茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)实时荧光定量PCR检测方法的优化及应用

选用茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)基因组中序列特异性很高的p16基因为目标基因,通过设计引物、PCR扩增、目的片段与载体连接转化获得含p16基因的重组质粒进行测序,进而以经测序鉴定的p16基因的PCR纯化产物作为实时荧光定量PCR标准品模板,稀释后建立SYBR Green I荧光定量标准曲线,统计分析显示标准品浓度的对数值与Ct值之间存在良好的线性关系(R2=0.9981)。该方法的检测灵敏度为102,扩增产物形成单一的特异性熔解峰,组内组间变异系数均小于3%。同时分别对含有其他茶树害虫病毒和不同浓度的茶尺蠖病毒产品的样品进行检测,能明确样品中是否含有EoNPV及含量。根据已建立的方法对感染病毒后不同时间段的茶尺蠖幼虫进行检测,每克幼虫样本内p16基因拷贝数的增殖倍数对数值与感染时间呈正相关(R2=0.9935),可以获得茶尺蠖幼虫感染病毒后不同时间的增殖动态。上述结果表明,该方法能定性定量鉴定茶尺蠖核型多角体病毒,可用于茶尺蠖核型多角体病毒类生物农药的检测和感染过程检测。     

茶尺蠖核型多角体病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis oblique nucleopolyhedrovirus, EoNPV）基因序列设计一对引物,并从感染该病毒的虫体中提取EoNPV基因组DNA,进行PCR扩增,将该基因片段与载体pMD18-T连接,转化入大肠杆菌TG1中,经单克隆菌落筛选及测序鉴定后得到重组质粒,以该质粒为荧光定量PCR标准品模板稀释后建立标准曲线。构建的标准曲线线性关系良好,相关系数为0.989,检测范围为10³~10⁸拷贝/µL,特异性和重复性较好。该方法可以准确地判断出病毒拷贝数,为茶尺蠖核型多角体病毒在虫体内增殖动态的研究和病毒制剂的质量检测提供了方法依据。     

茶尺蠖的克星——茶尺蠖核型多角体病毒

茶尺蠖核型多角体病毒是一种重要的病原微生物,可以感染茶尺蠖和灰茶尺蠖幼虫致其死亡。文章介绍了茶尺蠖核型多角体病毒的发现、形态特征、作用机理和使用技术等,为茶尺蠖核型多角体病毒的应用提供参考。     

茶尺蠖病毒研究进展

茶尺蠖是茶树上一种重要的食叶性害虫,分布于我国各茶区,经常在局部茶园暴发成灾,对茶叶生产造成严重的损失。茶尺蠖病毒是控制茶尺蠖自然种群消长的重要因子,主要包括茶尺蠖核型多角体病毒和茶尺蠖小RNA病毒。本文综述了茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）生物学特性、扩繁、制剂的研发与应用、定性定量检测技术的建立、重组NPV病毒和茶尺蠖小RNA病毒分子生物学方面的研究进展情况,为更好的利用病毒防治茶尺蠖提供参考。     

茶尺蠖病毒研究进展

茶尺蠖是茶树上一种重要的食叶性害虫,分布于我国各茶区,经常在局部茶园暴发成灾,对茶叶生产造成严重的损失。茶尺蠖病毒是控制茶尺蠖自然种群消长的重要因子,主要包括茶尺蠖核型多角体病毒和茶尺蠖小RNA病毒。本文综述了茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)生物学特性、扩繁、制剂的研发与应用、定性定量检测技术的建立、重组NPV病毒和茶尺蠖小RNA病毒分子生物学方面的研究进展情况,为更好的利用病毒防治茶尺蠖提供参考。     

两个EoNPV毒株对茶尺蠖和灰茶尺蠖的毒力差异

通过确定不同茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus,EoNPV)毒株对茶尺蠖(Ectropis obliqua)和灰茶尺蠖(Ectropis grisescens)毒力水平的差异,为有效提高茶尺蠖病毒的防效提供理论基础.采用浸渍法,测定EoNPV浙江毒株(EoN...     

