菜豆种子几丁质酶的分离纯化及性质研究

运用硫酸铵分级沉淀与亲和层析技术相结合的方法,分离纯化了菜豆种子中的几丁质酶。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电脉图谱显示,经亲和层析后的蛋白质样品呈单一谱带,分子质量为３．４６×１０＾４,纯化倍数达４８．８倍,几丁质酶回收率为４７％,酶的最适温度为４５℃,最适ｐＨ值为６．０。纯化菜豆种子几丁质酶对绿色木霉菌生长具有抑制作用。     

东亚飞蝗几丁质酶家族基因的表达特性与功能研究

 【目的】研究东亚飞蝗几丁质酶家族基因的时空表达特性及其在蜕皮发育中的生物学功能,筛选在飞蝗发育过程中致死性的几丁质酶基因,为实现基于RNAi的飞蝗有效控制提供重要的基础数据。【方法】在东亚飞蝗EST数据库搜索几丁质酶基因片段,用生物信息学方法分析所获得的基因片段序列;以飞蝗不同龄期第4天若虫和5龄东亚飞蝗不同组织部位为材料提取RNA并反转录为cDNA,应用RT-PCR方法研究时空表达特性;选取在表皮高表达的几丁质酶基因LmCht6,采用RNA干扰方法研究其生物学功能。【结果】基于东亚飞蝗EST库搜索和进一步的序列分析,共获得7条几丁质酶基因片段;不同组织部位与不同龄期RT-PCR结果表明这7条几丁质酶基因的时空表达特性存在明显差异,其中LmCht6主要在表皮表达;LmCht6的RNA干扰试验表明：2龄飞蝗注射dsLmCht6后,其几丁质酶基因LmCht6表达量明显降低;飞蝗从2龄到3龄的龄期转化过程中,表现为发育延迟,新表皮与旧表皮无法完全分离,导致死亡率达到72.2%。【结论】东亚飞蝗拥有多个几丁质酶基因,它们的时空表达特性存在差异;LmCht6在飞蝗蜕皮过程中具有十分重要的生物学功能,该基因被沉默后飞蝗无法完成蜕皮而导致死亡。     

华山松疱锈病的重寄生真菌(深绿木霉)中几丁质酶基因cDNA片段的克隆

[目的]分离深绿木霉S5003中的几丁质酶基因,为获得高抗病的转基因植株奠定基础。[方法]采用华山松疱锈病的锈孢子壁作为诱导物,诱导深绿木霉SS003中几丁质酶基因的表达,并通过lit—PER方法扩增得到几丁质酶基因片段。[结果]锈孢子壁可诱导出高活性（40．17μg／10min）的几丁质酶,PCR扩增得到了长度为834bp的特异片段,经序列测定及分析显示该片段为几丁质酶基因片段。[结论]深绿木霉SS003的几丁质酶基因片段的获得,为分离全长基因以及进一步利用该基因生产几丁质酶以及进行基因转化提供了可能。     

蛋壳残留溶菌酶的磁性亲和分离

采用包埋法制备了具有磁响应性能的几丁质凝胶亲和吸附介质,并对其颗粒表观结构、吸附特性等物化特性进行了分析．试验表明：介质中的Fe3O4颗粒对杂蛋白存在非特异性吸附,而含醋酸铵的磷酸盐缓冲液的充分洗涤可有效消除非特异性吸附．利用此介质所建立的方法对蛋壳清洗液中的溶菌酶进行了分离．结果表明：通过外加磁场可快速地实现亲和吸附介质与粘稠清洗液及其中蛋壳碎片和泥沙等固形物杂质的分离,大大简化了操作步骤,酶活力回收可达26％,纯化酶对蛋白的比活性为50894U／mg,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一条酶蛋白带．     

海洋产几丁质酶微生物选育及组合发酵优化

[目的]探索海洋产几丁质酶微生物最佳的发酵组合。[方法]从唐山港曹妃甸港区海泥中分离筛选出2株几丁质酶活性强的菌株,研究不同的培养条件、诱变及组合发酵对菌株产酶的影响。[结果]通过紫外诱变产生的菌株的透明圈较大,直径在3~4 mm,但数量不多;培养基碳源以胶体几丁质最好,产几丁质酶的最适温度在32℃;pH在7.0~8.0产酶量最高;以蛋白胨和酵母粉为氮源对产酶的效果明显;添加Mn2+的培养基产酶能力最强;随着培养时间的增加,诱变的菌株组合发酵产酶后,几丁质酶活性显著提高。[结论]在组合发酵中,选取高产酶培养条件、不同来源的菌株混合培养对组合发酵有着重大的意义。     

