农杆菌介导的冷诱导基因水稻遗传转化体系的建立

利用农杆菌介导技术,以Bar基因为筛选标记,用高山离子芥的冷诱导基因Cbcor15a侵染水稻品种日本晴的愈伤组织,经分化诱导后获得了再生植株。经Cef和PPT筛选,共获得转化Cbcor15a基因的日本晴再生苗9株;经PCR检测和Basta涂抹实验,结果证明有6株再生苗呈阳性。本遗传转化体系的建立可为利用转Cbcor15a基因选育具有耐冷性的水稻新品种提供参考。     

农杆菌介导冷调节基因（Cbcor15a）遗传转化甘蔗体系的建立

【目的】利用农杆菌介导法,将外源冷调节基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织,建立快速、高效的甘蔗遗传转化体系,为培育具抗寒性甘蔗品种奠定基础。【方法】以新台糖22号（ROC22）为材料,通过对愈伤组织诱导、分化、生根等培养基进行优化,筛选出外源基因转化甘蔗的适合激素种类与用量、PPT用量、抗生素种类与用量;利用甘蔗转基因二元植物表达载体pCambia1300-Cbcor15a-bar,通过农杆菌介导法将目的基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织。【结果】当农杆菌菌液OD600为0.4、侵染20 min时有利于愈伤组织分化;甘蔗愈伤组织诱导和分化培养阶段的最佳PPT为0.50mg/L。侵染后在共培养中添加500.00 mg/L抗生素Cef能有效抑制农杆菌,添加300.00 mg/L抗生素Cef能促进愈伤组织分化成苗,添加200.00 mg/L抗生素Cef能促进幼苗生根。MS培养基中添加低量NAA更有利于甘蔗愈伤组织的分化;在促进细胞分裂时KT的效果明显优于6-BA。MS培养基中添加5.00 mg/LNAA和70.00g/L蔗糖能有效促进分化苗生根。利用建立的遗传转化体系可获得286株转冷调节基因Cbcor15a的甘蔗转化植株;选取83株通过PPT抗性筛选后长势良好的转化植株进行阳性检测,其中有4株呈阳性。【结论】利用农杆菌介导的Cbcor15a基因转化甘蔗的遗传转化体系能成功将Cbcor15a基因整合到甘蔗基因组。     

草甘膦为筛选标记的水稻高效遗传转化体系的建立

【目的】建立以日本晴愈伤组织为受体、草甘膦抗性基因CP4为选择标记基因的高效水稻遗传转化体系。【方法】以粳稻日本晴的成熟胚为试验材料,通过农杆菌介导法,将含有草甘膦抗性基因CP4的P1300载体转化日本晴的愈伤组织,分别用质量浓度为10、20和40 mg/L的草甘膦进行3轮抗性筛选,诱导分化和再生成苗;利用1 000 mg/L草甘膦对移栽成活的阳性苗进行抗性鉴定。【结果】获得145株转基因幼苗,PCR检测阳性株为128株,阳性率达88.27%;经过3轮抗性筛选后,转基因幼苗的阳性率提高;移栽成活的99株阳性苗中,65株表现为抗性,抗性率为65.66%。【结论】成功建立了以草甘膦为筛选标记的水稻转基因体系,该体系为水稻育种提供了材料,并对以抗草甘膦基因作为筛选标记的水稻转基因和一些基因功能验证提供了技术支持。     

用农杆菌共培养法将雄性不育基因导入水稻的研究

利用农杆菌共培养法将雄性不育基因（TA29-Barnase)导入水稻品种日本晴的胚性愈伤，通过50-150mg/L卡那霉素筛选，从500个胚性愈伤中获得16个筛选愈伤团，并分化出了3株绿苗，经PCR扩增分析。16个筛选愈伤团中有7个呈阳性；3株绿苗全部呈阳性。     

利用农杆菌介导法将PTA基因导入水稻的研究

利用根癌农杆菌将含多基因(hyg选择标记基因、PTA基因、GFP和GUS报告基因)的pCAMBIA1304载体导入水稻品种(501R、中花9号和日本晴)的幼胚愈伤组织，分别在含35、45和65mg／L潮霉素浓度的筛选培养基上筛选获得抗性愈伤。后经PCR检测，从415株T0代再生植株中选出92株(其中501R、中花9号和日本晴分别为4株、43株和45株)。对这些转基因后代植株进行Southern blotting分析表明：PTA基团已经整合进植物基团组中，潮霉素抗感实验结果表明大多数转基团植株能够将外源基因稳定遗传给后代并能表达。     

