甘蓝中硫氧还蛋白编码基因THL1的分子特性及表达研究

采用PCR和RT2PCR技术, 以‘E1’甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对THL1基因进行扩增克隆, 得到的片段长度分别为732 bp和455 bp。序列分析表明, 克隆的DNA和cDNA序列与甘蓝‘西园四号’THL1的DNA和cDNA同源性分别为97.9%和98.3%, 两条序列内含子的大小不同; 同时, 前者第2内含子不符合典型的GT2AG规则: 即第2个内含子3′端碱基为AT。将THL1基因cDNA序列定向克隆到原核表达载体pET-43.1a ( + ) , 构建融合表达质粒pET43.1a ( + ) -THL1, 在大肠杆菌BL21中表达出分子量为74kD的融合蛋白, 经胰岛素检测, THL1有氧化还原活性, 表明THL1在大肠杆菌中得到了正确表达。     

菜薹BcAMT1;4启动子的克隆及活性分析

以菜薹(Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee)为材料,利用染色体步移法获得了铵转运蛋白基因BcAMT1;4的ATG上游长度为2 086 bp的启动子序列。生物信息分析表明,该启动子中包含多个光信号、激素信号、逆境应答、组织特异表达等顺式作用元件。构建该启动子与GUS基因的融合表达载体,并用农杆菌介导法转化拟南芥。通过对T3代转基因拟南芥植株GUS活性分析发现,GUS染色主要集中于叶片,而在根、茎、花中染色较浅。此外,不同氮源也影响BcAMT1;4启动子的活性,缺氮处理提高了转基因拟南芥GUS表达活性,而分别供0.25 mmol·L^-1 NO₃^-、NH₄⁺和NH₄NO₃的处理在一定程度上抑制其表达活性。研究结果表明,BcAMT1;4可能对菜薹叶片铵态氮营养具有重要调控作用。     

一个辣椒肌醇半乳糖苷合成酶同源基因的全长cDNA克隆与低温表达分析

采用RT-PCR结合RACE技术,从低温处理的辣椒(Capsicum annuum L.)品种“苏长红”叶片中克隆得到一个肌醇半乳糖苷合成酶同源基因（GS）的cDNA序列(GenBank登录号：EF566470), 其全长1 444 bp, 推断其编码336个氨基酸。序列分析表明该基因与其他高等植物的GS基因具有较高的同源性。利用RT-PCR技术分析辣椒受低温胁迫后该基因的表达情况,发现该基因常温下在辣椒各组织中均无表达,经4 ℃或10 ℃处理6 h后在叶片中开始表达,而茎和根系中无论低温处理与否均不表达。Southern杂交结果表明辣椒基因组中还存在其他GS同源基因。     

RNAi沉默BcMF3基因对菜薹花粉发育的影响

根据从白菜(Brassica campestris ssp. chinensis var. communis) 核雄性不育两用系中分离到编码果胶甲酯酶( PME) 的雄性不育相关基因BcMF3 cDNA序列设计引物, 从白菜花蕾cDNA中扩增出一短一长两个片段, 分别反向和正向连接至双元载体pB I12 l中, 得到了RNAi (RNA interference) 植物表达载体pB I2B3R, 并导入农杆菌LBA4404菌株中; 通过组织培养途径转化菜薹(B. campestris ssp. chinensis var.parachinensis) , 分子检测证明B cM F3片段单拷贝整合到转基因菜薹的基因组中; 50%转基因菜薹植株的花粉畸形, 花粉离体萌发率为32。3% , 出现畸形花粉植株的花药PME活性降低了13。5%。这一结果从转基因植株后代的表型和酶活性上证明, 采用RNAi技术沉默BcMF3基因, 可能通过影响PME活性而引起转基因菜薹植株部分花粉的败育, 从而证明BcMF3基因在普通白菜和菜薹等植物的花粉发育中起着重要作用。     

菜薹蛋白精氨酸甲基转移酶基因BrcuPRMT5的克隆及表达分析

以‘油青49’和‘油青甜菜薹80’菜薹茎尖为材料,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得组蛋白甲基转移酶基因Brcu PRMT5的全长cDNA和gDNA序列。BrcuPRMT5 cDNA序列全长为2 117 bp,其中完整开放阅读框为1 929 bp,编码642个氨基酸,相对分子量为71.55 kD,理论等电点(p I)为5.87;多序列比对结果表明,Brcu PRMT5编码的氨基酸序列含有高等植物PRMT5基因1个高度保守的结构域;系统发育分析结果显示与大白菜、油菜及甘蓝的亲缘关系最近;亚细胞定位软件分析得知,Brcu PRMT5蛋白无跨膜区域,可能定位于线粒体中;对应的gDNA全长为4 151 bp,含有23个外显子和22个内含子,最长的外显子长度为140 bp,内含子的长度范围为50~150 bp。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析基因的表达,BrcuPRMT5在菜薹不同组织中均有表达,其中在花中表达量最高,叶次之,根中最低;BrcuPRMT5从苗期至完全抽薹开花期的表达量呈现上升趋势。BrcuPRMT5在菜薹花发育过程中可能起一定的调控作用。     

