2型猪链球菌的毒力因子的鉴定及分布

为探讨河南省2型猪链球菌的毒力及分布情况,本实验设计3对引物,分别扩增溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,MRP)、胞外因子(extracellular protein fateror,EPF)和溶血素(suilysin,SLY)基因,对2016年1月～2016年12月从河南省猪场采集的各种组织病料中分离鉴定出的87株2型猪链球菌进行了初步的小鼠毒力试验和mrp、epf、sly基因的扩增。结果表明,河南省流行的2型猪链球菌的菌株均对小鼠有毒力,共有8种毒力基因型,其中以毒力相对高的sly+mrp+epf+型为主,其次为sly+mrp-epf+型和sly-mrp+epf+型。     

屠宰场猪链球菌分离菌株分型及其致病性和耐药性分析

为了解吉林省猪链球菌的流行情况,从屠宰场采集的猪咽拭子和鼻拭子样品中分离鉴定猪链球菌,并进行菌株血清型、基因型和毒力表型的鉴定,以及致病性和耐药性的分析。结果表明,从100份样品中共分离鉴定猪链球菌104株,其中29株鉴定为血清2型、9型和1型等几种常见的致病性血清型,其他75株不属于常见的致病性血清型。血清2型的菌株中,2株经鉴定为ST1基因型和mrp+epf+sly+毒力型,并经动物试验鉴定为强毒菌株;其他菌株均为ST28基因型和mrp+epf-sly-毒力型,具有中等毒力。血清9型的菌株,均为mrp-epf-sly-毒力型,动物试验鉴定均为强毒菌株。根据Kirby-Bauer纸片扩散法的药敏试验结果,98%的猪链球菌分离株对四环素耐药;对大环内酯类、克林霉素和链霉素的耐药率都在50%以上;对β-内酰胺类、氯霉素和喹诺酮类抗生素的耐药率小于20%。总体分析,从屠宰场分离的猪链球菌强毒菌株所占的比例并不高,但是菌株多重耐药的情况非常严重。     

猪链球菌4型分离株生物学特性研究

为分析猪链球菌4型(Streptococcus suis type 4,SS4)分离株的病原生物学特性,试验对来自中国不同地区的10株猪链球菌4型进行了多位点序列分型,通过PCR方法对猪链球菌7个保守管家基因aroA、gki、dpr、mutS、recA、thrA、cpn60进行扩增,测序后将结果上传至MLST数据库查找序列型,然后制作聚类分析图来阐明菌株之间的亲缘关系;采用PCR方法对7种主要的毒力基因gdh、mrp、epf、sly、fbps、gapdh与orf2进行鉴定,通过毒力因子谱来分析猪链球菌4型毒力因子的分布;以纯化的10株细菌对BALB/c小鼠进行动物致病性试验,根据小鼠致死数量筛选出最强毒株,并进行新西兰兔致病性试验。结果显示,10株猪链球菌4型经多位点序列分型,6株为ST850型,3株为ST1006型,1株为ST94型;结合菌株分离地区分析发现,广东和江苏地区菌株有较高的同源性,江沪地区菌株出现分化现象,表现为遗传多样性;10株菌株均检测到了gdh、gapdh和orf2毒力基因,7株检测到sly基因,4株检测到fbps基因,根据毒力因子谱发现共有3个毒力基因型,gdh+sly+gapdh+orf2+型有6株,gdh+fbps+gapdh+orf2+型有3株,gdh+sly+fbps+gapdh+orf2+型仅有1株。动物致病性试验表明,10株细菌均能使BALB/c小鼠死亡,其中SH1510的半数致死量低至1×108 CFU,对小鼠的致病性最强,将纯化的SH1510菌液接种新西兰兔,可使新西兰兔出现典型的神经症状并死亡。以上结果为猪链球菌的遗传进化、毒力研究提供了新的数据,丰富了猪链球菌病的研究。     