转叶绿体超氧化物歧化酶基因水稻的获得

[目的]研究转叶绿体超氧化物歧化酶（SOD）基因水稻的获得。[方法]在构建叶绿体超氧化物歧化酶基因转化载体的基础上,采用农杆菌侵染法,使用C418作为筛选剂,经筛选和分化获得转基因植株,并对其进行PCR检测。[结果]确定G418的最佳浓度为200mg／L,采用尽可能短的筛选时间获得了好的转化效果,最终获得237株再生苗;经PCR检测,65株呈阳性,转化率为27％。[结论]确定了G418的筛选效果,为其进一步应用提供科学依据。     

高山离子芥冷诱导基因转化甘蔗二元植物表达载体构建

[目的]利用载体重组技术分别将高山离子芥冷诱导基因(Cbcor15a)和报告基因eGF插入载体pCambia1300-bar,并引入玉米泛素基因启动子UBi-1代替载体本身启动子CaMV 35s,重组为适合甘蔗转基因的二元植物表达载体pCambia 1300-cbcor 15a-bar.[方法]参照pCambia1300-bar载体多克隆位点和基因Cbcor15a、eGFP和启动子UBi-1的核苷酸序列设计引物,通过载体重组技术将基因和启动子分别插入相应的位点.利用基因枪分别将pCambia1300-bar载体和重组载体导入洋葱表皮细胞,用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察.[结果]与导入pCambia 1300-bar载体的洋葱表皮细胞相比较,导入重组载体pCambia1300-cbcor15a-bar的洋葱表皮细胞内有强烈的绿色荧光信号.[结论]重组甘蔗转基因二元植物表达载体启动子Ubi-1能够调控下游冷诱导基因Cbcor15a和报告基因eGFP的正常高效表达,为外源基因Cbcor15a转化甘蔗提供保障.     

根癌农杆菌介导的水稻两用不育系培矮64S遗传转化体系的建立

以水稻两用不育系培矮64S成熟胚为外植体,以不同组合培养基为诱导和继代培养基,建立了适合水稻培矮64S转化的高效再生体系,并通过农杆菌EHA105介导,将大肠杆菌C1基因转入培矮64S,获得再生植株.结果表明.J0N1D3为合适的愈伤组织诱导培养基,诱导率达56.44%;通过潮霉素筛选后,获得的抗性愈伤组织分化率为73.08%,经分化,获得133株再生植株;随机挑选67株再生植株经PER检测,其中46株检测到目的条带,阳性检出率占68.66%;对PCR阳性植株进行荧光定量实时PCR分析,结果表明C1基因能在转基因植株中表达.通过对T1代PCR分析,得到目的条带,表明C1基因能在转基因后代稳定遗传.     

运用农杆菌介导法将PTA和反义Wx双基因导入水稻的研究

利用根癌农杆菌将含多基因(hyg选择标记基因、反义Wx基因、PTA基因、GFP和GUS报告基因)的pCAMBIA1304载体导入水稻品种(501R、中花9号和日本晴)的幼胚愈伤组织,分别在含35mg/L、45mg/L和65mg/L潮霉素浓度的筛选培养基上筛选获得抗性愈伤。后经PCR检测,从415株T0代再生植株中选出92株(其中501R、中花9号和日本晴分别为4株、43株和45株)。对这些转基因后代植株进行Southernblotting分析表明:hpt、反义Wx和PTA基因已经整合进植物基因组中,绝大多数转基因植株后代的表型正常。成熟种子直链淀粉含量分析表明,部分转基因植株的T1代种子中的直链淀粉含量有部分程度的下降,最低的已下降至6.3%,与对照相比下降了9.8%。     

基因枪介导大麦基因转化体系的建立

为了进一步提高基因枪转化效率，研究建立了以澳大利亚品种Franklin幼胚为受体的高效基因枪介导转化体系。结果表明，经愈伤组织诱导、筛选培养，从519块愈伤组织中获得16株再生苗，植株再生率高达3．0％。对长势良好的9株再生苗除草剂抗性检测和目的基因的PCR、PCR-Southern检测证实7株为转基因植株，并经过对外源基因(TrxS)表达活性检测表明，转基因大麦中Trxh的活性是CK的3．3倍，为基因枪高效转化提供了成功的证据。     

