稳定表达T7RNA聚合酶PK-15细胞系的建立

为构建稳定表达T7 RNA聚合酶(RNAP)的猪肾细胞系(PK-15),本研究采用PCR方法,以E.coli BL21(DE3)细菌基因组为模板扩增T7 RNAP基因,将其克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-T7.采用脂质体将pLXSN-T7转染至PT67细胞中,经G418筛选培养获得重组逆转录病毒rMLV-T7,将其接种于PK-15细胞进行G418加压筛选和纯化;应用PCR、间接免疫荧光试验及T7启动子控制下的红色荧光蛋白的重组表达质粒(pET-RED)进行瞬时表达,检测T7 RNAP的表达及活性,结果表明筛选所得的细胞系PK/T7的不同代次均具有转录活性.本研究建立稳定表达T7 RNAP的细胞系PK/T7,为实现细胞内T7启动的转录和猪源RNA病毒等的反向遗传操作提供了有效的方法.     

稳定表达T7 RNA聚合酶BHK-21细胞株的构建

【目的】通过建立过表达T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase, T7 RNAP)的慢病毒系统,构建可稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株。【方法】根据GenBank中公布的大肠杆菌BL21(DE3)基因组中T7 RNAP基因序列(登录号：NZ＿CP081489.1)设计引物,并采用PCR扩增T7 RNAP基因片段,将其克隆至慢病毒载体中,构建pCDH-CMV-T7 RNAP重组质粒。筛选阳性克隆及测序鉴定后,利用脂质体将包含重组质粒pCDH-CMV-T7 RNAP的包装系统和辅助包装质粒共转染至HEK-293T细胞,进行慢病毒的包装及纯化,获得高病毒滴度的重组慢病毒。将收集的病毒液分别以感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1、5、10和20感染BHK-21细胞,72 h后观察荧光情况,筛选最佳MOI。将重组慢病毒在最佳MOI条件下感染BHK-21细胞,通过绿色荧光蛋白copGFP的表达观察感染细胞的阳性率。使用4μg/mL嘌呤霉素作为抗性筛选物进行多轮筛选,最终筛选得到BHK-21-T7 RNAP细胞株。进一步对所筛选的细胞株...     

稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系的构建及鉴定

设计1对特异性引物扩增痘苗病毒VTF7-3株的T7RNA聚合酶基因并连接真核表达载体,利用Lipo-fectamineTM2000将重组质粒转染BHK-21细胞,G418筛选2周后,转入验证质粒pT7-HN,经Western-blot和间接免疫荧光鉴定后证实获得了1株能稳定表达T7RNA聚合酶的VT7细胞系。构建的VT7细胞系传30代还能够稳定的表达T7RNA聚合酶,为下一步建立有效的鹅源副黏病毒病毒反向遗传操作平台奠定了基础。     

重组猪瘟病毒E2基因逆转录病毒载体的构建及其表达活性

从实验感染兔脾组织中提取总RNA，应用RT—PCR得到了CSFVC-株结构蛋白E2基因，定向克隆于逆转录病毒载体pBABEpuro，经PCR、酶切和序列分析鉴定，获取阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载pVSV—G共转染GP2—293细胞，收获假型病毒，并在Polybrene的介导下感染PK15细胞，嘌呤霉素筛选表达猪瘟E2基因的细胞株。通过细胞传代并结合PCR、免疫荧光及ELISA检测表明，所筛的细胞细胞系能稳定表达猪瘟E2基因，而且表达产物具有良好的生物学活性。     

猪A组轮状病毒Vp7基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

轮状病毒（Rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）、轮状病毒属（Rotaviras），作为婴幼儿和动物腹泻的主要病原，在世界范围内广泛流行，每年造成巨大损失。鉴于其危害严重且无有效治疗手段，世界卫生组织将RV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一，尤其是它的基因工程疫苗的研制更为重要。     

以T7 RNA聚合酶为基础的病毒拯救系统研究进展

文章界定了与病毒拯救相关的一些概念,对T7 RNA聚合酶(RNAP)为基础的病毒拯救系统研究进行概述.介绍了体外拯救方法及其缺点,并以最常用的痘病毒载体表达T7 RNAP为基础的体内拯救方法为例,介绍了该方法对病毒拯救的研究进展及缺点,进一步介绍了无痘病毒表达T7 RNAP细胞系的RNA病毒拯救体系的建立和研究,为病毒拯救,特别是以T7 RNAP为基础的病毒拯救试验方案提供参考.     

