鸡肝细胞中C/EBPα基因的敲低及对糖脂代谢相关基因表达的影响

C/EBPα即CCAAT/增强子结合蛋白α基因,其编码的CCAAT/增强子结合蛋白是重要的转录调控因子,在细胞的分化和代谢过程中发挥着重要的调节作用。试验利用RNAi来敲低鸡LMH细胞系中C/EBPα基因的表达,以研究C/EBPα基因影响脂肪代谢的机制。根据鸡C/EBPα基因的mRNA序列,设计3对siRNA,用RNAi干扰技术来敲低鸡LMH细胞中的C/EBPα基因表达,然后用荧光定量PCR检测C/EBPα基因的表达情况,发现其中的C/EBPα-siRNA-161能够显著降低C/EBPα基因的表达;并将C/EBPα-siRNA-161转染LHM细胞后48 h后,利用荧光定量PCR检测LMH细胞中糖脂代谢相关基因(PCK1、SCD、GLUT2、PPARγ、INS、G6PC、IGF1、IGF2、INSR、STAT3)的表达,发现在LMH细胞中PCK1、G6PC、GLUT2基因的mRNA表达量下降,结果表明C/EBPα基因能影响糖代谢相关基因G6PC、GLUT2、甘油异生相关基因PCK1的表达,证实了C/EBPα基因对鸡肝细胞中的糖脂代谢具有调控作用,通过调控C/EBPα基因的表达将影响糖吸收及甘油异生。     

猪核转录因子C/EBPβ真核表达载体的构建及表达

通过构建猪核转录因子C/EBPβ编码区真核表达体pEGFP-N1-C/EBPβ,将猪C/EBPβ异位表达于小鼠成肌细胞C2C12细胞中,为进一步研究C/EBPβ在猪脂肪发育中的调控机制奠定基础。本试验利用RT-PCR扩增C/EBPβ编码区序列并测序,提交GenBank;并将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1,通过双酶切和测序鉴定重组质粒。将重组表达体pEGFP-N1-C/EBPβ导入C2C12细胞,荧光显微镜下观察C/EBPβ在细胞中的定位,半定量RT-PCR和Western blot检测C/EBPβ在细胞中的表达情况。本试验成功克隆测序了猪C/EBPβ基因编码区序列,并首次上传到GenBank;成功构建猪C/EBPβ真核表达体pEGFP-N1-C/EBPβ,并将其异位表达。结果表明:猪C/EBPβ在脂肪组织中表达量丰富,心肌和背最长肌表达微量,并且正确插入真核表达载体pEGFP-N1,荧光显微镜下观察重组体组主要集中在细胞核;而C/EBPβ基因和蛋白在转染重组体C2C12细胞中均有表达。本研究为提高猪肉肌内脂肪含量方面的研究提供新的思路。     

鹅LXRα基因的克隆及填饲对其mRNA水平的影响

为了研究填饲对LxRα mRNA表达水平的影响,本试验以四川白鹅和朗德鹅为试验对象,通过RT-PCR方法克隆了鹅肝脏X受体α(LXRα)基因部分序列,并采用SYBR-Green法研究了填饲对LXRα基因在肝脏和脂肪组织中转录水平的影响.结果获得了1005 bp的鹅LXRα部分序列,且与其它物种有较高的相似性,但存在8个氨基酸变异位点.LXRα基因在肝脏、腹脂和皮脂中都有表达,但在肝脏中的表达量最高.填饲引起鹅皮脂、腹脂和肝脏的LXRα mRNA表达丰度的显著增加.对照组中,LXRα在朗德鹅肝中的表达量高于四川白鹅(P<0.05),而在皮脂、腹脂中朗德鹅的表达量低于四川白鹅(P<0.05).填饲组,在肝和腹脂中LXRα的表达量四川白鹅显著高于朗德鹅(P<0.05),皮脂中表达量品种间差异不显著.填饲后LXRα mRNA表达丰度与皮脂、腹脂和肝脏的相对质量呈显著正相关,并且朗德鹅的相关性要强于四川白鹅.结论:填饲引起鹅肝脏和脂肪组织的LXRα mR-NA表达丰度的显著增加,填饲对LXRα mRNA表达的影响存在显著的品种差异.     

