豆天蛾核型多角体病毒gp41同源基因的克隆和序列分析

 【目的】对豆天蛾核型多角体病毒（CbNPV）的gp41同源基因进行克隆和序列分析，为进一步研究该病毒基因组的结构打下基础。【方法】从豆天蛾幼虫尸体中分离纯化了豆天蛾核型多角体病毒，提取其基因组DNA，用shotgun法构建了DNA片段的文库，并进行了全基因组测序。对CbNPV的gp41同源基因进行序列分析。【结果】CbNPV的gp41同源基因长度为933 bp，编码310个氨基酸。氨基酸序列同源性分析结果表明，CbNPV GP41与I类NPV及II类NPV GP41的同源性分别为53%～61%和56%～73%。【结论】初步推测，CbNPV与II类NPV的亲缘关系可能更近。     

豆天蛾核型多角体病毒泛素基因的序列分析

为了对CbNPV ubiquitin基因序列进行分析,并对目前已知全基因组序列的杆状病毒的泛素氨基酸序列进行比较。从豆天蛾幼虫尸体中分离纯化豆天蛾核型多角体病毒(CbNPV),提取基因组DNA,进行基因组测序。序列分析发现一个长度为252 bp的读码框序列与泛素基因同源性很高,该基因编码83个氨基酸。氨基酸序列同源性分析结果表明,CbNPV泛素的氨基酸序列与20种杆状病毒泛素的氨基酸序列的同源性在66.3%~82.1%,并且维持泛素功能所必需的氨基酸序列,在大部分杆状病毒中也都保守存在。     

新分离的豆天蛾核型多角体病毒sod基因的序列分析

从感病的豆天蛾幼虫中分离和纯化了一种新的豆天蛾核型多角体病毒(CbNPV).为进一步了解该病毒的分子生物学特征,提取了基因组DNA,采用Shotgun方法构建了病毒DNA的文库,对其中一些克隆分析发现一长度为465 bp的读码框,编码154个氨基酸,在GenBank中没有发现同源性极高的核苷酸序列.但该基因的编码产物与sod基因同源性较高,与NPVs及GVs的同源性分别为67%～82%和54%～59%,并且更接近于II类NPV.在CbNPVsod基因的氨基酸序列中一些与SOD活性相关的位点及维持空间构型二硫键的位点均保守.CbNPV的全基因组序列有待进一步解析.     

豆天蛾核型多角体病毒光解酶变异基因序列的解析

对新近发现的豆天蛾核型多角体病毒(CbNPV)进行分离纯化,提取其基因组DNA,用Shotgun法构建了DNA片段的文库,并进行了全基因组测序.根据序列分析的结果,发现了一段长为1 694 bp的光解酶类似基因序列,但与已报道的杆状病毒光解酶基因序列相对比,发生了一个碱基的缺失,从而使其分裂成2个小的读码框:Cbphr-1,和Cbphr-2.结构域分析结果表明,所有已知DNA光解酶都具有的CPD-DNA光解酶结构域和FAD-结合结构域在CbNPV中也存在.     

家蚕核型多角体病毒ORF 75基因的生物信息学分析

通过对家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori,nucleopolyhedrovirus:BmNPV)ORF 75基因核苷酸序列进行生物信息学分析,BmNPVORF 75基因位于病毒基因组70 485 bp和71 264 bp之间,编码259个氨基酸残基的多肽,预测分子相对质量为30.8 kDa,等电点为7.67,分子式为C1409H2157N351O390S19;蛋白在大肠杆菌内的半衰期大于10 h;酸性氨基酸(Asp Glu)占10.5%,碱性氨基酸(Arg Lys)占10.8%;蛋白的不稳定指数为42.67,是不稳定蛋白.利用Prosite数据库扫描,查到4类9个蛋白修饰位点.通过Blast搜索氨基酸同源序列发现,BmNPVORF 75同源蛋白存在于所有测序的鳞翅目昆虫杆状病毒中,不存在于其他非鳞翅目昆虫杆状病毒中.同源序列比对结果,BmNPVORF75蛋白的氨基酸序列与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica MNPV)ORF92之间的同源性达到100%,应为相同基因.依照BmNPVORF75同源基因序列相似性,对13种昆虫杆状病毒进行进化树构建分析,其中,BmNPVORF75与薄荷灰夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒(Rachiplusia ouMN-PV)ORF89基因进化距离很近,同源性较高.     

