油棕EgNAC33基因的克隆与逆境响应表达分析

应用RT-PCR及RACE技术,克隆了油棕抗逆相关基因EgNAC33的全长cDNA;应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行了分析,同时采用qRT-PCR分析了低温、干旱及高盐胁迫处理后EgNAC33的响应表达情况。结果表明:克隆获得的基因EgNAC33的cDNA全长为1952 bp,含1个长约735 bp的开放阅读框,编码245个氨基酸,该基因编码的蛋白与椰子NAC蛋白的同源性最高;EgNAC33基因受低温及高盐胁迫的诱导,其中,在8℃条件下胁迫8 h时的表达量最高,在高盐条件下胁迫24 h时的表达量最高;但在干旱胁迫下,EgNAC33的表达量基本上不受影响。     

大豆GmFtsH2基因的克隆及表达分析

为了进一步了解FtsH基因在大豆中的表达特性和功能,通过GenBank中拟南芥等其他植物FtsH基因序列设计1对简并引物,从盐处理的大豆叶片中克隆GmFtsH2的全长cDNA序列,并利用在线生物信息学软件对其进行分析.采用实时荧光定量PCR方法分析GmFtsH2在低温、盐、干旱和高温处理下的表达情况.从大豆中克隆到一条...     

大豆阴蔽响应基因GmIF-3的克隆与表达分析

【目的】对大豆阴蔽响应基因GmIF-3进行克隆与表达分析。【方法】前期采用蛋白磷酸化组学分析了大豆全蛋白组在白光及阴蔽胁迫下的磷酸化水平,筛选到1个受阴蔽诱导磷酸化水平显著升高的IF-3 (translation initiation factor)蛋白,将其基因命名为GmIF-3 (Glyma.17G072300)。利用生物信息学分析其启动子序列、蛋白结构、蛋白疏水性等生化特性;采用Gateway^?克隆方法克隆该基因的cDNA序列;采用实时荧光定量PCR检测该基因的组织表达模式及阴蔽处理下的表达情况。【结果】生物信息学分析表明:GmIF-3位于大豆第17号染色体上,可编码274个氨基酸残基的蛋白质,其蛋白等电点为9.11,分子量为30.83 ku,启动子含有多个与光信号响应和激素响应的顺式作用元件。实时荧光定量PCR显示:GmIF-3基因在真叶中的相对表达量最高,在三出复叶、茎尖分生组织、根、茎、叶柄、子叶、花和荚等多种器官中也均有表达。对大豆幼苗阴蔽处理0、1、2、4和6 h后,GmIF-3的表达量显著升高,阴蔽6 h的相对表达量最高,约为对照(阴蔽0 h)的...     

水稻黄嘌呤脱氢酶基因OsXDH克隆及表达分析

[目的]克隆水稻黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase,XDH)基因(OsXDH),分析其生物信息学特性及表达特性,为研究XDH在水稻生长发育和响应逆境胁迫中的调控机制提供理论依据.[方法]以粳稻品种日本晴为材料,采用同源克隆技术克隆OsXDH基因,应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行分析.利用实时荧光定量PCR (qPCR)检测OsXDH基因的组织表达特性及逆境胁迫下的表达情况,并对不同转基因株系乳熟期剑叶OsXDH基因表达量、XDH活性和叶绿素含量进行比较分析.[结果]克隆获得OsXDH基因的开放阅读框序列(ORF)(GenBank登录号LOC4333171),其长度为4110 bp,编码1369个氨基酸.OsXDH蛋白分子量大小为150.23 kD,理论等电点(pI)为6.54,与小麦、高粱、玉米、谷子和油菜等作物XDH蛋白氨基酸序列的相似性分别为84.54%、84.07%、81.52%、76.35%和69.22%,表明XDH蛋白氨基酸序列具有高度保守性.OsXDH基因在水稻不同组织部位均有表达,灌浆期的表达量显著高于苗期和分蘖盛期(P<0.05),且受干旱、黑暗、高温和盐胁迫诱导高效表达.OsXDH过表达水稻转基因株系乳熟期剑叶的XDH活性和叶绿素含量高于野生型,OsXDH干扰转基因株系的XDH活性和叶绿素含量低于野生型.[结论]OsXDH基因受水稻生长发育和逆境胁迫因子诱导表达,推测其是调控水稻生长发育和响应逆境胁迫的关键基因.     