鸡PPARγ和C/EBPα的蛋白表达及其对肉鸡腹脂含量的影响

利用IPTG诱导含有原核表达质粒pGEX-4T-1/PPARγ和pGEX-4T-1/C/EBPα的大肠杆菌BL21(DE3)菌株,表达GST-PPARγ和GST-C/EBPα融合蛋白,表达产物用Glutathione Sepharose 4B纯化,将纯化后的重组蛋白免疫肉仔鸡,检测其产生抗体情况及其对肉鸡腹脂含量的影响。SDS-PAGE结果显示融合蛋白GST-PPARγ在大肠杆菌胞内主要以包涵体的形式表达,分子量大约80ku;融合蛋白GST-C/EBPα在大肠杆菌胞内主要以可溶性蛋白形式表达,分子量大约62ku。主动免疫肉鸡结果表明PPARγ、C/EBPα及混合组鸡只均产生了较高水平的抗体,且PPARγ组肉鸡腹脂含量显著低于对照组。     

梅花鹿IFN-α基因的克隆与原核表达研究

为研究梅花鹿IFN-α的抗病毒功能和分子机制,根据GenBank中牛IFN-α基因序列(A00145),设计并合成1对引物,以梅花鹿肝脏组织DNA为模板,采用PCR技术扩增梅花鹿IFN-α全基因核苷酸序列。序列分析表明梅花鹿IFN-α基因全长570 bp,编码189个氨基酸,其中含18个氨基酸的信号肽和169个氨基酸的成熟多肽,存在1个潜在跨膜区,基因随不同物种发育进化地位表现出种属间的差异性。在此基础上,合成1对引物,扩增梅花鹿IFN-α成熟肽核苷酸序列,构建pET28a-IFNα原核重组表达质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,在24 kd左右出现特异性蛋白带,表达产物主要为不溶性的包涵体,表达量占菌体总蛋白的34.04%,且表达产物与抗His标签抗体可发生特异性反应。将Ni柱纯化的pET28a-IFNα诱导表达产物复性后,细胞病变抑制法检测表明表达产物具抗病毒活性。研究结果为梅花鹿IFN-α蛋白抗病毒分子机制的研究及抗病毒药物的开发奠定了基础。     

鹅α和γ干扰素基因的克隆及序列分析

从植物血凝素(PHA)刺激的鹅外周血白细胞提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增鹅IFN基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列分析.克隆到的鹅IFN-α和IFN-γ基因与GeneBank上已公布的鸭IFN核苷酸序列进行比较,其同源性分别为IFN-α96.70%、IFN-γ94.95%;氨基酸序列同源性分别为IFN-α93.72%、IFN-γ93.29%.这为进一步研究鹅干扰素的生物学特性和应用奠定了基础.     

添加不同比例的青饲料对朗德鹅生长性能的影响

采用三因素三水平试验设计,将180只体重相近的1日龄健康商品代朗德鹅,随机分成9个处理组,每组4个重复,每个重复5只,研究添加不同比例青饲料对朗德鹅生长性能的影响。结果表明,雏鹅期(0～21日龄)添加青饲料组与未添加组在平均日采食量(ADFI)方面差异显著(P<0.05),而平均日增重(ADG)和饲料转化率(FCR)各组间差异不显著(P>0.05),青、精饲料比例为1∶2时,ADFI的效果最好;中鹅期(22～49日龄)平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI)各组间存在差异,而各组青、精饲料比例在(1∶2)～(3∶4)之间时各项指标最合理;大鹅期(50～77日龄)可以在原有添加量的基础上适当增加青饲料的补给,一方面可保证生长阶段各项发育的需要,另一方面也可为鹅的后期填喂做好必要的准备。     

填饲对朗德鹅血液指标、组织营养成分以及肝脏组织学的影响

通过对6只110日龄朗德鹅进行高能饲料填饲,测定和观察血清生化指标、肝脏、胸肌和腿肌中营养成分和肝脏组织学变化。结果显示,填饲20d后鹅肝脏重量显著提高(P0.01),血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、甘油三酯、总胆固醇和高密度脂蛋白水平显著增加(P0.01),其中γ-谷氨酰转肽酶在填肥过程中呈现出先升高后降低,与人类肝脏酶学研究结果一致;脂肪主要在肝脏沉积,其他组织无明显差异,蛋白质在肝脏中相对增加;填饲朗德鹅肝脏细胞胀大,肝细胞胞浆中充满大量大小不等的脂肪滴。这些结果为鹅生理和病理研究、肥肝生产及其遗传选育提供基本参考。     

不同饲料配比对朗德鹅生长性能及生理指标的影响

采用3因素3水平试验设计,将体质量相近的1日龄健康的180只商品后代朗德鹅,随机分成9个处理组,每组4个重复,每重复5只鹅。研究添加不同比例青饲料对朗德鹅生长性能和部分生理指标的影响。结果表明:一定比例的青精饲料在一定程度上了影响了养分的表观利用率。中等比例处理组能量及蛋白质的表观利用率均显著高于未添加处理组和高比例处理组,较早添加青饲料处理组的表观利用率要好于后期添加组(P0.05)。粗纤维(CF)及半纤维素的表观利用率随青饲料添加量的增加而增加,中性洗涤纤维(NDF)及酸性洗涤纤维(ADF)则有相应下降趋势。不同青精饲料比例对朗德鹅胸肌率和腿肌率等指标的影响差异均不显著,但在屠宰率、全净膛率和腹脂率方面存在的差异则较显著。     