吉富罗非鱼胃肠道几丁质酶的克隆、组织分布和纯化

【目的】几丁质酶是重要的水解酶,能通过水解β-1,4-糖苷键来降解鱼类食物中虾蟹壳所含的几丁质,帮助鱼类消化。了解几丁质酶在罗非鱼不同组织中的表达状况,以及从罗非鱼胃中所提取几丁质酶的特性。【方法】从吉富罗非鱼胃和肠组织中克隆获得3种几丁质酶tChit1a、tChi3和tChit的开放阅读框序列进行序列分析,并通过Real-time PCR检测其组织分布状况;通过几丁质亲和层析法纯化罗非鱼胃组织中的几丁质酶,并通过4-MU法检测酶活性。【结果】tChit1a、tChi3和tChit几丁质酶基因分别编码453、453和473个氨基酸,同源比对结果显示tChit1a与t Chi3的相似度为83.66%,而tChit与tChit1a、tChi3的相似度则较低,分别为49.89%和50.11%。进化树分析结果显示,这3种几丁质酶是鱼类三型几丁质酶,为非酸性几丁质酶。组织分布结果显示,tChit1a、tChi3和tChit分别在罗非鱼中肠、前肠和中肠后表达量最高。纯化罗非鱼胃几丁质酶的结果显示,SDS-PAGE胶在40 ku附近有两条明显条带,但用斜带石斑鱼1型几丁质酶多克隆抗体检测,没有检测到同源性高的条带。检测纯化产物几丁质酶的活性,结果显示,在最适pH值为5时,纯化产物降解4MU-(GlcNAc)_2和4MU-(GlcNAc)_3分别为1.73、4.89 U/g。【结论】罗非鱼胃组织中所提取的几丁质酶表达量和活性均较低,这可能与罗非鱼为杂食且偏素食的食性有关。     

百日草几丁质酶基因片段克隆及其序列分析

[目的]克隆百日草几丁质酶的基因片段,并对其序列进行分析.[方法]以百日草“梦境”系列为材料,提取其叶片总RNA,并根据其他植物几丁质酶基因保守序列设计简并引物,通过RT-PCR克隆百日草几丁质酶基因片段（ZEchi）,并对该基因序列进行分析.[结果]克隆得到的片段长度为227 bp,共编码75个氨基酸残基;核苷酸同源性分析表明,ZEchi与已报道的其他植物几丁质酶基因同源性达70％以上,其中与葡萄的同源性最高,为74％;氨基酸同源性分析表明,该几丁质酶多肽属于18家族几丁质酶,且与已报道的其他植物几丁质酶氨基酸序列具有70％以上的相似性;氨基酸聚类分析表明,该几丁质酶多肽与白车轴草和蒺藜苜蓿的几丁质酶聚类;生物信息学分析表明,由该基因片段编码的多肽为非跨膜蛋白,主要含α螺旋和随机线圈螺旋等二级结构.[结论]该研究为进一步研究几丁质酶基因的功能奠定了基础.     

番茄种间杂交不亲和性的研究

以栽培种番茄[Lycopersicon esculentum“粤农二号”(E)],野生种秘鲁番茄(L.peruvianum(P)],以及“粤农二号×秘鲁番茄”的F_1(“E×P”F_1)为材料,进行相互间的有性杂交。在“P×E”F_0杂交组合中,E的花粉管与P的花柱部位发生不亲和;“E×P”F_1自交,自身的精卵细胞不亲和;PדE×P”F_1回交,远缘杂种“E×P”F_1的花粉管与P的胚珠不亲和。“E×E”和“P×P”两融交组合,E和P的花粉管在授粉后24小时左右已可看到进入子房,到迭胚珠。     

一株几丁质酶产生菌V-8对棉花枯萎病的防治作用(英文)

[目的]筛选对棉花枯萎病菌有拮抗作用的内生菌株。[方法]以采自湖北荆州棉花种植区的新鲜棉花植株为试验材料,对其进行内生菌株的分离,再通过几丁质酶及平板对峙双重筛选对棉花枯萎病菌有拮抗作用的菌株。[结果]从大田棉花植株内分离出83株细菌,其中6株为几丁质酶产生菌。通过几丁质酶及平板对峙双重筛选,从中获得菌株V-8对棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)拮抗作用最强,该菌株具有较宽的抑菌谱,对西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp niveum)等6种重要病原真菌均具有一定的抑制作用;在棉花根际土壤能稳定定殖,50d后定殖密度达6.2×105cfu/g;对棉花枯萎病的盆栽防效为73.2%。表明内生细菌V-8对棉花枯萎病的生物防治具有较大的潜力,可作为几丁质酶基因克隆的重要材料。[结论]该研究结果为棉花枯萎病的防治以及充分开发棉花内生菌资源、研制新型生物农药奠定了基础。     

