小麦TaNAC-B072基因的克隆和表达分析

为了研究小麦NAC转录因子的功能及其对逆境胁迫的响应,本试验克隆了小麦的TaNAC-B072基因。该基因的开放阅读框长度为978 bp,编码蛋白长度为325个氨基酸,推测其分子量为35.75 kDa,等电点为7.06,属于中性蛋白,具有1个NAC结构域。多序列比对和系统进化树分析显示,TaNAC-B072与BdNAC72-like的亲缘关系较近。RT-PCR结果显示,在小麦的根和地上部分,TaNAC-B072基因的表达受高盐、渗透和冷胁迫的诱导,初步推测基因TaNAC-B072可能与小麦响应逆境胁迫有密切的关系。     

生姜转录因子基因ZoNAC17 的克隆与表达分析

NAC类转录因子在植物逆境胁迫应答过程中具有极其重要的作用。为进一步探索NAC转录因子的结构与功能,基于生姜转录组数据库,利用RT-PCR法克隆生姜转录因子基因ZoNAC17,采用数字表达谱分析生姜不同组织的ZoNAC17表达图谱。序列分析结果显示,生姜ZoNAC17基因的ORF长度为1 815 bp,编码604个氨基酸残基,分子量为67.52 k D;转录因子ZoNAC17等电点为4.59,不存在信号肽,为跨膜蛋白,亚细胞定位于细胞核。系统进化树分析表明,生姜ZoNAC17与小果野蕉MaNAC17基因亲缘关系最近。数字表达谱结果表明,ZoNAC17在生姜不同组织中均有较强表达,在成熟组织中的表达量为地上茎叶片根茎。在生姜根茎的发育过程中,ZoNAC17表达量先增加,后逐渐减少,且在生长约3个月的发育期表达量最高。     

小麦TaTDR-Like基因的克隆及表达分析

【目的】克隆小麦绒毡层退化基因（Tapetum degeneration retardation,TaTDR-Like）,研究其组织表达及不同育性材料间花药不同发育时期的时空表达模式,为深入揭示小麦花药异常发育的分子机制打下理论基础。【方法】以普通小麦品种西农1376（MF-XN1376）为材料,通过PCR扩增克隆得到TaTDR-Like基因的3个同源拷贝,利用生物信息学分析TaTDR-Like蛋白特性及TaTDR-Like基因启动子顺式作用元件,利用实时荧光定量PCR检测TaTDR-Like基因的组织表达情况及在可育、不育材料花药不同时期中的时空表达模式,利用酵母双杂交技术进行自激活检测,并构建植物融合表达载体35S-TaTDRLD-EGFP,通过农杆菌介导转入烟草叶片表皮细胞,观察TaTDRL-D蛋白亚细胞定位情况。【结果】成功克隆小麦TaTDR-Like基因,发现该基因存在3个同源拷贝即TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D,分别编码550、553、557个氨基酸,其蛋白分子量分别为58.50、58.90和59.21 kD,等电点（pI）分别为4.77、4.66和4.63。TaTDR-Like蛋白均在C端有1个bHLH保守结构域,其中TaTDRL-A与TaTDRL-B的保守结构域相似度达100%,与TaTDRL-D的保守结构域相似度为96%,TaTDRL-D与OsTDR、AtAMS保守结构域相似度分别为98%和88%;系统发育进化树表明TaTDR-Like蛋白与大麦（KAE8787147.1）、二穗短柄草TDR（XP_014756384）、水稻TDR（Os02g0120500）和拟南芥AMS（AT2G16910.1）的进化关系较密切;启动子分析表明TaTDR-Like基因启动子处含有较多光响应元件、非生物应激反应、激素响应元件等顺式作用元件;组织特异性表达分析显示TaTDRL-D在花药中的表达量最高,而TaTDRL-A和TaTDRL-B在幼穗表达量较高;对花药发育不同时期表达分析显示TaTDRL-D在花药发育单核早期表达量最高,之后逐渐降低,单核晚期到三核期不育材料（CMS-XN1376）表达量均高于可育材料（MF-XN1376）;自激活检测结果表明TaTDRL-D具有转录激活活性;亚细胞定位显示TaTDRL-D蛋白定位于细胞核。【结论】TaTDRL-D基因可能参与小麦花药发育,负调控花药育性。     