鹅副粘病毒F基因的克隆及遗传变异分析

以鹅副粘病毒LN-7-02株基因组RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出F基因片段,并克隆至T载体.经质粒PCR及酶切鉴定后,对阳性克隆进行测序.测序后拼接得到F基因上游539bp核苷酸序列,并推导出ATG后1～374bp氨基酸序列.序列分析表明,LN-7-02株F蛋白裂解位点区的氨基酸组成为112R-R-Q-K-R-F117,与禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-1)强毒株特征相符.将LN-7-02与AMPV-1株CH2000、F48E9和LaSota进行同源性比较,结果LN-7-02与CH2000、F48E9和LaSota的同源性分别为91.8%、86%和84%,表明该毒株相对于经典的AP-MV-1在F基因上已发生了较大变异.根据国内外70株APMV-1的F基因核苷酸序列绘制系统发育进化树,结果疫苗株Lasota属于基因Ⅱ型,经典株F48E9属于我国特有的基因Ⅸ型,而LN-7-02株与鹅副粘病毒JS-9-01、ZJ-100和GD-QY97同属于APMV-1基因Ⅶ型.     

朗德鹅填饲后不同组织PPARγ基因mRNA表达量差异的初步研究

本研究采用荧光定量PCR检测了填饲、未填饲朗德鹅肝脏、皮下脂肪、腹脂和肌肉组织PPARγ基因mRNA的表达水平,并与谷丙转氨酶等6种血清生化指标进行了相关性分析。结果表明：在肝脏组织中,填饲组PPARγ 基因mRNA的表达量极显著高于对照组中该基因的表达量（P〈0.01）;肝脏组织PPARγ 基因mRNA表达水平与肝脏指数、血清谷丙转氨酶含量呈显著正相关（P〈0.05）,腹脂PPARγ基因mRNA表达水平与肝脏指数、血清谷丙转氨酶含量呈显著正相关（P〈0.05）,皮下脂肪PPARγ基因mRNA表达水平与肝脏指数、血清谷丙转氨酶含量呈极显著正相关（P〈0.01）。结果表明肝脏、皮下脂肪、腹脂组织PPARγ基因mRNA的表达水平与朗德鹅肥肝形成有一定的关系。     

鹅GnRH基因CDS区克隆、序列分析及原核表达

本研究旨在了解鹅GnRH基因的CDS区序列及其蛋白表达情况,研究鹅GnRH蛋白的生理功能,为进一步阐明GnRH蛋白影响鹅繁殖性能的调控机制提供理论基础。采用RT-PCR方法从溆浦鹅下丘脑扩增获得GnRH基因的CDS区序列,将测序正确的DNA序列定向克隆到pET28a(+),构建表达载体pET28a-GnRH,并转化至BL21(DE3)大肠杆菌表达目的蛋白,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测和Western blot分析。结果显示:获得的溆浦鹅GnRH基因CDS区部分序列,含有270个核苷酸,编码前体蛋白中的90个氨基酸;溆浦鹅GnRH基因CDS区在大肠杆菌中得到高效表达,GnRH基因CDS区的目的蛋白为9 900,最终测得菌体湿重为0.6g/L,纯化后得到的蛋白为20~30mg/L;清晰检测到GnRH基因表达的蛋白特异带,试验获得的抗体对原核表达的GnRH蛋白具有特异性反应;鹅GnRH基因在动物进化中高度保守,研究得到的鹅GnRH前体蛋白可为进一步研究GnRH基因的生物功能以及其对鹅就巢、产蛋等繁殖性状的影响奠定基础。     

鹅ACSL6基因编码区克隆、序列分析及组织表达

为研究长链酯酰辅酶A合成酶6(ACSL6)在鹅中的功能,采用RT-PCR方法对其扩增,并采用荧光定量PCR方法检测其在四川白鹅不同组织中的差异表达。结果表明:实验成功获得了鹅ACSL6基因的编码区序列(GQ449255),序列全长2 097 bp,编码698个氨基酸;鹅ACSL6与鸡该基因在核苷酸和氨基酸水平上都有较高的同源性;鹅ACSL6氨基酸与哺乳动物一样,也存在2个保守功能区(跨膜区和luxE保守区),且在这些区域物种间变异较少;鹅ACSL6在脑组织中有较高表达,在肝脏中表达较少,仍与其在哺乳动物中的表达特性一致。以上研究结果表明,ACSL6基因在物种间比较保守,ACSL6与鹅大脑的发育关系密切,可能与鹅肥肝形成的关系较少。     