茶尺蠖核型多角体病毒SalI 1.1 k片段的克隆及gp41部分序列分析

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)是尚未完成基因组测序的一种杆状病毒.为了解其基因组的信息,从病虫中分离纯化了茶尺蠖NPV,提取基因组DNA,构建了EoNPV DNA的SalI酶切片段文库,并对阳性克隆进行测序,获得了EoNPV gp41基因的部分序列.序列同源性分析结果表明,EoNPV与LdMNPV之间gp41基因的同源性较高,而与AcMNPV及BmNPV的同源性较低.     

2006—2007年陕西省古典猪瘟流行毒株E0基因的克隆及序列分析

根据GenBank上发表的古典猪瘟参考毒株Shi men毒株全基因组序列,设计并合成2对引物,采用巢式RT-PCR技术,从陕西省猪病料中成功扩增出9株猪瘟流行毒株E0全基因并测定其核苷酸序列,与已发表的ALD、Alfort187、Brescia、C HVRI、CAP、Shi men、GXWZ02和HCLV等代表毒株进行同源性比较分析。核苷酸分析表明:这9株猪瘟流行毒株可以分为2大群,1株(LN163)属于群I,与Shi men强毒株、HCLV疫苗株和GXWZ02野毒株等代表株的同源性为80.8%~82.4%;另外8株属于群II,毒株之间E0基因核苷酸序列的同源性为93.6%~99.6%。氨基酸序列分析表明:9株流行毒株中,群I中的LN163毒株与我国野毒参照株GXWZ02的同源性只有83.9%,而其余8株与GXWZ02株氨基酸序列的同源性为94.4%~98.1%,形成明显不同的进化分支;同时这9株流行毒株与我国疫苗株HCLV和经典强毒株Shi men的氨基酸序列同源性分别为88.0%~89.5%和89.1%~91.8%,均呈现较明显的变异。     

一株新城疫病毒分离株全基因组序列的克隆与分析

根据GenBank上所公布的新城疫病毒(NDV)的全基因组序列,设计了10对引物,运用RT-PCR方法获取了三黄鸡新城疫病毒(SHJ00株)全基因组序列,并对其进行了比较分析。结果表明:此株三黄鸡新城疫病毒(SHJ00)的全基因组序列由15 192个碱基组成,在NP基因和P基因之间的非翻译区多了6个核苷酸ACACTC;与NDV一致,SHJ00基因由6个ORF组成,即3′-NP-P-M-F-HN-L-5′;测序后拼接的F基因长1 672 bp,包含完整的开放阅读框(1 662 bp),编码553个氨基酸,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,具有强毒株序列特性;根据NDV基因分型标准,三黄鸡新城疫病毒SHJ00株归属基因Ⅶ型新城疫病毒;F基因与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为80.9%~97.7%,其中与F48E9同源性为84.3%,与Lasota的同源性为82.0%;测序后拼接的HN基因长为1 716 bp,编码571个氨基酸,与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为80.0%~98.1%,其中与F48E9同源性为84.5%,与Lasota的同源性为81.4%。     

鸡新城疫病毒融合蛋白基因的克隆及进化分析

根据GeneBank中报道的NDV融合蛋白基因(F)序列,设计了一对特异性引物,用该引物对NDVLN-SN株进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-F,用于核苷酸序列测定。结果该基因ORF长1662bp,编码553个氨基酸;将LN-SN毒株与GeneBank中已报道的NDV毒株进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在83.4%~99.9%之间,推导的F蛋白氨基酸序列的同源性在88.4%~99.8%之间。     