水稻逆境响应基因OsMsr11的克隆与分析

为了挖掘新的耐逆基因,本文在应用Affymetrix水稻表达芯片分析超级稻亲本培矮64S在不同逆境(高温、干旱、低温)胁迫下、不同发育时期叶片和穗中全基因组表达模式的基础上,对其中一个多逆境响应基因OsMsr11(Oryza sativa L.multiple stressresponsive gene 11)进行了克隆与分析。OsMsr11是一个受低温、干旱、高温多逆境诱导的基因,在孕穗期低温胁迫下表达水平显著上调。通过PCR扩增获得了包含其完整开放阅读框的cDNA序列。序列分析表明,其ORF为234 bp,编码77个氨基酸,有信号肽序列,无典型的保守基因结构域,预测其为分泌通路信号肽,分泌到细胞周质中,功能未知;OsMsr11基因不含内含子,对其启动子区域进行分析,发现含有多种与逆境响应相关的顺式作用元件。为研究其功能,采用农杆菌侵染法转化超级稻父本9311,初步分析表明:在水稻中过量表达OsMsr11,增强了转基因水稻的耐盐性,降低了对外源ABA的敏感性。     

甘薯全基因组WRKY转录因子的基因鉴定与逆境胁迫表达分析

【目的】对甘薯(Ipomoea batatas)全基因组WRKY转录因子进行基因鉴定与逆境胁迫表达分析,为甘薯WRKY基因的应用提供参考。【方法】在甘薯全基因组序列的基础上,应用生物信息学方法对WRKY基因进行挖掘,分析基因潜在复制关系、保守结构域、亚家族系统进化树、保守基序和抗逆表达模式,并对甘薯SPF1基因与IbWRKY基因进行了比较和分析。【结果】甘薯全基因组上共有82个WRKY基因,可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3个类型,其中类型Ⅰ和类型Ⅲ的成员数量分别为18和5,类型Ⅱ可进一步分为Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d和Ⅱ-e 5个亚类,其成员数量分别为4,14,20,8和13。甘薯WRKY基因不均匀分布于15条染色体上,其中25对基因存在潜在复制关系。保守结构域分析发现,大部分WRKY的结构域高度保守,但个别基因存在保守结构域缺失现象。拟南芥与甘薯的WRKY转录因子在系统进化树上呈现按物种少量聚集的现象。在甘薯WRKY转录因子家族中共发现10个保守基序,包括含有WRKY七肽结构域的基序1和基序7、含有锌指结构域的基序2和基序3,其中基序3为Ⅰ类型WRKY转录因子N端WRKY结构域所特有。对逆境胁迫下的甘薯转录组数据进行分析发现,甘薯苗期在蔓割病菌(Fusarium oxysporum f. sp.batatas)侵染后共有19个WRKY基因差异表达,甘薯块根贮藏期在低温胁迫下有34个WRKY基因差异表达。蛋白序列比较和分析结果表明,甘薯SPF1的氨基酸序列与IbWRKY32的氨基酸序列一致度最高,为85.4%。【结论】甘薯全基因组中鉴定得到82个WRKY基因,其结构域较为保守,在蔓割病胁迫与低温胁迫条件下均存在差异表达。     

玉米S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)逆境胁迫下的表达分析

玉米是对干旱、低温、高温等逆境较为敏感的重要禾谷类作物,发掘玉米逆境相关基因及对逆境信号途径研究具有重要学术意义与应用价值。S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosyl-L-metnionine synthetase,SAMS)是植物代谢中一个关键酶,催化合成腺苷甲硫氨酸(SAM)。试验在前期克隆玉米SAMS基因基础上,顺式元件分析发现SAMS启动子区域存在ABA(ABRE)、干旱(MBS)、逆境应答(TC-rich repeats)等顺式作用元件;荧光实时定量PCR表达分析发现干旱、高盐、ABA处理下基因表达量上调,在低温、高温处理下基因表达量变化不大。结果表明:玉米S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因响应植物逆境应答,为SAMS基因参与植物逆境信号通路及其功能研究提供理论依据。     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