茶尺蠖核型多角体病毒的土法生产

利用茶尺蠖核型多角体病毒防治茶尺蠖,不仅防治效果好,而且具有不杀伤天敌、病毒有传播扩散作用、持效时间长等优点,因此是理想的生物防治措施之一。要推广这一措施,首先必须生产病毒。目前,生产病毒的方法主要有:①室内用自然饲料连续大量饲养幼虫增殖病毒;②室内用人工饲料饲养幼虫增殖病毒;③从田间收集大量幼虫于室内增殖病毒。其中,用人工饲料饲养幼虫增殖病毒,多半用于     

茶尺蠖核型多角体病毒与农药混用试验

本文测定了茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）与几种杀虫剂混用的杀虫效果。生物测定结果表明,苏云金杆菌（Bt）与EoNPV混用时,表现有一定的颉颃作用,而且Bt浓度越高,往往颉颃作用越强。敌灭灵、喹硫磷与EoNPV混用,虽然有协同作用,但无增效作用。     

我国茶树害虫病毒的研究与应用（续）

二、茶树害虫病毒大田应用效果目前,在大田做过防治应用试验的有茶小卷叶蛾和茶卷叶蛾颗粒体病毒及扁刺蛾、茶毛虫、茶尺蠖、油桐尺蠖和云尺蠖等核型多角体病毒,其中,茶小卷叶蛾颗粒体病毒,扁刺蛾、茶毛虫、茶尺蠖、油桐尺蠖核型多角体病     

茶尺蠖大量饲养中取卵法及卵的冷藏法

在茶尺蠖的研究与防治中,如增殖核型多角体病毒、繁殖寄生蜂、进行农药的药效鉴定等,都需要大量发育整齐的幼虫,这些幼虫一般通过室内连续群体饲养而获得,但在群体饲养过程中,由于个体发育的差异,幼虫化蛹,成虫羽化、产卵均具有持续性,因此,子代卵的孵化及幼虫发育不整齐。本研究通过取卵与冷藏来克服以上弊病,获得发育整齐的茶尺蠖幼虫。现将研究结果介绍如下,以供参考。     

茶尺蠖生物防治技术研究及无锡地区防治建议

主要从天敌资源、信息化合物和微生物源农药三个方面对茶尺蠖生物防治技术进行概总结概括,重点对茶尺蠖核型多角体病毒制剂的使用技术及无锡地区使用方法进行介绍,病毒制剂对低龄期幼虫防治效果较好,虫口密度较大时也可与植物源农药混用施用。     

茶尺蠖病毒杀虫剂在江苏茶区的示范应用效果

为了更好地推广应用茶尺蠖核型多角体病毒,对江苏主要产茶区茶尺蠖和灰茶尺蠖的分布情况进行调查,并在主要发生区进行茶尺蠖病毒杀虫剂的示范应用。结果表明,苏州市、无锡市为茶尺蠖发生区,南京市、扬州市为灰茶尺蠖发生区,镇江市、常州市为混发区;在低龄幼虫期,每667 m~2茶园使用150 mL茶尺蠖病毒杀虫剂防治灰茶尺蠖和茶尺蠖,防效分别为77.4%和77.3%;在高龄幼虫期,采用病毒杀虫剂与植物源农药混用,防效为99.6%。采用发生期预测为配套手段,在第1代孵化高峰期应用病毒杀虫剂,可作为茶尺蠖病毒杀虫剂的应用模式。     

茶尺蠖类免疫球蛋白基因EoHML的克隆和表达分析

类免疫球蛋白（Hemolin）是一种鳞翅目昆虫特有的免疫相关蛋白,也是唯一的无脊椎动物免疫球蛋白家族成员。本实验应用RACE技术获得了茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）类免疫球蛋白基因的全长cDNA序列,命名为EoHML（GenBank登录号：KM885983）,并分析了相关生物信息学特性,检测了病毒感染后基因的表达水平。结果表明,EoHML基因序列全长1β772βbp,包含1β239βbp的开放阅读框,编码412个氨基酸,预测蛋白分子量大小为45.8βkD,等电点（pI）为8.297,属于典型的分泌型蛋白,且具有昆虫Hemolin基因保守的4个Ig功能区和2个N-glycosylation位点。系统进化分析表明,该蛋白与目前已知的类免疫球蛋白氨基酸序列的亲缘关系都较远,与烟草天蛾（Manduca sexta）类免疫球蛋白氨基酸序列相似度最高,为53%。荧光定量检测结果表明,茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）感染茶尺蠖幼虫后该基因表达量显著升高,最高表达量是正常对照的36.5倍,表明茶尺蠖EoHML基因可能参与了茶尺蠖对EoNPV的免疫代谢反应。     