海洋真菌HZ-01菌株产几丁质酶的研究

[目的]探讨海洋真菌HZ-01菌株产几丁质酶的培养条件和部分性质。[方法]从海洋环境中筛选出1株几丁质酶高产真菌HZ-01,以该菌株为材料,进行不同碳源、氮源以及温度对菌株发酵产生几丁质酶的影响试验,研究几丁质酶的培养条件。将粗酶液在不同温度下保温60 min后,取样测定几丁质酶活力,分析几丁质酶的热稳定性和酸碱稳定性。[结果]海洋真菌HZ-01菌株产几丁质酶的最佳碳源为几丁质,蛋白胨为最佳氮源;以1.0%的几丁质作为碳源,0.1%的蛋白胨作为氮源,温度为30℃时,其产生的几丁质酶活力最高,且随着温度的上升,该酶活力下降;该酶的酸碱稳定性较差,只在pH值6~8具有较高活性。[结论]该研究为规模化生产几丁质酶初步奠定基础。     

哈茨木霉高产几丁质酶菌株的筛选及产酶条件研究

通过氮离子注入法诱变哈茨木霉(Trichoderma harzianum)野生菌,再以透明圈法对平板培养菌进行筛选,用DNS法测定液体培养菌的酶活,从中筛选出1株产几丁质酶能力高的哈茨木霉菌株H-13,并通过单因素试验和正交试验优化该目标菌株的发酵条件.单因素试验结果表明,添加1.0%蛋白胨时产酶量最高,1.0%胶体几丁质对菌体产几丁质酶的诱导性最强,初始pH 5.5、培养96 h时产酶量较高.正交试验表明,H-13以1.0%蛋白胨为氮源、0.5%胶体几丁质为碳源,在初始pH 5.0的培养基中培养96 h时,发酵液中的几丁质酶活可达到731.69 U?mL-1,比同样条件下的野生菌株酶活力提高1倍.     

少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-483基因的克隆及生物学活性

为弄清少孢节丛孢菌几丁质酶的生物学功能,对少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-483基因进行克隆及分子特征分析,并在大肠埃希菌中进行诱导表达;采用DNS还原糖法检测经镍柱纯化的重组几丁质酶活性,将其作用于秀丽隐杆线虫幼虫,分析其生物活性。结果显示,AO-483基因编码309个氨基酸,与少孢节丛孢菌标准株(ATCC 24927)的几丁质酶AO-483基因序列的同源性为96.88%,氨基酸序列同源性为97.73%;AO-483含有1个Glyco-hydro-18结构域,位于20~297位氨基酸,属于糖苷水解酶18家族,还含有特征序列GMLGG和LDGLDLDVE;三级结构为典型的三磷酸异构酶桶形结构。SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白AO-483分子质量约为52 ku,与预测大小一致;Western blot分析证实,该重组蛋白能与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆血清抗体发生特异性反应。经DNS还原糖法检测,该重组几丁质酶活性为223.31 U·mL^-1;重组几丁质酶对秀丽隐杆线虫Ⅰ期和Ⅳ期幼虫有较强的降解活性。     

农用明胶基高吸水材料的制备与研究

[目的]研究农用明胶基高吸水材料的制备方法及性能。[方法]以明胶为基质、丙烯酸为单体、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂、过硫酸钾为引发剂,通过微波辐射的方法合成高吸水性树脂。考察了丙烯酸中和度、引发剂用量、交联剂用量等因素对材料吸水性能的影响。[结果]当丙烯酸中和度为70%、引发剂过硫酸钾用量为0.20 g、交联剂用量为0.010 g、去离子水10.0 ml及120 W微波反应5 min时,所制备的明胶基吸水性材料对去离子水的吸液倍率可达420 g/g。[结论]研究结果为明胶基高吸水材料的制备和应用提供了一定的科学依据。     