茶树谷胱甘肽还原酶基因CsGRs的克隆与表达分析

【目的】克隆谷胱甘肽还原酶基因CsGRs,研究CsGRs在茶树抵御不同逆境胁迫中的作用。【方法】在茶树转录组数据库中搜索茶树CsGRs,根据获得的基因片段,设计反转录PCR（RT-PCR）引物和RACE-PCR特异引物,从茶树中克隆CsGRs的cDNA全长序列,并利用在线生物信息学软件对其进行分析。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析CsGRs在茶树不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高盐胁迫和ABA处理下的表达模式,利用分光光度计测定低温胁迫和干旱胁迫下叶片中还原型谷胱甘肽（GSH）的含量变化。【结果】RT-PCR克隆获得CsGR1的cDNA全长,其长度为1 827 bp,包含1 482 bp开放阅读框（ORF）,编码493个氨基酸;RACE扩增获得712 bp和1 624 bp的5′和3′末端序列,拼接并进行RT-PCR验证后得到CsGR2序列,全长2 282 bp,包含1 698 bp ORF,编码565个氨基酸;CsGR1和CsGR2的GenBank登录号分别为KF906411和KF418080。CsGR1和CsGR2编码的蛋白质分子量分别为53.9 kD和61.0 kD,无信号肽位点,均为非分泌性蛋白。亚细胞定位预测CsGR1主要定位在细胞质等亚细胞中,无叶绿体锚定信号肽位点;CsGR2中N-端的71个氨基酸残基具有叶绿体转运信号功能,主要定位在叶绿体上。序列相似性比较显示,CsGR1与其他植物中胞质GR的相似性均在80％以上,而与叶绿体GR的相似性低于60％;CsGR2与其他叶绿体GR的相似性70％以上,与胞质GR的相似性在50％左右。二者在核酸序列和氨基酸序列水平上分别有63.4％和49.9％的相似性,且蛋白质二级结构也具有较高的相似性。系统发育树显示,CsGR1与胞质GR聚为一类,而CsGR2与叶绿体GR聚在一起,且都与葡萄的亲缘关系最近。二者均含有氧化还原二硫键活性位点、谷胱甘肽结合位点以及NADPH结合的Arg保守位点等结构域。CsGR1为胞质GR,CsGR2为双向定位在叶绿体和线粒体上的叶绿体GR。CsGR1在花和根中表达量较高,在叶片和茎中表达量低;CsGR2在叶片和茎中的表达量比在根和花中的表达量高。在短时胁迫处理24 h过程中,成熟叶片在100 μmol•L-1 ABA处理后,CsGR1和CsGR2的表达均被抑制,且CsGR2的抑制作用较显著;在4℃低温胁迫下,CsGR1的表达被抑制,而CsGR2的表达随处理时间延长逐渐被诱导;250 mmol•L-1 NaCl盐胁迫抑制CsGRs的表达,但胁迫24 h时CsGR2的表达被诱导。10%（w/v）PEG胁迫处理茶树8 h,叶片中的CsGRs均被诱导表达,且在复水48 h后CsGR1的表达被显著上调;根中CsGRs的表达在处理和复水48 h过程中均被抑制。随低温胁迫时间延长,茶树叶片中的GSH含量逐渐升高;干旱胁迫也能促进GSH在叶片中的积累,在复水48 h后又恢复到处理前的水平。【结论】克隆了2个茶树CsGRs,2个基因对4℃低温、NaCl盐、10％PEG和ABA处理均具有响应。推测CsGRs在茶树抵御逆境胁迫中起作用。     

巨桉EgrCBF3基因的克隆与逆境响应表达分析

【目的】克隆巨桉(Eucalyptus grandis)抗逆相关基因EgrCBF3(GenBank登录号:JQ068829)的全长cDNA序列,分析EgrCBF3在低温、干旱、脱落酸(ABA)处理和高盐条件下的表达。【方法】利用RT-PCR结合RACE技术,克隆巨桉抗逆相关基因EgrCBF3全长cDNA序列;分析正常条件下,巨桉根、茎和叶中EgrCBF3的表达情况;同时采用qRT-PCR,分析不同低温(0,2,4,6,8℃)和4℃处理不同时间(2,4,8,24和48h),以及干旱、ABA和高盐等逆境条件下EgrCBF3的响应表达情况。【结果】EgrCBF3cDNA全长1 161bp,含有1个675bp的ORF,编码224个氨基酸,包含1个AP2结构域。该基因编码的蛋白与蓝桉中的CBF蛋白同源性最高,达97%。EgrCBF3在巨桉的叶、茎和根中均有表达,但表达量无明显差异。对不同低温和4℃不同处理时间条件下EgrCBF3表达的qRT-PCR分析表明,EgrCBF3基因受低温诱导,在2℃条件下诱导表达量最强;在4℃条件下随低温时间的延长,其诱导表达特性不变,仅略有波动。在100μmol/L ABA、200mmol/L NaCl和干旱处理条件下,EgrCBF3的表达不受ABA和盐胁迫的影响,但在干旱胁迫下被诱导。【结论】EgrCBF3响应低温胁迫诱导,同时可能也参与了干旱胁迫的逆境响应机制。     