甘菊BADH基因启动子的克隆与瞬时表达分析

为了给菊花 [Dendronthema ×grandiflora (Ramat.) Kitam.] 的转基因育种提供诱导型启动子,借鉴5′RACE策略,利用锚定PCR步移的方法克隆了甘菊 [Dendranthema lavandulifolium (Fisch. ex Trautv.) Makino] 甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase,BADH）基因的4个启动子序列,分别命名为DBP11、DBP12、DBP21和DBP22（GenBank登录号：DQ497620~DQ497623）,序列长度分别为1 230、1 249 、1 273 和574 bp。4个启动子序列对应区域的同源性在89%以上。其中DBP12和DBP21分別是甘菊BADH基因DlBADH1和DlBADH2（GenBank登录号：DQ011151和DQ011152）的启动子序列,DBP11和DBP22为甘菊BADH基因家族中其它成员的启动子序列。序列分析表明,上述启动子序列中均含有多处与水分胁迫和脱落酸诱导相关的顺式作用元件。在表达载体pCAMBIA1305.2的基础上,用所克隆的4个甘菊BADH基因启动子序列分别置换驱动其报告基因表达的35S启动子,建立了新的植物表达载体。用其转化农杆菌,并用叶盘法侵染甘菊,瞬时表达的结果表明,这些启动子序列均具备驱动报告基因表达的功能。     

‘黄冠’梨类甜蛋白编码基因PbPR5的克隆及其表达特性分析

【目的】分离和克隆类甜蛋白基因Pb PR5,了解其在‘黄冠’梨不同组织、不同发育阶段以及受到非生物胁迫和植物生长调节剂处理时的表达情况。【方法】以‘黄冠’梨(Pyrus bretschneideri‘Huangguan’)组培苗为试验材料,从水杨酸(salicylic acid,SA)处理的c DNA文库中克隆获得该基因全编码区序列,命名为Pb PR5,对其进行生物信息学分析,并研究该基因在盐、聚乙二醇(EG6000)、SA和乙烯(ETH)处理后的表达情况;以12 a生‘黄冠’梨的叶片和果实为材料,探究该基因在叶片和果实不同发育阶段的表达模式。【结果】Pb PR5的c DNA序列长度为741 bp,编码224个氨基酸残基;该基因的基因组DNA序列长度为813 bp,包含1个内含子。生物信息学分析表明,Pb PR5蛋白与其他植物PR5基因编码的氨基酸序列相似性较高。实时荧光定量PCR分析表明:Pb PR5基因在‘黄冠’梨组培苗的根,茎,叶中均能表达,其中根部的表达量高于茎和叶;盐和干旱胁迫诱导了该基因表达,根和茎中的表达高峰均出现在处理后6 h,叶在盐胁迫后24 h和干旱后12 h出现表达高峰;SA和乙烯也诱导了该基因在叶片中的表达。在不同发育阶段的叶片中,老叶表达量最高,成熟叶次之,幼叶中不表达;在不同发育阶段的果实中,成熟果实中表达量最高,幼果期和膨大期果实表达量较低。【结论】Pb PR5基因在‘黄冠’梨各组织中非组成型表达,并且在‘黄冠’梨抵御生物和非生物胁迫过程中可能具有重要的生物学功能。     

荔枝多酚氧化酶基因启动子克隆与功能分析

【目的】获得多酚氧化酶(PPO)基因启动子序列并初步分析其功能,为进一步研究PPO基因表达规律及应用PPO基因启动子提供基础。【方法】通过TAIL-PCR和接头PCR方法相结合获得荔枝PPO基因启动子序列并进行生物信息学分析,序列缺失结合瞬时表达法分析核心启动子调控元件。【结果】从‘妃子笑’荔枝基因组中克隆获得了1048bp的荔枝PPO基因启动子序列,含有多种顺式作用元件。不同长度的启动子序列均能驱动GUS基因在‘妃子笑’、‘无核’和‘紫娘喜’荔枝叶片和果皮中表达,但都不能驱动GUS基因在‘妃子笑’和‘紫娘喜’荔枝种子中表达。【结论】获得了荔枝PPO基因启动子序列并获得了其调控基因表达的部分规律。     