茶毛虫核型多角体病毒ph基因抗体的制备与利用

以茶毛虫核型多角体病毒(EupsNPV)的基因组DNA为模板,PCR扩增出全长为741bp的ph基因编码区片段。将Ep-ph编码区插入pET-28-a,构建了原核表达载体pET-28-a-Ep-ph,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行了高效的表达。以经表达纯化的目的融合蛋白作为抗原,免疫新西兰大白兔,制备了EupsNPV的ph抗体,测得的抗体效价为6.4×104。Western blotting检测表明制得的抗体对核型多角体病毒有良好的特异性。利用制备的抗体用间接ELISA方法对茶毛虫病毒样品进行了定量分析,得到线性回归方程为y=0.4152x-0.8299,相关系数r=0.9897(P<0.01)。间接ELISA方法表明该抗体可以用于核型多角体病毒生物农药的定量检测,从而为核型多角体病毒的检测农药制剂提供了一种准确有效的方法。     

茶园专用生物农药

由于茶园中长期大量使用化学农药，破坏了生态平衡，导致某些害虫周期性大暴发，或次要害虫上升为主要害虫。因此，采用以生物防治为主的其他防治措施是十分必要的，尤其是生产有机茶的茶园更为迫切。近年来，中国农业科学院茶叶研究所研制了几种茶园专用的微生物农药，并进行了小批量生产和大面积示范应用，效果良好。 １．茶尺蠖病毒水剂　主要成分为茶尺蠖核型多角体病毒，只对茶尺蠖有效。幼虫取食病毒后会感病死亡，但潜伏期较长，有的甚至到蛹期才能死亡。感病死亡的虫尸体内含有大量病毒，可在田间继续扩散感染，因此后效作用强。一…     

温度、光、pH值对茶尺蠖病毒活性的影响

试验结果表明,茶尺蠖核型多角体病毒的多角体悬液经80℃(水浴)、干多角体经120℃(烘箱)恒温处理15分钟时,多角体失去活性。夏季,干多角体薄层经阳光直射24hr后几乎失去活性。病毒悬液的pH值在4～8之间对病毒活性无影响。     

茶尺蠖核型多角体病毒对三种有益昆虫的安全性试验

茶尺蠖(Ectropis obliqua Warren)是苏浙皖茶区的主要害虫之一,用病毒防治茶尺蠖,是一种既能减轻化学农药所引起的环境污染,又能保持茶园生态平衡的生物防治措施。病毒防治茶树害虫,目前已取得了较为满意的效果。为了证实茶尺蠖核型多角体病毒对有重要经济价值的益虫有无影响,我们对家蚕、蓖麻蚕及蜜蜂进行了感染试验,研究对其生长发育的影响及其组织细胞是否发生病理变化。     

茶尺蠖人工饲料的砑究初报

近年来利用人工饲料饲养昆虫的方法有了迅速的发展,并成为大规模生产病毒的主要手段,也是扩大使用病毒治虫的一个重要前提。作者自从发现和应用茶尺蠖核型多角体病毒时,即于1978年冬开始进行茶尺蠖人工饲料配方及其饲养条件的研究。目前,采用简易配方饲料饲养茶尺蠖取得初步结果。     

日本对两种卷叶蛾颗粒体病毒的研究

据近年来日本的资料报导,在为害茶树的卷叶蛾幼虫体上发现有五种病毒:茶小卷叶蛾核型多角体病毒、颗粒体病毒、细胞质多角体病毒、昆虫痘病毒及茶卷叶蛾颗粒体病毒。对两种卷叶蛾的颗粒体病毒进行了较详细的研究,取得了一些进展。     

NPV对不同龄期茶尺蠖的敏感性

于八六年至八七年,我们省内外收集到了三株茶尺蠖核型多角体病毒(NPV),通过筛选,得到一株毒力较高的毒株:“Bm.NPV—I”,用此毒株分别接种2—3龄,3—4龄,4—5龄三个不同龄期的幼虫,测得“Bm.NPV—Ⅰ”这一毒株对2—3龄幼虫的敏感性最强,其感染死亡率97.14％。对3-4龄幼虫的感染死亡率为 88.57％,对4—5龄幼虫的敏感性最弱,其感染死亡率为40％。