巴西橡胶树HbNTL2基因的克隆和表达分析

利用RT–PCR和实时荧光定量PCR技术,对巴西橡胶树膜结合转录因子HbNTL2进行克隆和表达,并通过酵母试验进行转录激活功能分析。结果表明,HbNTL2基因的开放阅读框为1 380 bp,编码一个由459个氨基酸组成的蛋白,该蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC001亚族;在第6～172位氨基酸之间含有典型的NAC结构域,第433~453位氨基酸具有跨膜结构域,是膜结合NAC转录因子;HbNTL2具有转录激活功能,转录激活区在C–末端;HbNTL2在叶片的表达高于在橡胶树的其他部位,受割胶、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)处理以及低温胁迫诱导。综合分析结果表明,HbNTL2可能参与调控巴西橡胶树的生长发育和胁迫应答过程。     

细叶百合LpNAC13基因的克隆及其表达

以细叶百合(Lilium pumilum)鳞茎为试验材料,采用RT-PCR方法,克隆得到1个新的NAC转录因子基因,命名为LpNAC13(GenBank登录号MF398204),并用qRT-PCR技术检测该基因在ABA、干旱、低温和高盐胁迫处理下的时空表达。序列分析表明,LpNAC13的开放阅读框为627 bp,编码208个氨基酸,蛋白相对分子质量为20.423 ku,理论等电点为9.58。序列同源性和系统进化树分析表明LpNAC13属于NAC基因家族,与海枣(Phoenix dactylifera)NAC蛋白具有最高同源性,同源性达到56.32%,属于SENU5亚族。实时定量qRT-PCR分析显示,LpNAC13基因能被ABA、干旱、低温和高盐胁迫诱导表达,且在不同植物组织器官中存在表达差异。该研究为深入了解LpNAC13基因的功能奠定了基础。     

花生AhbHLH63基因的克隆与表达分析

bHLH转录因子在调节植物生长发育中起着重要作用。本研究利用转录组测序结果从栽培种花生丰花1号中克隆得到AhbHLH63基因。序列分析显示,AhbHLH63基因有两个剪接体AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2,其ORF分别长1 188 bp和1 152 bp,分别编码395个氨基酸和383个氨基酸组成的蛋白。亲缘关系分析表明,AhbHLH63蛋白含有一个预测的bHLH结构域,与其他植物的bHLH63具有较高的同源性,与苜蓿等的同源蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2表达模式基本一致,均为组成型表达,在花中表达量最高,茎和叶中次之,在根中表达量最低;在花生种子的不同发育时期,发育中期表达量较高。     

苦荞转录因子FtNAC15基因的克隆及表达分析

为研究NAC转录因子在苦荞中的功能,从苦荞发育种子中克隆了一个NAC家族基因,其开放阅读框全长1 098 bp,编码365个氨基酸,将其命名为FtNAC15。基因结构分析表明:FtNAC15基因由3个外显子和2个内含子组成。氨基酸序列多重比对和进化关系分析表明:FtNAC15蛋白与水稻ONAC003、拟南芥ANAC010和ANAC073亲缘关系较近,属于NAC家族转录因子家族中同一亚组。基因上游启动子序列顺势作用元件分析表明:该基因启动子中的顺式作用元件可以分为5类,即启动子核心元件、节律和光照响应元件、转录因子结合位点、非生物胁迫响应元件和激素响应元件。表达分析表明:FtNAC15基因在种子发育的成熟期和干旱胁迫下上调表达,表明其参与调控荞麦种子发育和响应干旱胁迫。     