猪链球菌4型分离株生物学特性研究

为分析猪链球菌4型(Streptococcus suis type 4,SS4)分离株的病原生物学特性,试验对来自中国不同地区的10株猪链球菌4型进行了多位点序列分型,通过PCR方法对猪链球菌7个保守管家基因aroA、gki、dpr、mutS、recA、thrA、cpn60进行扩增,测序后将结果上传至MLST数据库查找序列型,然后制作聚类分析图来阐明菌株之间的亲缘关系;采用PCR方法对7种主要的毒力基因gdh、mrp、epf、sly、fbps、gapdh与orf2进行鉴定,通过毒力因子谱来分析猪链球菌4型毒力因子的分布;以纯化的10株细菌对BALB/c小鼠进行动物致病性试验,根据小鼠致死数量筛选出最强毒株,并进行新西兰兔致病性试验。结果显示,10株猪链球菌4型经多位点序列分型,6株为ST850型,3株为ST1006型,1株为ST94型;结合菌株分离地区分析发现,广东和江苏地区菌株有较高的同源性,江沪地区菌株出现分化现象,表现为遗传多样性;10株菌株均检测到了gdh、gapdh和orf2毒力基因,7株检测到sly基因,4株检测到fbps基因,根据毒力因子谱发现共有3个毒力基因型,gdh+sly+gapdh+orf2+型有6株,gdh+fbps+gapdh+orf2+型有3株,gdh+sly+fbps+gapdh+orf2+型仅有1株。动物致病性试验表明,10株细菌均能使BALB/c小鼠死亡,其中SH1510的半数致死量低至1×108 CFU,对小鼠的致病性最强,将纯化的SH1510菌液接种新西兰兔,可使新西兰兔出现典型的神经症状并死亡。以上结果为猪链球菌的遗传进化、毒力研究提供了新的数据,丰富了猪链球菌病的研究。     

江西省猪链球菌的分离鉴定及耐药基因、毒力基因检测分析

为了解猪链球菌临床分离株的生物学特性、耐药基因与毒力基因的携带情况。采集疑似链球菌感染病死的猪肺脏和关节液,用常规方法分离细菌,通过镜检、16S rRNA序列测定分析、分子分型、动物实验鉴定分离菌的生物学特性,用药敏试验进行药物敏感度测定,并利用PCR检测耐药基因及毒力基因。结果可知,从8个养猪场的10份肺脏和关节液中共分离到10株菌,经16S rRNA序列比对和血清分型,10株分离株均为猪链球菌,其中9型7株,1型1株,其余2株为猪豕链球菌和猪生殖道链球菌;小鼠致病性试验结果显示,分离株JXNC1906、JXJJ1904和JXNC1904的毒力较强;毒力基因检测显示,JXNC2103可检出6种毒力基因,JXNC2011株只检出mrp毒力基因,毒力型mrp⁺ef^-gdh⁺sly⁺mmum⁺Orf2⁺2株、mrp^-ef⁺gdh⁺sly^-mmum⁺Or...     

猪链球菌的分离鉴定及耐药性分析

为了鉴定青岛地区3个猪场病死猪的致病菌,试验采用形态学观察、生化试验、16S rRNA PCR鉴定、血清型鉴定、毒力因子基因表型检测及药敏试验等方法对分离得到的3株细菌进行研究。结果表明:这3株细菌均为革兰氏阳性链状球菌,生化特性与猪链球菌的生化特征大致相符;16S rRNA PCR产物测序结果证实3株细菌均为猪链球菌;用猪链球菌1,2,7,9型特异性引物进行PCR扩增,3株细菌均为猪2型链球菌,其中有2株细菌的毒力因子基因表型为Mrp+Epf+Sly+,1株细菌毒力因子基因表型为Mrp-Epf+Sly+;3株细菌对大部分β内酰胺类、氟喹诺酮类抗生素敏感,对多肽类、林可胺类抗生素耐药。说明猪场分离得到的3株细菌均为2型猪链球菌,可选用β内酰胺类、氟喹诺酮类抗生素进行治疗。     