蝴蝶兰AP2/ERF家族基因的克隆及在低温下表达特性分析

用RT-PCR方法从‘大辣椒’蝴蝶兰叶片中克隆得到4个AP2/ERF家族基因，命名为PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4。蛋白结构域和序列比对发现PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4均含有1个AP2结构域， PhAP2/ERF2还含有1个B3结构域。进化树分析表明4个蛋白与兰科AP2/ERF家族成员亲缘关系最近，PhAP2/ERF1属于AP2/ERF家族DREB亚家族中的A1类，PhAP2/ERF2属于RAV亚家族，PhAP2/ERF3属于ERF亚家族的B4类，PhAP2/ERF4属于DREB亚家族中的A2类。用实时荧光定量PCR方法检测低温驯化和低温胁迫条件下PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4在‘大辣椒’和‘富乐夕阳’蝴蝶兰叶片中的表达特性，结果表明：4个基因在‘大辣椒’叶片中的表达趋势一致，表达量在低温胁迫早期达到最高，在胁迫中晚期有所下降；而4个基因在‘富乐夕阳’叶片中的表达趋势有较大差异，PhAP2/ERF1和PhAP2/ERF2的表达在低温处理整个过程中没有被诱导或仅有较小幅度增加，PhAP2/ERF3对低温的响应时间显著晚于‘大辣椒’，PhAP2/ERF4的表达趋势与‘大辣椒’差异较小。蝴蝶兰AP2/ERF在抗冷品种‘大辣椒’和不抗冷品种‘富乐夕阳’叶片中的表达差异暗示AP2/ERF基因家族在蝴蝶兰低温胁迫响应中起重要调控作用。     

柿花发育相关的MADS2box基因克隆与表达

以雌花型柿(Diospyros kaki) ‘阳丰’花为试材, 克隆得到一个与其花发育相关的MADS2box基因, 命名为DkMADS1, GenBank登录号为DQ412058。该基因cDNA全长1 193 bp, ORF为747 bp, 编码一个含有249个氨基酸的蛋白。DkMADS1 具保守的MADS区及半保守的K区, 与其它植物中的MADS2box蛋白有很高同源性。RT-PCR表达分析表明, 该基因在‘阳丰’花的萼片、花瓣、子房和‘禅寺丸’的雄蕊中均有表达。     

石河子地区乌塌菜和京水菜温室引种试验

为丰富新疆地区秋、冬季设施栽培的不结球白菜品种类型,将乌塌菜、京水菜在新疆石河子温室内进行引种试验,对其生育期、生长势、植物学性状、经济性状、产量等进行调查研究。结果表明:乌塌菜、京水菜生长健壮,综合性状表现优异,能够适应当地秋、冬季节的温室栽培环境,可以进一步进行区域试验。     

尿素配施氯化铵对菜薹硝酸盐积累的影响

利用盆栽试验研究尿素配施不同比例的氯化铵对菜薹(菜心)硝酸盐积累的影响,结果表明:氯化铵能显著减少栽培基质中亚硝酸细菌的数量,抑制硝化作用的进行。尿素与氯化铵配合施用能显著降低菜心硝酸盐含量,降低效应随着配施氯化铵比例的增加而增加。     

白菜离体春化相关基因表达的cDNA-AFLP分析

 借助cDNA-AFLP技术分离到15个与白菜离体春化反应相关的表达序列标签( EST) 。Blast结果表明: 低温春化处理抑制性表达的12个EST, 多与异化作用相关基因同源性较高; 春化诱导表达的3个EST, 分别与编码核糖体蛋白的亚基(或与自主开花途径相关的FAC基因连锁的因子) , ATPase的亚基,小G - 蛋白亚基的基因同源性较高。     