水稻OsRZFP34基因逆境表达特征及其启动子的克隆与分析

采用qRT–PCR技术分析水稻OsRZFP34在高温(42 ℃)、低温(4 ℃)、10%聚乙二醇(PEG)6000模拟干旱、高盐(100 mmol/L NaCl)和脱落酸(ABA)处理(100 μmol/L)下的表达模式;克隆OsRZFP34基因启动子,并利用在线软件New PLACE和PlantCARE对其序列进行顺式作用元件分析;构建OsRZFP34pro::GUS表达载体并转化水稻;通过组织化学染色和GUS酶活性检测,分析在不同胁迫处理条件下OsRZFP34启动子驱动GUS基因表达的活性。qRT–PCR分析结果表明,上述5种处理均能不同程度地诱导OsRZFP34的表达,其中高温胁迫对其表达的诱导程度最强,而ABA对其表达只有微弱的诱导。顺式作用元件分析结果表明,该启动子上包含有多个与逆境响应、激素响应以及Ca2+信号转导相关元件。GUS组织化学染色和荧光分析结果显示,OsRZFP34基因启动子的活性受到高温、低温、PEG、盐和ABA的调控,表明该启动子是受多种逆境诱导的诱导型启动子。     

葡萄MAPK基因家族鉴定及逆境胁迫下的表达分析

探究葡萄MAPK家族成员的特性及潜在功能,为葡萄抗逆基因资源的挖掘和利用提供理论依据。本研究克隆获得葡萄MAPK基因家族成员并对其进行生物信息学分析,根据基因芯片数据分析各成员的组织表达特征,结合qRT-PCR明确其对非生物胁迫的响应情况。结果表明,葡萄中共获得43个MAPK成员,分别命名为 VvMAPK1~ VvMAPK43,分布于15条染色体上,其中有6个成员集中分布于18号染色体上,5个分布于5号染色体上。氨基酸大小为114~1 520 aa, VvMAPK15编码的氨基酸序列最长,为1 520个氨基酸残基, VvMAPK23编码的氨基酸序列最短,为114个。相对分子量集中为12.26~16.70 ku,等电点为4.94~10.01。芯片数据分析发现,经ABA处理后, VvMAPK5、 VvMAPK7和 VvAMAPK13的表达量明显下调,在盐、PEG和低温处理下, VvMAPK6、 VvMAPK9和 VvMAPK13的表达量明显上调;不同成员在不同组织以及同一组织的不同生长阶段表达水平差异显著。qRT-PCR分析发现,大多数VvMAPK家族成员受到200 mmol·L^-1 NaCl的诱导,表达水平较对照上调显著, VvMAPK9、 VvMAPK27、 VvMAPK29和 VvMAPK38在500 μmol·L^-1 ABA、200 mmol·L^-1 NaCl和10% PEG处理后均上调表达显著,对3种非生物胁迫的响应强烈。研究结果表明,葡萄MAPK家族成员在不同非生物胁迫下存在不同的潜在功能,为葡萄基因改良和遗传育种提供理论基础。     

甘薯Iborf56基因的克隆与表达分析

为了研究甘薯叶绿体基因Iborf56的表达是否受到盐胁迫的诱导以及对生长发育的影响,为甘薯的品种选育提供参考,以栗子香为研究材料,从中克隆Iborf56基因,通过生物信息学方法分析其蛋白序列特征,亚细胞定位预测、系统发育分析、调控元件分析、不同组织及盐胁迫表达模式,以及qPCR验证该基因的表达量。结果表明,Iborf56与已知序列相似度为99.28%,开放阅读框长度为929 bp,编码60个氨基酸,含有8个磷酸化位点,没有信号肽和跨膜区,不具有分泌蛋白的特性,主要由α-螺旋组成;亚细胞定位在叶绿体基质中;进化树分析表明,Iborf56与三浅裂野牵牛（Ipomoea trifida）和三裂叶薯（Ipomoea triloba)的遗传距离最近;启动子元件分析发现,该基因启动子区域含有光响应元件、抗逆和激素应答等功能元件。转录组以及实时荧光qRT-PCR定量分析表明,Iborf56在甘薯叶片中的表达量最高且随生长时间增加呈显著上升趋势,推测该基因参与甘薯的生长发育;此外,Iborf56基因的表达量随盐胁迫时间表现为先升后降的趋势,且该基因在盐胁迫下12 h时达到了临界值,暗示其可能参与甘薯盐...     