猪链球菌2型毒力因子与MLST分型分析

为了解我国猪链球菌2型毒力因子和MLST型的特点,对四川、重庆和山东等地的22株猪链球菌2型进行毒力因子检测和ST型分析。结果显示,78%(17/22)的分离株为sly+mrp+epf+基因型的强毒株,仅山东省的5株分离株为弱毒力型。四川省和重庆市89%(15/17)的分离株为毒力较强的ST7型,而山东省的分离株均为毒力稍弱的ST1型。结合这些地区的猪链球菌病发病情况,分析提示猪链球菌2型的毒力因子和ST分型与菌株的致病性有一定的相关性。     

猪9型链球菌的分离鉴定及其生物学特性研究

为确诊某猪场猪发病死亡原因并调查分离菌株的致病性与耐药情况,用常规方法分离细菌,并对分离菌进行培养特性、16 S rDNA测定及致病性、毒力基因和耐药性检测。结果显示,从病死猪分离到1株9型猪链球菌,与GenBank收录的9型猪链球菌GZ0565同源性高达99.9%。毒力因子检测为cps9H~+ orf2~+ gdh~+ fdps~+毒力型,小鼠致病性试验鉴定为强毒株。药敏试验和耐药基因检测结果显示,该菌株对呋喃妥因、环丙沙星、头孢哌丁等药物高敏,对苯唑西林、氨曲南、卡那霉素、复方新诺明、多黏菌素B、林可霉素等药物完全耐药,存在四环素类、氨基糖苷类、磺胺类、喹诺酮类耐药基因。研究表明,此次疫情由9型致病性猪链球菌引起。     

辽宁省猪链球菌流行株主要血清型毒力因子检测及其致病性

为了解辽宁省猪链球菌流行菌株主要血清型毒力因子分布特征及致病性,依据猪链球菌属保守基因及血清型特异性基因,从辽宁地区采集猪链球菌疑似病例肺脏、肝脾、脑、关节液等样品进行猪链球菌及其血清类型鉴定;应用猪链球菌6种主要毒力因子特异性基因扩增检测方法,检测所分离到的不同血清类型猪链球菌的毒力因子分布情况,并应用小鼠攻毒试验和病理学技术对其致病性进行观察研究。结果显示:从辽宁地区采集的72个样品中共分离到23株猪链球菌,主要血清型有1,2,7型,其中SS1型4株,SS2型2株,SS7型5株。其余12株未确定血清型。SS1、SS2、SS7型阳性率分别为17.39%,8.69%,30.43%。毒力因子检测结果显示,上述6种毒力因子检出率分别为100%,66.6%,25%,16.7%,75.0%,58.3%,其中SS2均具备6种毒力因子,SS1、SS7和血清型阴性株猪链球菌均具有部分毒力因子,与SS2的差异毒力因子为epf。SS2可引起小鼠的急性败血症以及脑膜炎,SS1、SS7均可引起小鼠发病,但各器官的损伤则较轻。SS1、SS2、SS7脑内接种均可引起小鼠脑膜炎,炎症反应SS2最重,SS1次之,SS7最轻。     

猪链球菌2型毒力预测模型的建立

[目的]建立猪链球菌2型毒力强弱的预测模型,为降低养猪业的经济损失提供参考。[方法]本研究以已报道的国内猪链球菌2型分离株的6种主要毒力因子（mrp、epf、sly、orf2、fbps、gapdh）的存在情况为自变量,以毒力强弱为因变量,采用逐步回归的方法进行二分类Logistic回归分析,得出鉴别猪链球菌2型毒力强弱的数学模型,并通过ROC曲线评价其预测效能。[结果]进入回归方程的指标有：mrp（X1）和sly（X3）,求得的回归方程为：P=1/〔1+e-（-5.671+4.642 X1+4.253X3）〕。ROC曲线最佳诊断点为0.5581。回归方程对毒力强弱预测的敏感度为93.8%,特异度为94.6%,准确度为94%。[结论]联合运用Logistic回归和ROC曲线预测猪链球菌2型毒力的强弱是可行的,mrp和sly两个指标独立应用对鉴别都有诊断价值,但二者联合起来诊断价值更高且预测效果更理想。     