猪NLRC5对PK15细胞中SLA Ⅰ类分子表达的调控研究

为探究猪核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)家族端酶募集(CARD)结构域-5(NLRC5)在PK15细胞中的表达情况及其对猪白细胞抗原I类分子(SLA I)表达的调控作用,本研究利用不同终浓度(1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL)Poly I:C刺激PK15细胞后24 h,通过荧光定量PCR(qPCR)和...     

口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因在毕赤酵母中的表达

以口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)RNA聚合酶基因3D为研究对象，对其部分碱基进行定点诱变，替换成在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。改造后的目的片段用NotⅠ和AvrⅡ内切酶双酶切，然后与相应内切酶双酶切的穿梭载体pPIC9K相连接，构建重组表达载体pPIC9K／3D，转化大肠埃希氏菌JM109，筛选阳性克隆pPIC9K／3D。经测序表明，插入位置、突变碱基、片段大小和读码框均正确。重组质粒用SacⅠ内切酶线化，电转化毕赤酵母SMD1168，采用G418抗性梯度法筛选，获得高拷贝整合重组菌株SMD1168／pPIC9K／3DHIS^ MUT^ ，利用甲醇进行诱导分泌表达，经SDS-PAGE和Western blotting鉴定，3D基因在毕赤酵母中表达成功，目的蛋白分子质量大小为52ku，与预期的大小吻合，并能够被FMDV阳性血清所识别，表达量占总分泌蛋白量的36％。     

猪细小病毒在PK15细胞中增殖规律的研究

猪细小病毒毒株在不同细胞系上的生长情况不尽相同,如不能掌握其规律,将难以生产出优质的疫苗。对PPV（长春株）在PK15和ST细胞上生长情况进行了研究,在PK15细胞系中重点比较了不同的病毒接种方法、病毒接种量和病毒收获时间等因素对病毒产量的影响。研究结果显示：本毒株在PK15和ST两种细胞系上的病变特征不同,但生长规模相似。在PK15细胞上按2％接种量、分步接种、80h时收获病毒,最终得到的病毒滴度（TCID50）最高。提示这是一种比较好的生产方案。然而,进一步的大规模培养试验是有必要的。     

稳定表达猪水疱病病毒P1基因的PK-15细胞系的建立

从猪水疱病全长感染性cDNA中,应用PCR技术扩增到SVDV结构蛋白P1基因,并在目的片段的5′端引入Kozak序列（Kozak,1987）,定向克隆于逆转录病毒载体pBABE puro。经PCR、酶切和序列分析鉴定,获得阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获假型病毒,在Polybrene的介导下感染PK-15细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。免疫荧光连续检测阳性克隆传代细胞,发现在不同代次的细胞中均有SVDV P1蛋白表达,而且表达的蛋白可被SVD阳性血清所识别;同时应用PCR技术,可从体外反复传代阳性细胞基因组中扩增到SVD P1基因。表明本次所筛选的阳性细胞克隆不但能持续稳定地表达SVD P1蛋白,而且可携带外源基因进行传代,具有良好的遗传稳定性。     

T7 RNA多聚酶基因的克隆、序列测定及其在E.coli中的表达

从BL21(DE3)E．coli菌株中以PCR的方法扩增得到了与T7RNA多聚酶(T7RNApolymerase，T7pol)基因大小一致的DNA片断。将PCR产物纯化后直接克隆到pGEM—T载体中，经酶切鉴定和DNA序列分析表明克隆得到了正确的T7pol基因。将T7pol基因亚克隆入pET-28b( )中，构建得到原核表达质粒pET28T7。该质粒的BL21(DE3)pLysS转化菌在IPTG的诱导下可表达约98800的蛋白，这与T7pol的相对分子质量一致。将该质粒转化DH5α、JMl09、HBl01、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS等5种不同的宿主菌，仅有转化T7pol酶活性受到抑制的宿主菌BL21(DE3)pLysS才能得到转化子，而其余4种T7T7pol酶活性不受抑制的E．coli宿主菌不能得到转化子。pET28T7原核表达质粒这种仅能在T7pol酶活性受到抑制的宿主菌中才能存活的现象说明本试验所克隆的T7pol基因能正确表达出具有RNA转录酶活性的蛋白。     

