集胞藻PCC6803蛋白组学研究进展

自集胞藻PCC6803蛋白组学研究工作开展以来,已取得一系列研究成果。这些研究成果主要分为2类：①鉴定了全细胞或亚细胞结构内表达的蛋白质;②发现了许多环境胁迫条件引起的蛋白质差异表达,为理解细胞胁迫反应和蛋白的功能提供了线索。从这2个方面分别对集胞藻PCC6803蛋白组学的研究成果进行简要综述。     

集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 slr1501的克隆及原核表达分析

组蛋白乙酰基转移酶上调表达与抗逆性有一定相关性。集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 Slr1501是一个未知蛋白,预测其属于组蛋白乙酰基转移酶GNAT家族N-乙酰基转移酶。为了进一步明确slr1501基因功能,本研究从集胞藻6803中克隆slr1501基因,成功构建了pET-28a(+)-slr1501原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行分析。经1 mmol/L IPTG诱导2 h后Slr1501蛋白成功表达,表达量随诱导时间的延长而增加,且主要以包涵体形式表达。Western blot检测结果显示Slr1501重组蛋白特异性表达。本试验结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

用同源重组法将Δ5 Des整合在集胞藻6803中的表达

从枯草芽孢杆菌染色体中扩增出受冷诱导的Δ5Des去饱和酶,构建出可以与集胞藻PCC6803染色体发生同源双交换的质粒,将Km抗性基因::PpsbA1::Δ5脂肪酸去饱和酶基因和对照基因分别整合入PCC6803的染色体上,获得转化子后,对不饱和脂肪酸进行研究。结果发现,30℃条件下脂肪酸成分的含量发生了较大变化,20℃时有新成分的出现,且长链脂肪酸的含量有所上升。     

鱼腥藻PCC7120ntcA基因研究进展

自1990年鱼腥藻PCC 7120中ntcA基因编码的蛋白被发现和鉴定以来,对其研究已取得一系列重要进展,其研究成果主要集中于ntcA基因及其编码蛋白的结构、功能及作用机制等方面,为更全面的了解鱼腥藻PCC 7120中的氮代谢和异形胞分化提供了线索。该研究分别从ntcA基因结构、其编码蛋白的功能、作用机制及作用范围等4个方面对鱼腥藻PCC 7120 ntcA基因的研究进展进行了简要综述。     

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因过量表达对集胞藻PCC6803脂肪酸合成的影响

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（phosphopantetheinyl transferases,PPTase）是细菌脂肪酸合成中的关键酶。本研究利用同源重组手段构建集胞藻PPTase基因（slr0495）过量表达重组质粒,在集胞藻PCC6803中进行表达研究,并在DNA和RNA水平进行验证,利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测不同条件下突变藻株脂肪酸组分及含量。结果表明：在温度为30 ℃、光照强度为50 μmol ·m^-2 · s^-1培养条件下,过量表达slr0495基因突变藻株中C12:0、C16:0和C18:0的含量分别为1. 31 mg · g^-1、8.07 mg · g^-1和1.35 mg · g^-1,比野生型藻株分别提高了23.58%、25.31%和13.45%;在温度为20 ℃、50% NaNO₃浓度、光照强度为50 μmol · m^-2 · s^-1培养条件下,与野生型相比,突变藻株中C16:0和C18:0含量分别提高了44.71%和41.51%。以上结果表明,过表达slr0495基因增加了集胞藻PCC6803中长链饱和脂肪酸的含量,并且在低温（20 ℃）和缺氮（50% NaNO₃）双重胁迫培养条件下中长链饱和脂肪酸含量得到进一步提高。本研究为探究slr0495基因功能以及在逆境中基因产生的应激反应提供了理论依据,为微藻高产多不饱和脂肪酸代谢研究奠定了基础。     

集胞藻6803藻胆体藻蓝蛋白多克隆抗体制备及其初步应用

通过PCR扩增出集胞藻6803 C-PC编码基因cpcA,构建表达质粒pET32a(+)-cpcA,转化大肠菌株BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导表达、经His-tag纯化后免疫日本大耳白兔获得多克隆抗体。间接ELISA法揭示该抗体效价可高达1∶1 025 000;蛋白免疫印迹确定该抗体具有高度特异性。应用该抗体进行蛋白免疫印迹检测,结果发现C-PC蛋白在生长光与高光培养条件下的数量,以及与2个光系统间的连结数量均存在显著差异,为进一步研究藻胆体的杆在响应与适应机制中所承担的重要角色奠定了生化基础。     