越橘VcNAC072克隆及其促进花青素积累的功能分析

目的 分离越橘VcNAC072（NAM,ATAF1/2,CUC2）转录因子,分析其表达模式并探讨其在调控花青素合成过程中的功能,为进一步研究越橘花青素积累的调控机理提供理论基础。方法 以‘公爵’越橘（Vaccinium corymbosum ‘Duke’）为试材,克隆VcNAC072。通过农杆菌介导法获得转基因拟南芥,比较转基因和野生型拟南芥花青素积累的差异。利用酵母单杂交和瞬时表达试验,分析VcNAC072对MYB转录因子AtPAP1的转录调控。结果 克隆获得越橘VcNAC072,该基因CDS为1 032 bp,编码含有343个氨基酸的蛋白质,含有1个保守的NAC结构域。表达分析显示,该基因在不同发育阶段的果实中均可表达,但表达差异明显,在粉色和蓝色果实中表达量较高,在绿色果实中表达量最低。随着VcNAC072表达的升高,果实中花青素含量呈递增的趋势。分析AtPAP1启动子序列,发现其序列中包含NAC转录因子的结合位点。酵母单杂交和烟草瞬时表达试验结果表明,VcNAC072可与AtPAP1的启动子相互作用,并激活其表达。在野生型拟南芥中异位表达VcNAC072,其种子中花青素积累量显著高于野生型。结论 推测VcNAC072在越橘果实中正向调节花青素的积累。     

小麦TaSIM基因结构及表达分析

根据小麦TaSIM基因的cDNA序列设计引物,采用PCR技术从小麦中克隆TaSIM基因的DNA序列,采用半定量RT-PCR方法研究TaSIM基因在不同组织中的表达。结果表明:TaSIM编码区DNA序列长度为2 355bp,包含2个外显子和1个内含子。分析发现内含子富含AT,在内含子中发现2个MYB转录因子结合位点。半定量RT-PCR检测表明,TaSIM基因在不同组织中均有表达,在雄蕊中的表达量最高。TaSIM表达量依次为雄蕊>雌蕊>根>茎>叶。     

小麦TaPAT1-2D基因的克隆与表达分析

GRAS(GIBBERELLIN-INSENSITIVE, repressor of ga1-3 and SCARECROW)基因家族作为重要的植物转录因子在调控植物生长发育、抵抗逆境胁迫的各种信号转导途径中发挥重要作用。为进一步挖掘该家族小麦抗赤霉病相关基因,从禾谷镰刀菌诱导的小麦转录组测序数据筛选出差异表达基因TaPAT1-2D(TraesCS2D02G198200.1),克隆该基因的全长序列,并对其进行生物信息学和表达模式分析,以及亚细胞定位和酵母转录激活活性研究。生物信息学分析结果表明：TaPAT1-2D序列全长1 668 bp,编码555个氨基酸,分子量约为61.34 ku; TaPAT1-2D蛋白含有典型GRAS功能结构域,在进化关系上与水稻OsCIGR2(LOC＿Os07g39470.1)关系较近;TaPAT1-2D启动子区包含茉莉酸甲酯、脱落酸、生长素等植物激素响应元件与光应答元件等。实时荧光定量PCR结果显示,接种禾谷镰刀菌孢子液72 h后,TaPAT1-2D基因在4个不同赤霉病抗性小麦品种中的相对表达水平明显上调,表明该基因参与赤霉病的响应过程。农杆菌介导的烟草中瞬...     

葡萄风信子MaMYB1基因的克隆及表达分析

【目的】克隆葡萄风信子MYB转录因子基因(MaMYB1),并对其进行生物信息学和表达模式的分析。【方法】以开蓝色花的葡萄风信子品种"亚美尼亚"为材料,利用RACE技术得到其MaMYB1基因cDNA全长,对其进行生物信息学分析,利用酵母单杂交方法检测其转录激活活性,并用实时定量PCR方法分析该基因在根、茎、叶及不同发育时期花中的表达特性。【结果】通过RACE-PCR,克隆得到953bp的MaMYB1基因,其开放阅读框长750bp,编码249个氨基酸,推测的蛋白分子质量约为27.7ku,理论等电点为9.3。MaMYB1基因编码的蛋白序列中具有2个典型的MYB结构域R2和R3,且在R3结构域下游含有与BHLH蛋白结合的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域。MaMYB1与玉米ZmP1及拟南芥MYB12的关系较近。酵母单杂交检测表明:MaMYB1具有转录激活活性。实时定量PCR分析结果表明:MaMYB1在不同组织中均有表达,以在花中表达量较高,且在花不同发育时期表达量差异显著。【结论】从葡萄风信子中克隆到1个新的MYB基因MaMYB1;推测该基因可能参与了葡萄风信子花发育过程的调控。     