木霉几丁质酶和几丁寡糖的制备及提纯

[目的]为木霉几丁质酶和几丁寡糖的开发应用提供必要的技术支持。[方法]由高产几丁质酶的木霉菌株YHS-1液体振荡培养得到木霉几丁质酶粗酶液,分别测定了木霉菌株YHS-1在不同时间、不同温度下的几丁质酶活值,优化木霉产酶条件。并研究了几丁寡糖的制备及提纯方法。[结果]供试木霉最佳产酶温度为35℃,最佳产酶时间为4 d,此时酶活值为55 U。几丁质酶粗酶液通过(NH4)2SO4分级沉淀、阴离子交换柱层析、SDS-PAGE提纯后可以达到层析纯,出现单一并且峰值很高的层析峰,电泳确认2条带,分别为几丁质外切酶和几丁质内切酶。几丁寡糖用初提纯的几丁质酶与过量的胶态几丁质反应得到粗溶液,再经过蛋白质沉淀和冷冻离心后得到纯化。[结论]建立了木霉几丁质酶和几丁寡糖的制备及提纯方法,为木霉几丁质酶和几丁寡糖的开发应用提供了必要的技术支持。     

乙烯利诱导黄瓜叶片胞间隙几丁质酶累积的变化

以"津春4号"黄瓜为试材,研究喷施不同质量浓度乙烯利对黄瓜幼苗叶片胞间隙液几丁质酶的诱导积累及对幼苗生长的影响。结果显示,与对照相比,乙烯利处理后黄瓜叶片胞间隙液蛋白质量浓度增加;几丁质酶活性水平也随乙烯利处理质量浓度的增加出现不同幅度上升,其中,252mg/L的乙烯利对几丁质酶诱导作用最强;通过SDS-PAGE电泳,观察到252mg/L乙烯利处理后第1天,一种27.0ku几丁质酶在胞间隙积累,并在随后的取样时间显著表达。Western blotting分析进一步证实了上述结果。此外,与对照相比,质量浓度分别为126mg/L和252mg/L乙烯利处理后第7天,黄瓜幼苗株高增量显著降低,252mg/L处理的茎粗增量显著增加。乙烯利可以诱导黄瓜叶片胞间隙几丁质酶的累积,诱导的效果与黄瓜叶片对乙烯利质量浓度的感受直接相关。     

华山松疱锈病的重寄生真菌(深绿木霉)中几丁质酶基因cDNA片段的克隆(英文)

[Objective] The aim of this study was to isolate chitinase gene from Trichoderma atroviride strain SS003. [Method] With the aeciospore wall of armandii pine blister rust as inducer, chitinase gene was induced to express in Trichoderma atroviride cells. The cDNA fragment of chitinase gene was cloned by RT-PCR approach. [Result] The activity of chitinase induced reached 40.17 μg/10 min; and the specific fragment amplified was 834 bp in length and proved to be the fragment of chitinase gene by sequencing and sequence analysis. [Conclusion] The result showed the feasibility of isolating the full length of chitinase gene and its transformation, and further producing chitinase.     

农林业用功能性吸水树脂的研究概况

高吸水性树脂是一类新型的功能性高分子材料,近年来在农林业得到广泛的关注,展示了极大的应用前景。本文在对吸水性树脂的生产概况、消费情况、性能、合成方法及应用领域进行分析的基础上,结合农林业的特点对农林业使用的高吸水性树脂的发展进行了预测。     

保水剂对煤矸石基质上高羊茅生长及营养吸收的影响

为探索保水剂对煤矸石废弃地上高羊茅生长及营养特征的影响,按煤矸石与土壤质量比设3种基质梯度,每种基质分别添加3种质量的保水剂,设对照(CK),共10种处理。观测和分析不同处理下高羊茅的生长高度、生物量、营养特征及SPAD值(相对叶绿素含量),结果显示:保水剂主要影响高羊茅地上部分的生物量,而煤矸石与土壤的质量比主要影响地下部分的生物量;煤矸石与土壤质量比相同条件下,添加1 g/kg的保水剂即可促进高羊茅的生长,添加2 g/kg保水剂能使高羊茅尽快适应基质环境,使其日均生长率在出苗后第2周达到峰值。煤矸石基质中添加保水剂能促使高羊茅将煤矸石基质中的营养元素从植株地下部分向地上部分转移,供植株生长需要,基质中添加1 g/kg保水剂时高羊茅对磷的吸收效果最好。此外,添加保水剂能使叶片的SPAD值增加。综合比较不同处理下高羊茅的株高、生物量、营养特征及叶片的SPAD值认为,处理6(煤矸石与土壤质量比为750:250、基质中添加2 g保水剂)与处理8(煤矸石与土壤质量比为500:500、基质中添加1 g保水剂)是适合煤矸石废弃地上高羊茅生长的较好配比。