与逆境胁迫相关的rd29A启动子和CBF2基因的克隆及其表达载体构建

以拟南芥为材料,通过PCR扩增成功地克隆了逆境诱导型启动子rd29A和CBF2转录因子.序列分析表明,951 bp的rd29A序列包含完整的DRE、ABRE等4种保守顺式作用元件;651 bp的CBF2基因包含了完整的AP2 DNA结合域以及特异的氨基酸序列PKKPAGRKKFRETRHP和FADSAWR.同时,构建了由rd29A启动子调控的CBF2基因的植物表达载体.     

油柰PsWRKY33基因启动子的克隆与表达分析

[目的]探讨油柰(Prunus salicina lindley)WRKY33启动子在不同胁迫处理下的表达模式,为进一步深入研究油柰WRKY基因在油柰生长发育或抵御各种逆境胁迫中的作用机制等提供理论依据.[方法]利用MEGA 6.06软件构建PsWRKY33的系统进化树.通过染色体步移技术克隆获得该基因启动子序列,利用...     

玉米逆境响应转录因子ZmGBF1的克隆及表达分析

从玉米中克隆了ZmGBF1基因,该基因长1 134 bp,编码377个氨基酸。进化树分析表明,玉米ZmGBF1与小麦TaGBF1、TuGBF3和高粱SbCPRF1亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,ZmGBF1在玉米胚芽鞘中表达量最高,叶片次之,根中表达量最低;ZmGBF1基因表达受到盐、干旱、高温、低温、脱落酸和水杨酸诱导,且在干旱和高温条件下ZmGBF1的表达量与对照相比呈显著差异,暗示ZmGBF1可能参与玉米对干旱和高温的响应过程。     

水稻多逆境响应基因OsMsr13的克隆与功能分析

为了深入研究作物耐逆境胁迫的分子机制和发现新的水稻耐逆基因,采用Affymetrix基因芯片技术与水稻表达芯片(含51,279个转录本),分析了培矮64S不同生长发育时期、不同组织器官全基因组在低温、干旱、高温逆境胁迫下的表达水平变化,筛选出一批耐多逆境候选功能基因.OsMsr13是其中一个受低温、高温与干旱诱导,在各生长发育时期与组织器官均显著上调的基因.根据序列生物信息学分析,OsMsr13含有7个外显子和6个内含子,cDNA全长序列为1603bp,完整的ORF为1317bp,编码一个含438个氨基酸残基的蛋白质;在OsMsr13启动子区域发现多个与逆境应答相关的顺武作用元件;数据库查找和蛋白质多序列的比对表明Os Msr13的预测蛋白属于钙调素结合蛋白家族.为了进一步研究OsMsr13基因的功能,通过RT-PCR方法扩增到包含OsMsr13完整ORF的cDNA克隆,构建了含有OsMsr13重组基因的过量表达载体pCAM-JIT-OsMsr13,并经农杆菌介导法将重组基因导入到水稻中.转OsMsr13株系苗期的抗逆性试验表明OsMsr13过量表达能显著地提高水稻的耐寒性,但在抗旱和耐高温方面,转基因植株和野生型9311没有观察到多大差别.     

小麦TaLTR基因的克隆及初步表达分析

以小麦山融3号为试验材料,克隆了TaLTR cDNA序列(Low temperature-responsive RNA-bind-ing protein)。序列分析表明,TaLTR序列包含完整的ORF区,编码蛋白含有162个氨基酸,其氨基端包含一个RRM(RNA recognition domain)超家族保守的结构域,羧基端则富含甘氨酸;经半定量RT-PCR分析,表明TaLTR参与低温、干旱、盐胁迫逆境反应。     

甘薯盐胁迫响应基因IbNAC14的克隆、生物信息学及表达模式分析

【目的】探究IbNAC14基因在甘薯胁迫响应过程中的可能功能。【方法】以耐盐性甘薯品种徐薯22与盐敏感性甘薯品种徐薯32为研究材料,从盐胁迫处理后得到的转录组数据中筛选新的NAC基因,命名为IbNAC14。随后对IbNAC14基因进行系统的生物信息学分析,并应用qRT-PCR方法检测其表达模式。【结果】生物信息学分析显示,IbNAC14基因(GenBank登录号:MH660528)包含一个771 bp的开放阅读框,编码着一个具有典型NAC结构域的蛋白,且该蛋白含有多个磷酸化位点。qRT-PCR分析表明,IbNAC14基因的转录水平受盐和干旱胁迫,以及ABA和ACC处理的诱导,暗示其可能在甘薯胁迫过程中发挥重要功能。【结论】IbNAC14基因可能是参与甘薯胁迫响应的重要候选基因。