马尾松PmMYB169基因的克隆及表达分析

MYB基因家族在植物生长发育和应答逆境胁迫中有重要作用.通过RT-PCR和RACE技术从马尾松中克隆获得了PmMYB169全长cDNA序列,分析了其在低磷胁迫下的表达特性.PmMYB169全长为1 407bp,开放阅读框为927bp,编码308个氨基酸.生物信息学分析表明,PmMYB169蛋白序列中存在MYB家族结构区域,属于R2R3类MYB转录因子;同源性分析表明,PmMYB169在MYB家族保守区域上同源性较高,它与北美云杉亲缘关系最近.荧光定量PCR对低磷胁迫下PmMYB169的表达分析结果表明,PmMYB169的表达量随低磷胁迫时间延长呈上调趋势,说明PmMYB169参与了低磷胁迫应答;对不同组织的表达分析发现,PmMYB169为组成型表达,在马尾松根茎叶中均有表达,以叶的表达量最高.     

梭梭HaNAC2的表达分析和抗逆功能鉴定

NAC是植物特有的转录因子家族之一,具有高度保守的NAC结构域,在植物生长发育和胁迫应答等过程中发挥着重要的调节功能。利用qRT-PCR技术对梭梭 HaNAC2在不同胁迫处理下的表达模式进行分析,并通过叶盘法转化烟草,在干旱、高温及高盐胁迫处理下对转 HaNAC2基因烟草进行抗逆性分析。结果表明 HaNAC2可响应模拟地表高温、模拟干旱、高盐胁迫,以及植物生长素(IAA)、脱落酸(ABA)处理,过表达 HaNAC2的转基因烟草在干旱、高温及高盐胁迫处理下具有更强的抗旱性、耐热性和耐盐性。     

山葡萄VaCBF1转录因子基因的克隆与表达分析

【目的】克隆山葡萄(Vitis amurensis)CBF1转录因子基因(VaCBF1),为其功能的深入研究及其在植物抗寒基因工程中的应用奠定基础。【方法】根据植物CBF基因AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,利用PCR法从山葡萄cDNA中扩增VaCBF1基因的中间片段。再根据中间片段区域设计2对特异引物,采用反向PCR法扩增VaCBF1基因的5′端和3′端序列。将中间片段与5′端和3′端序列拼接后得到山葡萄VaCBF1基因的cDNA全长序列,据此设计1对特异引物,PCR扩增VaCBF1基因编码区的全长序列,并对其进行生物信息学分析。同时,利用荧光定量PCR分析山葡萄VaCBF1基因在不同逆境胁迫(干旱、低温、盐胁迫)下的表达情况。【结果】成功地从山葡萄中克隆得到VaCBF1基因cDNA全长序列,其长度为762bp,编码253个氨基酸,在GenBank注册号为DQ517296。同源性分析证实,VaCBF1属于CBF转录因子家族。荧光定量PCR分析发现,低温胁迫可以诱导山葡萄VaCBF1基因高表达,而该基因的表达不受盐及干旱处理诱导。【结论】首次从山葡萄中克隆了VaCBF1基因,并证实该基因参与了植物对低温胁迫的应答。     

水稻叶片融合基因LF1的图位克隆及功能分析

[目的]克隆并解析水稻叶片融合基因LF1(Leaf Fusion 1)的功能,为阐明水稻叶片发育的分子机制奠定基础.[方法]lf1为水稻品种'02428'组织培养获得的叶片融合突变体.利用水稻叶片融合突变体lf1与籼稻品种'N22'构建遗传分离群体,精细定位lf1;结合突变体重测序分析确定候选基因,经基因敲除克隆LF1...     