广西部分地区猪链球菌血清型及其毒力因子流行性调查分析

为探究广西部分地区猪链球菌(Streptococcus suis,SS)流行菌株主要血清型及毒力因子分布情况。本试验于2018年1月至2018年6月对从多个猪场采集到的116份疑似链球菌感染的组织病料(脑、肺脏、淋巴结等)进行病原菌检测,采用细菌分离鉴定、形态学观察及PCR扩增等方法对病原菌及其血清型和部分毒力因子进行鉴定。结果显示,116份样品共分离到链球菌32株,阳性率为27.59%(32/116),其血清型主要以SS2和SS9为主,分离率分别为40.63%(13/32)和43.75%(14/32),其他血清型为15.63%(5/32);毒力因子检测结果表明:SLY、MRP、EPF以及SBP2′因子的检出率分别为:81.25%(26/32)、59.38%(19/32)、50.00%(16/32)和71.88%(23/32)。32株链球菌中以SLY^+MRP^+EPF^+SBP2′^+(13株)、SLY^+MRP^-EPF^-SBP2′^-(5株)、SLY^+MRP^+EPF^-SBP2′^+(5株)为主要的毒力基因型,其中SS2均能检测出3个或3个以上的毒力因子。玉林、柳州市主要分布SS9型,南宁、百色市主要分布SS2型;广西不同地区毒力因子的分布情况存在差异且不同血清型或同一血清型的链球菌毒力因子的分布情况也各不相同,其中SS2携带的毒力因子检出率明显高于其他血清型。该研究可为今后猪链球菌疫苗及致病机理研究提供理论依据,为广西地区猪场链球菌血清型疫苗选择提供指导。     

一株猪链球菌8型菌株的分离鉴定及其生物学特性研究

为明确天津市某猪场保育猪疑似发生猪链球菌病的病原菌及其致病力等生物学特性,将猪场一头发病猪扑杀,无菌采集病料于哥伦比亚血琼脂平板上划线培养,对分离的疑似菌株进行形态学观察、生化试验、16S rDNA序列分析和血清型鉴定,确定分离菌株为猪链球菌8型,命名为TJS31。药敏试验结果显示,TJS31株对8种受试药物耐药,4种受试药物中介,1种受试药物敏感。致病性试验结果显示,TJS31株经腹腔接种昆明小鼠,24 h内可以引起小鼠出现精神萎靡、扎堆、呼吸急促、发抖、运动迟缓、死亡等,LD50为1.8×10⁸ CFU/mL。毒力基因检测发现TJS31的毒力基因型为sly⁺/gdh⁺/orf2⁺/gapdh⁺,不携带mrp、epf和fbps基因。研究结果丰富了我国猪链球菌病病原的生物学资料,为猪链球菌8型的防控提供了依据,也为深入开展猪链球菌8型的致病机制和耐药机理奠定了基础。     

广东省1株猪2型链球菌的分离鉴定及部分生物学特性研究

为确诊引起广东省某规模化猪场保育仔猪发生死亡的病因,本试验采集病猪肝脏、脾脏、心脏、脑、关节液和淋巴结等病料进行细菌分离,并对分离菌株进行纯化培养、菌落形态观察、革兰氏染色、形态学观察、生化试验,用血清型特异性引物进行PCR扩增,并进行毒力基因检测、药敏试验、生长曲线测定及动物试验。结果显示,分离菌株在成牛血清琼脂平板上呈圆形、灰白色、表面光滑、边缘整齐的菌落,镜检为革兰氏阳性球菌,呈链状排列。该菌株的生化试验结果符合链球菌的特征,PCR扩增结果显示猪链球菌保守基因片段（gdh和gapdh）和猪2型链球菌特异的cps2J基因片段均为阳性,表明该分离菌株为猪2型链球菌。毒力基因检测结果表明,该菌株毒力因子基因型为gdh⁺/gapdh⁺/epf⁺/mrp⁺/sly⁺/orf2⁺/fbps⁺。分离菌株用营养肉汤培养6 h达到对数生长期,培养10 h的菌液D_{600 nm}值为0.310。药敏试验结果表明,该菌株对青霉素、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸钾等药物敏感,但对强力霉素耐药。动物试验结果表明,感染分离株的BALB/c小鼠未出现死亡且无明显临床症状,毒力较低。本研究为该猪场链球菌病的防控提供了重要参考信息。     