肌抑素对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响

本研究旨在揭示肌抑素（MSTN）与基质金属蛋白酶（MMPs）的调控关系,探明MSTN对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响。对MSTN单等位基因敲除猪背膘组织进行转录组测序分析,复苏前期制备的MSTN基因敲除PK15细胞系：单等位基因敲除的PK3108细胞系和双等位基因敲除的L18细胞系,通过实时荧光定量PCR和Wesrern blotting分别检测PK15、PK3108和L18细胞系中MSTN、MMP-2/7/9基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现,与野生型猪相比,MSTN单等位基因敲除猪背膘组织转录因子C/EBPδ、MMP-2/7基因mRNA表达量均极显著下调（P < 0.01）;细胞外基质中纤连蛋白（FN）和层连接蛋白（LN）含量均极显著增加（P < 0.01）。复苏的PK3108和L18细胞呈现绿色荧光。实时荧光定量PCR结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的mRNA表达量均极显著低于PK15细胞（P < 0.01）;Western blotting结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的蛋白表达量均明显低于PK15细胞。本研究结果表明,在MSTN基因敲除的PK15细胞中,MSTN功能缺失能显著降低MMP-2/7/9的表达,且MMP-2/7/9蛋白表达降低的趋势与MSTN蛋白表达的趋势相一致。     

3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞（PK15）的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况,采用CCK-8检测细胞存活率,进而比较3种方法的转染效果。结果显示,转染PK15细胞后,电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体（P<0.01）,但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著（P>0.05）;EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好,脂质体方法较差,与细胞转染效率基本一致;CCK-8结果显示,电穿孔转染后细胞存活率最低,极显著低于对照组（P<0.01）,脂质体方法显著低于对照组（P<0.05）,慢病毒方法与对照组间差异不显著（P>0.05）。综合考虑转染效率及细胞活性,本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞,为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。     

竞争性RT-PCR检测铜对Ctr1 mRNA表达的影响

为了应用竞争 RT- PCR法检测铜对猪传代肾细胞 (PK15 )中特异性铜转运蛋白 Ctr1基因 m RNA表达水平的影响 ,经 2次克隆 ,将筛选出一段 4 0 0 bp的核苷酸序列 ,插入 RT- PCR扩增出的 5 30 bp Ctr1目的片段中 ,构建了插入突变型 Ctr1- c DNA竞争模板。再将竞争模板与各试验组 c DNA同时进行 PCR扩增。结果 ,猪肾 PK15细胞 Ctr1基因m RNA表达量在 7.8～ 31.2 μmol/ L Cu范围内随铜添加浓度的升高减少 ,当铜添加浓度达到 6 2 .5 μmol/ L 时 ,其表达量又有所回升 ,呈双相反应。     

载体介导的shRNA抑制猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖特性的研究

利用生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的干扰序列,化学合成这些序列,然后退火连接为双链干扰片段,再定向克隆到干扰载体中,将酶切和序列测定鉴定正确的重组载体命名为pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3、pGene-NS3-Negative。重组干扰载体经纯化后转染PK-15细胞,并进行G418抗性筛选。克隆细胞扩大培养后,接种猪瘟病毒Shimen株,收集细胞分别进行实时定量PCR和ELISA光吸收度分析。Real-time PCR分析表明,与对照细胞比较,pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3转录产生的shRNA分子均在一定程度上沉默了病毒的基因,抑制率约为63%、46%、49%。ELISA检测结果表明,转染pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3重组载体的PK-15细胞均在不同程度上抑制了猪瘟病毒粒子的增殖。     

山羊myostatin基因慢病毒RNA干扰载体的构建及效果验证

myostatin基因是肌肉生长和发育的关键负调控因子之一,该基因突变或失活的物种都呈现肌肉增大的双肌表型,暗示在家畜中使该基因失活可以增加其产肉量。为了进一步揭示myostatin在山羊胎儿成纤维细胞中的生物学功能以及制备可有效失活myostatin基因的工具,将筛选的myostatin基因潜在RNA干扰靶位点连接到慢病毒干扰载体的转移质粒中,构建慢病毒介导的RNA干扰载体,验证其干扰效果。结果表明,干扰序列与转移质粒连接正确,成功构建myostatin基因慢病毒干扰载体,慢病毒三质粒共转293T细胞,获得的慢病毒颗粒可高效转染山羊胎儿成纤维细胞,Real-time PCR检测发现慢病毒干扰载体Lv322有效减少山羊胎儿成纤维细胞中myostatin基因mRNA 75%的表达(P<0.01),Western blotting检测显示myostatin蛋白则有效降低了94%(P<0.01)。本试验为研究myostatin基因的功能及制备失活转基因动物提供有效工具以及理论基础。