小麦逆境胁迫相关基因TaC2DP1的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,并对其序列特征、进化关系和表达特性进行分析,探讨该基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能,为进一步解析植物的抗逆机制提供候选基因和理论依据。【方法】以cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列为探针,对小麦EST数据库进行搜索,筛选与探针同源性在97％以上的EST序列,通过电子克隆结合RT-PCR获得该基因cDNA全长,采用生物信息学软件分析比较克隆基因的保守结构域及序列特征;采用MEGA6.0软件构建该基因的系统进化树;将测序正确的该基因片段通过EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pMAL-c2X,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导1-5 h后,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析该基因在小麦不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高温和ABA处理下的表达模式。【结果】成功获得小麦cDNA全长序列,命名为TaC2DP1。该基因序列全长为1 356 bp,包含一个1 209 bp的开放阅读框（ORF）,5′端非编码区50 bp,3′端非编码区97 bp,编码402个氨基酸,推导编码蛋白质的预测分子量为43.41 kD,等电点为4.30,属于酸性蛋白,BLAST分析表明,该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域,称为C2结构域（C2-domain）。多序列比对及进化树分析表明,TaC2DP1与乌拉尔图小麦TuC2亲缘关系最近,二者具有高度的同源性,其编码的氨基酸一致性达到91%;蛋白质结构预测分析显示TaC2DP1无跨膜螺旋和双硫键,亚细胞定位于细胞质中;成功构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-TaC2DP1,在IPTG诱导下得到90 kD左右的蛋白,与理论值一致。通过实时荧光定量PCR进行TaC2DP1表达分析,显示该基因在小麦的根、茎、叶、幼穗、未成熟籽粒、胚及胚乳中均有表达,其中在幼穗中表达量最高,在花后5 d籽粒中表达量最低。TaC2DP1可被植物激素ABA诱导而上调表达;干旱胁迫过程中,TaC2DP1受胁迫诱导呈稳定上调表达趋势;高温和低温胁迫过程中,TaC2DP1均在胁迫后的0.5 h迅速诱导上调表达,分别为对照的21和17倍。推测该基因可能参与小麦ABA 信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦TaC2DP1的全长序列,其编码蛋白含有与钙离子结合的C2结构域;在低温、干旱、高温和ABA逆境胁迫下,TaC2DP1属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,可能在干旱、低温和热胁迫中发挥重要作用。     

甘蓝NAC转录因子BoNAC2的克隆及表达分析

为探索甘蓝(Brassica oleracea L.)在各种非生物逆境条件下NAC转录因子的表达,以"中甘11号"为材料,克隆获得甘蓝NAC转录因子BoNAC2基因的cDNA全长序列。序列分析表明,该cDNA片段全长为1 002bp,编码333个氨基酸,具有典型的NAC类蛋白的结构特征。进化树分析表明,该蛋白属于SENU5亚族,并与甘蓝型油菜(Brassica napus L.)BnNAC亲缘关系最近。亚细胞定位显示,BoNAC2蛋白分布于细胞核中。qRT-PCR分析表明,BoNAC2基因受PEG和NaCl诱导表达。     

栽培小麦Brock中转录因子基因WRKY的克隆与表达分析

WRKY类转录因子在植物抵抗外界胁迫上起重要作用。本研究在小麦中分离到一个WRKY类转录因子基因Ta WRKY,该基因序列全长1 242 bp,推测编码蛋白含354个氨基酸,相对分子量为86 k D,理论等电点为4.96,与小麦中WRKY8序列同源性为97%。进化树分析表明,Ta WRKY与小麦中WRKY8亲缘关系较近。基因的诱导表达模式分析显示,Ta WRKY受白粉菌诱导,染菌8 h达到表达最高值。上述试验结果初步说明,Ta WRKY基因在小麦抵抗白粉菌侵染过程中可能发挥着重要作用。     

MlNAC2基因的克隆及其在南荻根部的表达模式分析

本研究中克隆了南荻MINAC2基因的cDNA序列,该序列全长为933bp,编码产物含310个氨基酸残基,该蛋白质理论上的相对分子质量为34,427.8,等电点(pI)为5.85,不稳定系数为34.84,为稳定蛋白,具有保守的NAM基序,无信号肽和跨膜结构域,推测为亲水性蛋白。亚细胞定位试验证明MlNAC2定位于细胞核,它可能在细胞核内行使功能。转录激活试验揭示MlNAC2是一个转录因子蛋白,且转录激活域位于C端。荧光实时定量PCR分析表明,高盐、干旱、脱落酸、茉莉酸甲酯和机械伤害均能诱导MlNAC2基因在南荻根部表达上调,而低温处理时表达下调。