根癌农杆菌介导的水稻快速转化方法研究

为了适合于中花11的转化,笔者在愈伤组织预培养时间、浸染时间和凝固剂等方面改进了一种针对日本晴的水稻快速转化方法。将消毒后的中花11成熟种子在含有2.0mg/L 2,4-D的培养基中培养8d,不用继代愈伤组织,用含有GFP报告基因的根癌农杆菌直接浸染诱导的愈伤组织,经3d共培养和14d的筛选培养后,直接用新生的愈伤组织进行再分化,最终在40d内就获得了水稻转基因植株,转化效率和再生效率分别达到了71.3%和57%。从而证明了利用农杆菌直接浸染水稻早期愈伤的快速转化是切实可行的。     

根癌农杆菌介导水稻成熟胚及抗褐飞虱基因植株的获得

以水稻(Oryza sativa L.)籼型两系恢复系M5274和晚粳稻不育系N55S成熟胚为材料,以携带有双元载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105为载体进行抗飞虱基因Bph14、Bphi008A、Osg1的遗传转化,共获得515棵再生植株,包括198株Bph14转基因植株、72株Bphi008A转基因植株和245株Osg1转基因植株。PCR检测结果表明,获得的515株再生植株中,有244株阳性转基因植株,3个不同抗褐飞虱基因中,转Bph14基因的再生苗阳性率最高,增加筛选次数能有效减少转化所得的假阳性植株。     

花生上胚轴为外植体的植株再生及转化研究

以8 d龄花生无菌苗的上胚轴为外植体,进行植株再生和农杆菌介导遗传转化研究.结果表明,上胚轴能高效诱导花生植株再生,外植体在MS 3 mg/L TDZ 6 mg/L 6-BA 1.5 mg/L NAA培养基上能高效诱导不定芽分化,10 d时诱芽率达100%;不定芽接种到MS盐 B5维生素 3mg/L TDZ 0.01%酵母粉培养基中15 d诱导出大量丛生芽;MS 0.5 mg/L NAA培养基较适合诱导丛生芽生根,25 d时生根率达82%.筛选确定35 mg/L潮霉素浓度为转化筛选压,以含AtRD29Ap::GUS融合基因的根癌农杆菌侵染8 d龄上胚轴10 min,共培养3 d,经上述再生体系,以潮霉素筛选获得1株拟转化再生植株.     

农杆菌介导bar基因转化水稻胚性愈伤组织的研究

为建立以草丁膦为选择标记的农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的水稻Oryza sativa胚性愈伤组织转化体系,通过农杆菌介导法将bar基因导入了‘日本晴’Oryza sativa‘Nipponbare’‘秀水134’‘Xiushui 134’和‘中花11’‘Zhonghua 11’等3个水稻品种的胚性愈伤组织。在分别以选择压15.0,10.0和10.0 mg·L~(-1)的草丁膦质量浓度进行了3次选择后,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)发现‘日本晴’‘秀水134’和‘中花11’的愈伤组织转化效率分别是77.9%,67.5%和92.2%,获得的抗性愈伤组织可以进一步分化成苗。它们的分化率依次是76.1%,44.4%和86.7%;成苗率分别为65.6%,66.7%和30.7%。在以草丁膦作为筛选标记时,首选‘日本晴’作为转化受体进行遗传转化。该体系为以抗除草剂基因作为筛选标记的水稻遗传转化和基因功能验证提供了技术基础,获得的抗草丁膦转化植株为水稻育种提供了材料。     

mtlD/gutD双价耐盐基因转化秦美猕猴桃的研究

在已建立的秦美猕猴桃叶片最佳再生系统的基础上 ,利用叶盘法和基因枪相结合的方法进行了秦美猕猴桃双价耐盐基因 m tl D/gut D的转化研究 ,经诱导不定芽及诱导生根阶段卡那霉素 (选择性抗生素 )连续筛选 ,获得了 2 0株卡那霉素抗性转化植株。抗性植株经 PCR检测 ,有 6株呈阳性。耐盐试验表明 4株阳性植株抗 Na-Cl能力比对照均有不同程度提高。 PCR及耐盐试验初步证明耐盐基因转化获得成功。     