不同油脂对填饲后朗德鹅产肝性能及胸肉中氨基酸含量的影响

采用单因子设计方案,将体重4.5~5.0 kg健康朗德鹅450只随机分成3组,其中Ⅰ组为对照组,Ⅱ组和Ⅲ组分别为试验组,每组150只,组内3个重复。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组在超饲养饲粮基础上分别添加2%的鹅油、2%豆油和2%玉米油,研究不同油脂对朗德鹅产肝性能及胸肌中氨基酸成分的影响。结果:肥肝均重和肝体比Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅰ组与Ⅲ组间差异显著(P(0.05),但Ⅱ组与Ⅲ组间差异不显著(P>0.05);料肝比Ⅱ组与Ⅲ组均低于Ⅰ组,但差异不显著(P>0.05),其中Ⅰ组最高,Ⅱ组最低,Ⅲ组介于二者之间。试验组与对照组各组胸肌水分、蛋白质和脂肪差异均不显著(P>0.05),试验组间差异也不显著(P>0.05);各组胸肌氨基酸含量试验组与对照组间均差异不显著(P>0.05),试验组间差异也不显著(P>0.05)。结论:植物油组产肝性能明显优于动物油组,其中豆油组肥肝性能最佳。     

鹅固醇调节元件结合蛋白1基因的克隆及生物信息学分析

从16周龄朗德鹅肝脏组织提取总RNA,采用反转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）方法扩增出1条长约280 bp的cDNA片段。序列分析结果表明,扩增出的cDNA片段与固醇调节元件结合蛋白1（SREBP-1）基因有较高的同源性,并且该片段包含着1个bHLH功能区。同时该片段包含1个明显的亲水区和1个明显的疏水区,二级结构富含α-螺旋,这与其功能相符。     

鹅细小病毒VP1基因的克隆及序列分析

参照GenBank中收录的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列设计并合成了扩增GPV H1株VP1的1对引物，利用PCR技术扩增出长约2．2kb的目的片段，将其克隆到pMD 18-T载体上，进行了序列测定及分析。测序结果表明，GPV H1株VP1基因由2199个核苷酸组成，编码732个氨基酸。经与B株、YG株进行同源性比较，核苷酸的同源性分别为98．50％和93．18％；推导的氨基酸同源性分别为98．09%和95．77％。     

不同能量水平对朗德鹅生长曲线的影响研究

在不同能量水平下,运用Logistic模型和Gompertz模型对朗德鹅0～10周龄生长曲线进行了分析和非线性曲线拟合研究。结果表明,不同生长阶段,朗德鹅公鹅、母鹅的适宜能量水平不同,Logistic模型和Gompertz模型都能很好地拟合朗德鹅的生长曲线,但Gompertz模型在拟合度和预测体重效果方面相对较好。中等能量水平下,2周龄前公鹅、母鹅的生长曲线基本一致,之后公鹅则明显高于母鹅,且保持较长时间的快速生长状态,公鹅的拐点体重显著高于母鹅,但拐点日龄的出现却晚于母鹅。     

鹅副粘病毒HZ株F蛋白基因的克隆及序列分析

以鹅副粘病毒HZ株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出F基因片段,然后将其克隆到pUCm-T载体中。经转化、筛选、酶切和PCR鉴定后,初步获得含鹅副粘病毒F基因的阳性克隆,并进行序列测定验证。结果表明,该基因由1 662个核苷酸组成,共编码553个氨基酸。与GenBank下载的9株参考毒株的F基因作同源性比较,发现HZ株与ZJ1、F48E9、Lasota等毒株的核苷酸同源性分别为98.3%、85.4%、82.7%;氨基酸同源性分别为97.8%、90.6%、88.1%。说明HZ株与经典的鸡新城疫病毒(NDV)在F基因上存在很大的差异,而与近年来的分离株亲缘关系较近。     

鹅副粘病毒F基因的克隆测序及核苷酸序列分析

以鹅副粘病毒 (GPV) SF0 2株的基因组 RNA为模板 ,通过 RT- PCR的方法扩增出 F基因片段 ,然后将其克隆至 T载体中。经 PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序。测序后拼接得出 F基因的全序列。与 Gen Bank下载的 9株参考毒株比较 F基因编码区全核苷酸序列 ,发现所测 GPV- SF0 2毒株与参考毒株 L Z- NDV核苷酸序列同源性为 96 %,与F48E9同源性为 92 .5 %,与 L a Sota为 88%。     

鹅细小病毒NS1基因的克隆及原核表达

本研究根据GenBank发表的GPVB株全基因核苷酸序列，设计了1对用以扩增GPV主要非结构蛋白NS1基因的引物。通过PCR技术，扩增出NS1完整基因片段1．9kb。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：GPV H1株NS1基因全长1884bp，编码627个氨基酸，与国外已发表的B株核苷酸序列同源性为98．15％。同时将该目的基因正向插入到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6P-1的BamH1多克隆位点，构建了GPV NS1的原核表达载体，成功的表达了约97KD的NS1融合蛋白。