天津地区猪链球菌3型菌株的致病性及耐药特性研究

试验旨在对分离自天津地区发病猪场的7株猪链球菌3型菌株（Streptococcus suis type 3,SS 3）进行致病性和耐药特性研究。应用剂量为1.0×10⁷、1.0×10⁸和1.0×10⁹ CFU/只的细菌对小鼠进行致病力研究,用PCR方法检测7株SS 3型菌株的毒力基因mrp、ef、sly、gdh、gapdh、fbps和orf2,并对这7株SS 3型菌株进行药物敏感试验。致病力试验结果显示,接种剂量为1.0×10⁹和1.0×10⁸ CFU/只时分别有6和3株SS 3型菌株可使小鼠100.0%（5/5）发病死亡,接种剂量1.0×10⁷ CFU时仍有1株SS 3型菌株可使80.0%（4/5）小鼠发病死亡,这7株SS 3型菌株对小鼠的致病力依次为R15056 > R15042=S15030 > Y12024=Y09011 > Y13125 > Y13164。毒力基因检测结果表明,共有3种毒力基因型,R12024、Y13164、R15042和S15030株为gdh、gapdh、fbps和orf2毒力基因阳性,Y13125和R15056株为sly、gdh、gapdh、fbps和orf2毒力基因阳性,Y09011株为gdh、fbps和orf2毒力基因阳性。药物敏感性试验结果显示,7株SS 3型对头孢喹肟相对最敏感,其次为阿莫西林、环丙沙星和磺胺间甲氧嘧啶钠,但对强力霉素100.0%耐药,且所有菌株均呈现3重以上的耐药性。本研究为进一步开展天津地区SS 3型流行特点及致病机理研究奠定了基础,可为天津地区SS 3型菌株的综合防控提供理论指导。     

前噬菌体对猪链球菌毒力、环境适应性、耐药性及代谢活动的影响

旨在了解和掌握前噬菌体与猪链球菌(Streptococcus suis,SS)毒力、环境适应性、耐药性及代谢活动之间的关系,本研究对前噬菌体阳性菌株(简称阳性菌)与前噬菌体阴性菌株(简称阴性菌)进行了致病性试验、LD50的测定、组织荷菌数的测定及病理组织学观察、生物被膜(BF)形成能力的测定、药敏试验和转录组测序.结果...     

Isolation,Identification and Biological Characteristics Analysis of a Strain of Clinical Streptococcus suis Serotype 2

In order to determine the pathogen and its virulence characteristics of a suspected case of piglets streptococcosis in a pig farms in Jiangxi province during September to November of 2013,a strain was isolated from the joint fluid and cerebrospinal fluid of one diseased piglet.The isolated strain was identified by culture characteristics,biochemical test,16S rDNA sequence analysis,serotype PCR test and further studied the presence of the following virulence genes:Glutamate dehydrogenase (gdh),virulent-assocciated sequence (orf2),fibronectin-binding proteins (fbps),suilysin (sly),extracellular protein factor (epf),muramidase-released protein (mrp) and antibiotic sensitivity tests.The isolated strain was identified as Streptococcus suis serotype 2 by culture characteristics,biochemical test,16S rDNA sequence analysis and serotype PCR test,and it was named as JMS2. Detection results of virulence gene showed that the distribution of main virulence genes of JMS2 were gdh⁺/orf2⁺/fbps⁺/sly^-/epf^-/mrp^-,suggesting that the strain maybe not likely to be high virulence.Drug sensitivity tests showed that the JMS2 was susceptibility to β-lactams such as penicillin,amoxicillin,but resistant to azithromycin,SMZ-TMP,and so on.The result was significant for the clinical prevention and treatment of swine streptococcosis.     