双价抗寒基因CBF3/COR15A转化大白菜的初步研究

为探索拟南芥的冷诱导转录因子CBF3和抗寒基因COR15A在"黔白"系列大白菜的转化体系,以"黔白"系列大白菜3个优良自交系作为研究对象,分别用大白菜4d苗龄的带柄子叶、半子叶、下胚轴作为外植体,利用农杆菌介导的方法将同时含有CBF3和COR15A双价抗寒基因的表达载体转入大白菜,就影响大白菜再生和遗传转化的因素进行研究。通过抗生素筛选得到大白菜T0代转基因抗性植株36株,经PCR检测后获得转基因阳性植株6株。经抗寒性初步鉴定,转基因大白菜植株抗寒性超过对照。     

84K杨树耐盐基因转化研究

在已建立了84K杨叶片外植体再生系统的基础上,利用叶盘法首次开展了84K杨双价耐盐基因mtlD/gutD的转化研究,经诱导不定芽及诱导生根阶段卡那霉素(选择性抗生素)连续筛选,获得了16株卡那霉素抗性转化植株.抗性植株经PCR检测,有4株呈阳性.耐盐实验表明,3株阳性植株抗NaCl能力比对照有不同程度提高.PCR及耐盐实验初步证明双价耐盐基因转化获得成功.     

金鱼草基因转化中卡那霉素筛选压力的确定

在以抗生素为筛选标记的基因转化中,确定适宜的筛选压力是提高基因转化率的前提。本研究以卡那霉素为筛选标记,在10、20、30、50和100mg／L的筛选压力下,根据金鱼草下胚轴外植体的生长表现、愈伤组织和芽的分化率确定适宜的筛选浓度。结果表明,适宜卡那霉素的筛选浓度为50mg／L。以此浓度为筛选压力进行遗传转化所获得的部分再生苗经Southernblot鉴定,均为转化株。     

转双价抗虫基因Bt-pta玉米植株的获得

以7922、8902、4112、340和853为受体材料,研究不同基因型的愈伤组织诱导与再生芽苗的关系,其中7922芽苗率为76.4%;8902、4112、340芽苗率分别为8.2%、12.7%和0%和11.8%,结果显示7922主要以体胚发生为主,芽苗率高,是遗传转化的良好受体材料。且胚性愈伤组织随着继代次数的增加变异率随之增加,应尽量减少继代次数以提高转化率。研究进一步利用PDS-100型基因枪将包含抗除草剂基因(bar)、苏云金杆菌毒蛋白基因(cryIA(a))和半夏凝集素基因(Pinelliaternataagglu-tinin,PTA)的聚合载体p3300-bt-pta导入7922的胚性愈伤组织,经PPT(3mg/L)筛选,获得抗性愈伤组织和再生植株。从获得的28株再生植株中筛选获得22株具有除草剂抗性的植株,PCR分析表明有7株同时含有Bt、PTA、Bar三个基因,共整合的频率为31.8%,结果表明将多价抗性基因同时导入玉米获得多抗的转基因玉米材料是可行的,这为通过转基因聚合育种培育创造同时抗鳞翅目害虫和同翅目害虫的玉米品种奠定了基础。     

云南水稻品种原生质体培养研究

采用KPR和R2培养基进行水稻原生质体培养，日本晴、楚粳8号、云粳9号、大白谷和元江普通野生稻先后获得了原生质体培养的成功，除日本晴外，其余品种均为首次报道，品种间绿苗再生率有显著差异。日本晴最高，大白谷最低，同一品种不同的俞伤组织间，分化率有很大差异。有的愈伤组织极易分化出绿苗，有的不能再生出绿苗，说明分化前的预培养非常重要。N6分化培养基的再生绿苗率极显著地高于MS。配方为N6 葡萄糖20g/L 蔗糖30g/L IAA0.2mg/L 6-BA0.5mg/L Agarose-110g?L的培养基。分化率最高，按初次接种的愈伤组织块计，每块平均再生绿苗1.4苗,酶解原生质体量的多少,与愈伤组织在N6 1mg/L2,4-D的液体培养基中悬浮培养时间的长短有关,悬浮时间较长则易于获得较多的原生质体.日本晴的再生植株中,有两株多移栽到抽穗仅45d,有可能是极早良的变异株,有些植株的粒型和稃毛也有明显变异对鉴定和利用变异的植株具有现实意义.