利用DAD1反义片段转化创建菜薹可调控雄性不育材料

 菜薹因为没有好的雄性不育材料或自交不亲和系,至今尚无一代杂种用于生产,根据拟南芥及白菜型油菜的花药不开裂基因DAD1的保守序列设计引物,扩增菜薹的DAD1基因片段（DAD1F）,构建反义DAD1F植物表达载体,用农杆菌介导法转化菜薹,对转基因植株进行分子检测,鉴定其雄性不育性并进行育性恢复试验.克隆得到的菜薹的DAD1基因片段大小为678 bp,命名为BrcpDAD1F,其序列与拟南芥和白菜型油菜的DAD1高度同源,同源率分别为88％和99％;共得到了12株转基因植株,有6株在转录水平上得到表达,表现为雄性不育,花器官畸形,花粉活力低,萌发率不到10％,且开花后不能结角果或结空角果,或者得到极少种子但种子不萌发;用对照的花粉给转基因植株授粉可使其正常结实.以500 μmol·L^-1茉莉酸甲酯处理可使其雄性不育得到恢复,花粉可以在柱头和培养基上萌发,具有受精能力。T₁代可育株与不育株的比例都呈1:3分离, T₂代不同株系的育性分离比例不同,有些株系继续呈1:3的分离,有些株系全是可育株或全是不育株,说明反义抑制呈单基因稳定遗传。     

白菜S位点糖蛋白基因的克隆与表达分析

 以白菜自交不亲和系为材料,采用RT-PCR技术,用特异引物对SLG基因进行克隆,获得SLG基因cDNA序列长度为1 324 bp,命名为BcSLG。序列分析表明：所获得的白菜BcSLG基因cDNA序列包含一完整的编码框,编码432个氨基酸,含有12个保守的半胱氨酸残基和7个N-糖基化位点。序列比对和系统进化分析表明：BcSLG与其它植物的SLG基因氨基酸序列具有较高的同源性,与大白菜和甘蓝亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明：BcSLG基因在自交不亲和系的柱头中表达量最高,其次是花蕾,叶片中表达最低, 在自交亲和系的柱头、花蕾和叶片中相对表达较低。     

红菜薹栽培与育种研究进展(上)

从红菜薹的品种资源、遗传育种、良种繁育以及栽培生理、贮藏保鲜、品质安全等方面,综述了近20年来我国红菜薹研究的主要成果,可供今后我国红菜薹教学、科研和生产及宏观决策的参考.     

白菜核基因雄性不育系转育研究

 以大白菜核基因雄性不育系‘1NA’转育成的白菜核不育系00S107为不育源, 根据大白菜核基因雄性不育“复等位基因遗传假说”设计转育方案, 向白菜可育品系‘青梗奶油白菜’中转育核不育基因, 经过3年5个世代杂交转育, 获得了新的白菜核基因雄性不育系及其相应的甲型“两用系”和临时保持系。     

白菜采后衰老生理的研究

 ‘早油冬’白菜采后在(20±1) ℃、85％～95％相对湿度条件下贮藏时，乙烯释放量呈下降趋势，失重率迅速升高，呼吸速率先下降后上升，于第6天形成呼吸高峰。外叶叶绿素、可溶性蛋白质和类胡萝卜素含量下降比内叶快。外叶贮藏中SOD和CAT活性变化较大，4 d后迅速下降，特别是CAT活性降幅更大；POD活性先逐渐增加，6 d后急剧上升，MDA含量先缓慢增加，4 d后急剧上升，表明活性氧代谢失调，膜脂过氧化加剧。内叶SOD和CAT变化很小，并保持较高水平，POD活性无显著上升，MDA略呈下降趋势，表明活性氧的产生与清除相平衡，从而防止了活性氧积累和膜脂过氧化加强。结论：白菜的衰老是活性氧代谢失调的结果，外叶比内叶容易衰老。     

植保康对普通白菜生长发育和营养品质及土壤状况的影响

采用田间施药方法,研究了不同浓度植保康对大棚中普通白菜生长、硝酸盐含量、营养品质及土壤性质的影响。结果表明,施用植保康后,普通白菜叶片数、最大叶面积和产量均有所提高,其中以植保康施用量22.5 kg?hm-2的效果最为明显。在营养品质方面,不同浓度植保康的施用效果不同,22.5 kg?hm-2处理的植株硝酸盐含量最低,而15.0 kg?hm-2处理的植株VC含量较高。添加植保康有效降低了土壤全盐量,提高了土壤微生物数量。综合各项因素,生产中植保康施用量以22.5 kg?hm-2为最佳。     

白菜组织细胞微管间接免疫荧光检测体系的优化

 利用正交试验设计，从酶浓度、酶解时间、一抗稀释度、二抗稀释度4种因素3个水平对白菜组织细胞微管的间接免疫荧光检测体系进行了优化，确立了适合白菜组织细胞的微管免疫荧光检测体系——果胶酶和纤维素酶浓度均为1.0%，酶解时间1 h；一抗稀释浓度1:100，孵育时间1 h；二抗稀释浓度1:500，孵育时间1 h。使用优化后的微管免疫荧光检测体系在荧光显微镜上能够快速观察到白菜组织细胞内的微管。