杆状病毒泛素蛋白的序列及分子进化分析

[目的]分析杆状病毒泛素蛋白的序列特征和分子进化。[方法]运用ClustalW软件进行序列多重联配分析,采用临近法（NJ）和最大简约法（MP）构建系统进化树。[结果]昆虫杆状病毒泛素与真核生物泛素的一致性为73%～86%,差异体现在氨基酸15～32和53～57的序列上,其他序列高度保守。在真核生物泛素蛋白序列中,许多功能性的氨基酸残基在昆虫杆状病毒泛素蛋白序列中也存在。系统进化分析将昆虫杆状病毒和真核生物泛素蛋白大致分为3个亚家族,即GV族、I族和II族。杆状病毒泛素基因采取负选择的进化方式,在长期的进化过程中,其氨基酸序列倾向于逐渐被固定下来,达功能和结构上的稳定。[结论]分析杆状病毒泛素的序列特征和分子进化,为进一步研究其生物学功能提供参考。     

Cloning and Sequence Analysis of the gp41 Gene of Clanis bilineata Nuclear Polyhedrosis Virus

Clanis bilineata Nucleo Polyhedro Virus （CbNPV） was purified from Clanis bilineata larva. To obtain the molecular information of the virus, the genomic DNA of CbNPV was extracted, and a DNA fragment library of the virus was constructed using shotgun. The positive clones were then sequenced and analyzed. An open-reading frame （ORF） that has high identity with the gp41 gene of most NPVs was found in the library. The gp41 gene of CbNPV is 933 base pair long and encodes a protein of 310 amino acids. The result of the amino acid sequence analysis showed that the CbNPV gp41 has 53-61 and 56-73% identities with Group 1 and II NPVs gp41 proteins, respectively. The result indicates that the isolated CbNPV is a novel baculovirus, and the CbNPV shares a much closer relationship Ⅱ NPVs.     

棉铃虫多核衣壳型多角体病毒fp25K基因的克隆及分析

[目的]克隆棉铃虫多核衣壳型多角体病毒(HearMNPV) fp25 K基因,为深入研究杆状病毒的进化机制提供依据。[方法]通过半补齐法建立HearMNPV的质粒基因组文库,对插入片段进行鉴定和序列分析获取HearMNPV fp25 K基因。[结果]HearMNPV fp25 K基因的读码框由588个核苷酸组成,编码195个氨基酸;该基因上游具有晚期调控保守序列ATAAG,是一个晚期表达基因;HearMNPV fp25 K存在5个α-螺旋,8个β-折叠;HearMNPV与蓓带夜蛾核型多角体一致性最高,达97.0%,与舞毒蛾多核衣壳型多角体的FP’同源性最低,仅为19.3%。HearMNPV与GroupⅠNPVs、GroupⅡNPVs及GVs的fp25K同源基因间氨基酸平均相似性分别为55.6%、69.4%和29.3%,推测其与Ⅱ类NPVs的亲缘关系较近。[结论]该研究为杆状病毒分子进化、生物防治奠定了基础。     

3株鸽源新城疫病毒陕西分离株F基因的克隆与序列分析

对3株鸽源性新城疫病毒F基因进行扩增和序列分析,探讨分离毒株相互之间以及与疫苗毒之间的遗传进化关系.采集病料,通过非免疫鸡胚接毒传代分离病毒,HA及HI试验鉴定其为ND病毒;设计特异性引物,RT-PCR扩增分离ND病毒F 基因的重要功能区片段(1 395 bp),并对其进行克隆、测序及序列分析.结果表明:3株鸽源NDV陕西分离株相互之间F 基因核苷酸序列的同源性在98.0%～99.3%,氨基酸序列同源性为98.5%～99.1%;其F 基因裂解位点的氨基酸组成与NDV 强毒株的特征性结构(112 R-R-Q-K-R-F117 )一致.系统发育进化树表明,此3 株强毒株与某贵州分离株(登录号:EF589137) 高度同源,处于进化树的同一分支,属于基因Ⅵ型.分离到的3株鸽源NDV之间同源性较高,鸡胚病变和序列分析表明其为强毒,与传统的La Sota,B1等疫苗株同源性很低.     