一株临床2型猪链球菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了确定2013年9月至2013年11月江西省某规模猪场仔猪疑似发生猪链球菌病的病原菌及其毒力特性,本试验将病猪剖杀,采取脑脊液和关节液在血平板上划线进行细菌分离培养,将分离到的菌株进行生化试验、16S rDNA序列分析及基因血清分型鉴定,进一步对其进行毒力基因(gdh、orf2、fbps、sly、epf、mrp)检测和药敏性测定。结果显示,分离菌株在血平板上形成灰色"半透明"边缘整齐的有草绿色狭窄溶血环的光滑型圆形细小菌落,镜检呈散在排列的革兰氏阳性短链球菌,结合生化试验、16S rDNA序列分析及基因血清型分型,确定其病原为2型猪链球菌,命名为JMS2。毒力因子基因检测结果显示,JMS2主要毒力因子分布为gdh⁺/orf2⁺/fbps⁺/sly^-/epf^-/mrp^-,预示JMS2可能不是强毒力菌株。药敏试验结果显示,JMS2对β-内酰胺类抗生素如青霉素、阿莫西林等敏感,但对阿奇霉素、复方新诺明等细菌蛋白质合成抑制剂类抗生素耐药。本研究对临床防控猪链球菌病具有参考意义。     

双组分系统CpxR影响禽致病性大肠杆菌的耐药性、抗血清杀菌能力及毒力

CpxR是细菌中Cpx双组分系统（two component system,TCS）的反应调控蛋白,通过调控靶基因的转录表达,在细菌细胞膜稳定及毒力方面发挥作用。本研究旨在探究TCS CpxR对禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC）基本生物学特性、抗血清杀菌能力及致病性的影响。利用Red同源重组系统及互补质粒构建cpxR基因缺失株、互补株,然后比较分析野生株、基因缺失株与互补株的生长曲线、运动性、生物被膜形成能力、药物敏感性、抗血清杀菌能力、动物致病性的差异。结果显示：cpxR基因缺失株与野生株、互补株的生长速度和运动性能无明显差异,且缺失cpxR基因不影响APEC的生物被膜形成能力。然而,缺失CpxR导致APEC对阿米卡星和卡那霉素耐药性降低。血清杀菌试验结果显示,CpxR有助于APEC的抗血清杀菌能力。动物感染试验结果显示,野生株、cpxR基因缺失株和互补株对雏鸭的半数致死量（LD₅₀）分别为7.50×10⁵、7.50×10⁶、1.33×10⁶ CFU,表明CpxR缺失显著降低APEC的毒力。综上表明,TCS CpxR在APEC耐药性、抗血清杀菌能力及毒力方面发挥作用,为阐明APEC的环境适应性、生存能力及致病机制提供参考。     

Identification and distribution of putative virulent genes in strains of Streptococcus suis serotype 2

In order to identify gene sequences unique to the virulent strains, suppression subtractive hybridization (SSH) was conducted using virulent Streptococcus suis type 2 (SS2) strain HA9801 and avirulent S. suis type 2 strain T15. Thirty genomic regions were absent in T15, and the DNA sequences of these regions in HA9801 were determined. These DNA fragments, containing putative virulence genes, encoded 28 proteins that were homologous to proteins involved in various aspects of cellular surface structure, molecular synthesis, energy metabolism, regulation, transport systems and others of unknown function. According to the published SS2 genomic sequence of the Chinese strain 98HAH33, PCR primers for 14 significant DNA fragments were designed and used for detection of the distribution of these fragments in S. suis strains from different sources, serotypes, regions, groups and times. The results showed that these 14 DNA fragments were widely distributed in 37 detected SS2 strains, yet were absent among the avirulent strain T15. Moreover, these fragments could be detected in other serotypes of S. suis, but each serotype had a different distribution of the fragments.