明了方向。     

木薯ETR1基因克隆及表达分析

[目的]克隆木薯乙烯受体基因(MeETR1)并检测其在木薯采后生理性变质(PPD)过程中的表达情况,为研究ETR基因家族在木薯PPD过程中的功能作用提供参考依据.[方法]以木薯品种华南8号为材料,应用PCR扩增MeETR1基因编码区(CDS)序列,采用生物信息学分析方法对其编码蛋白的理化性质、亲/疏水性、保守结构域及二、三级结构等进行预测分析,通过亚细胞定位确定MeETR1蛋白在植物细胞中的表达分布,并利用实时荧光定量PCR检测MeETR1基因在木薯采后PPD过程的表达情况.[结果]克隆获得MeETR1基因CDS序列全长2220 bp,共编码739个氨基酸,蛋白分子量为82.88 kD,理论等电点(pI)为6.76;MeETR1基因编码蛋白属于疏水蛋白,含有ETR1家族4个典型模块,即GAF结构域、HisKA结构域、HATPase_c结构域和REC结构域;其二级结构中α-螺旋占47.43%、延伸链占14.46%、无规则卷曲占38.11%.MeETR1氨基酸序列(XP_021625986.1)与同属大戟科的蓖麻(Ricinus communis)ETR1氨基酸序列(XP_002533252.1)相似性为92.42%,亲缘关系较近;MeETR1蛋白定位在细胞质中.与0 h(PPD前)相比,MeETR1基因的相对表达量在木薯采后PPD过程中(12、24、48和96 h)均呈显著下降趋势(P<0.05),即MeETR1基因表达受木薯采后PPD过程的抑制.[结论]MeETR1基因编码蛋白含有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4个典型的结构域,与其他植物ETR1在生物学功能上具有一致性;MeETR1基因表达在木薯采后PPD过程中受抑制,可能在此过程中发挥负调控作用.     

木薯过氧化物酶基因序列分析及其乙烯和茉莉酸甲酯诱导表达特性

[目的]分析木薯Class Ⅲ过氧化物酶(POD)基因(MePOD)的序列特征,并检测乙烯(ET)和茉莉酸(JA)逆境信号对其表达的影响,为研究木薯对逆境胁迫的响应和调控模式及培育抗逆新品种提供理论依据.[方法]从木薯基因组数据库中获取MePOD基因序列并进行分析;以木薯品种华南8号悬浮培养细胞为材料,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测木薯MePOD基因在乙烯利和茉莉酸甲酯(MeJA)处理后的表达特性.[结果]MePOD基因编码区含4个外显子和3个内含子;转录起始位点位于起始密码子上游1061 bp处;启动子区域含多个顺式作用元件,但无ET和JA响应元件.MePOD蛋白由33 1个氨基酸组成,分子量为37.476kD,理论等电点为8.66;有一个含信号肽的跨膜结构,是一种阳离子分泌型Class Ⅲ POD.系统发育进化树分析结果表明,木薯MePOD蛋白与大戟科橡胶树(Hevea brasiliensis,ADR70870.1)的亲缘关系最近,且除两种裸子植物外,其他17种被子植物聚为一类,且同一科植物进一步相聚,此结果与进化地位一致.和CR检测结果表明,MeJA涛导0.5 h后,MePOD基因表达量整体上呈先升高后下降的变化趋势,而乙烯利诱导0.5h后其表达量呈缓慢上升的变化趋势,但整体上维持在本底水平之下.[结论]JA和ET逆境信号不直接通过相应响应元件上调MePOD基因表达,而与其他激素信号进行综合调控,并进一步参与植物体内的抗氧化过程.