新城疫病毒河北分离株F基因的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术扩增和克隆2003—2007年由河北省分离到的、具有一定代表性的鸡新城疫病毒分离株F基因,与GeneBank中已发表的NDV不同基因型代表株F基因相应核苷酸片段及其氨基酸序列进行比较,构建系统发育进化树并确定分离株的毒力强弱及所属基因型。结果显示,分离株在该区段没有碱基缺失和插入,但有多处点突变分散存在。分离株F基因核苷酸序列与国内外已发表毒株相应序列核苷酸同源性为80.5%~98.5%,推导的氨基酸序列同源性为77.5%~97.7%。表明目前河北新城疫的流行以基因Ⅶ型为主,同时兼有传统的基因Ⅵ型和基因Ⅱ型。     

蛹虫草在豆天蛾上的接种试验

[目的]探讨蛹虫草在豆天蛾幼虫和蛹上的接种效果。[方法]以豆天蛾幼虫和蛹为寄主,进行蛹虫草接种试验,比较不种接种方法对豆天蛾幼虫和蛹感染虫草菌种的影响及接种效果。[结果]不同接种方法对豆天蛾幼虫和蛹感染虫草能力有影响。从感染虫草菌能力方面看,用浸过虫草液体菌种的洋槐叶饲喂的豆天蛾幼虫为寄主进行的接种试验的效果最好,其次为以放置在已经发满菌丝的固体培养基上并用洋槐叶饲喂的豆天蛾幼虫为寄主进行的接种试验;而豆天蛾蛹上接种的最佳方法为注射50山的液体菌种。[结论]该研究为蛹虫草寻求廉价的寄主和工厂化生产提供了理论依据。     

豆天蛾幼虫保藏研究(英文)

In order to solve the seasonal supply problem of Clanis bilineata Walker larvae,effects of larva instar,time and temperature on larvae preservation were studied in this experiment.The results indicated that the 5th instar mature larvae had the best preservation durability,and their optimum preservation condition was 2-4 ℃ with a upper time limit of 8 months.     

一株鸡新城疫病毒的分离与鉴定

从广东某发病鸡场分离鉴定出1株鸡新城疫病毒,采用RT-PCR法扩增出包括裂解位点在内的部分F基因,对其进行序列测定后与GenBank中的毒株进行比较。结果表明：所克隆片断长度为463bp;F基因的裂解位点序列为112R-R-Q-K-R-F117,并且第101位为K（赖氨酸）,121位为V（缬氨酸）,具有基因Ⅶ型副粘病毒强毒株的特征序列;分离株与Lasota株同源性为81.2%,与我国标准强毒F48E9的同源性只有82.4%,表明该基因已经发生了变化。     

豆天蛾幼虫肠道细菌分离及初步鉴定研究

豆天蛾是豆类作物生产过程中的一种重要害虫,也是一种重要的食用昆虫资源,在山东省、江苏省的部分地区已形成特色菜肴。本文从人工饲养种群的老熟幼虫肠道环境中分离、纯化、培养,获得细菌8个菌株,对其菌体形态、染色反应、培养性状、生理生化反应进行厂系统研究。鉴定结果表明：1号细菌菌株属于纤维单胞菌属(Cellulomonas)；2、3号菌株暂小能确定所属地位,分别记为Clanis bilntata(L_2)、Clanis bilineata(L_3)；4～7号细菌菌株分别属于地杆菌属(Terrabactcr)、短状杆菌属(Brachybactefium)、李斯特氏菌属(Listefia)、丙酸杆菌属(Propi- onibactefium)；8号菌株为枯草芽孢杆菌(Baciplus subtilis)。不同细菌属之间在豆天蛾幼虫肠道环境中存在数量方面的明显差异。