集胞蓝细菌PCC 6803中CcmK2蛋白多克隆抗体的制备与检测

CcmK2蛋白是集胞蓝细菌PCC 6803羧酶体外壳蛋白的主要组分,在羧酶体的组装与功能行使方面扮演重要角色。为解析其功能,本研究构建了原核表达载体pET28a-CcmK2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有6个组氨酸标签的CcmK2重组蛋白。通过金属亲和层析技术,将CcmK2重组蛋白纯化后免疫家兔,制备抗CcmK2多克隆抗体。基于Dot blot分析的结果显示:该多克隆抗体能够有效检测蓝细菌CcmK2蛋白;进一步的抗体特异性分析显示,CcmK2多克隆抗体与其他羧酶体外壳蛋白存在微弱的抗原抗体反应;最后,通过Western blot分析证实该多克隆抗体能够特异而灵敏地检测集胞蓝细菌PCC 6803中CcmK2的丰度。     

利用同源重组构建蓝藻集胞藻6803ndhM基因突变株及其分子鉴定

蓝藻NADPH脱氢酶(NDH-1)是一种重要的光合膜蛋白复合体,参与CO2吸收、围绕光系统I的循环电子传递和细胞呼吸。迄今为止,人们已在蓝藻细胞中鉴定出15种NDH-1复合体亚基(NdhA-NdhO)。然而,人们对NdhM亚基的研究尚不够,至今未见有反向遗传学等方面的研究。在通过构建同源重组载体、自然转化和多次继代筛选后,对转化子进行了PCR和蛋白免疫印迹鉴定。研究结果表明,壮观霉素基因已成功地插入到ndhM基因的保守区域,并完全破坏了ndhM基因的蛋白表达,从而获得了ndhM基因缺失的突变株,为进一步研究NdhM亚基对NDH-1复合体的稳定性和生理功能等奠定了试验基础。     

氯霉素对集胞蓝细菌PCC 6803细胞中羧酶体数目及其相关蛋白丰度的影响

羧酶体是由致密的外壳蛋白包裹着核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶和碳酸苷酶形成的细胞内蛋白质小体,是蓝细菌二氧化碳固定的场所。为解析羧酶体在不同培养条件下的功能,本研究构建了原核表达载体pET28a-CcmK2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有组氨酸标签的CcmK2重组蛋白,制备了其多克隆抗体,探讨了不同质量浓度氯霉素对细胞内羧酶体数目和羧酶体相关蛋白丰度的影响。首先,确定了不同质量浓度的氯霉素对集胞蓝细菌PCC 6803生长的影响,发现5.0μg/mL氯霉素能够完全抑制菌株的生长,但是可以维持菌株存活。随后,探讨了集胞蓝细菌在葡萄糖异养和光合自养转换过程中,氯霉素对细胞内羧酶体数目及羧酶体相关蛋白的影响。结果显示:氯霉素的加入抑制了细胞内羧酶体数目对环境碳源的响应;同时,Western blot检测发现5.0μg/mL氯霉素能够抑制细胞内新的羧酶体外壳蛋白CcmK2的合成。这些结果表明,氯霉素可能通过抑制羧酶体外壳蛋白的合成来干扰细胞内羧酶体的形成,细胞内羧酶体对环境碳源的响应存在复杂的调控机制。     

铜对集胞藻PCC6803生长的影响

从藻液浓度、叶绿素含量、可溶性糖含量以及蛋白质含量等方面,探讨了不同浓度Cu2+处理对集胞藻自养、混养生长的影响.结果表明,Cu2+对集胞藻生长过程及体内主要化学物质的影响显著.高于0.20mg/L时,随着Cu2+浓度的增加,藻液浓度、叶绿素含量均显著下降.可溶性糖在自养、混养下,都呈先升后降趋势,但最大值出现在不同的浓度下.蛋白质含量在自养、混养下结果不同,自养条件下,Cu2+浓度从0.05～0.20 mg/L,蛋白质含量相对于对照都有所增加,0.20 mg/L时达最大值,但0.30 mg/L时显著下降;混养条件下,Cu2+浓度在0.02～0.10 mg/L对蛋白质含量无显著影响,但0.20 mg/L时的蛋白质含量仅为对照的50%.在自养条件下集胞藻时Cu2+的耐受性高于混养条件.     

集胞藻酰基载体蛋白基因过量表达对脂肪酸合成的影响

酰基载体蛋白(ACP)是微生物脂肪酸生物合成途径中的一个关键蛋白。为了促进集胞藻脂肪酸的积累,以集胞藻PCC6803为研究对象,成功构建了用于过量表达ACP(ssl2084)基因的同源重组质粒ssl2084⁽(+))并在集胞藻PCC6803中进行转化。将ssl2084⁽(+))突变株进行DNA水平和蛋白质水平鉴定,结果表明,ssl2084基因已经得到过量表达。利用气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)对突变藻株在不同温度下脂肪酸的含量及组分进行检测,发现在30℃培养条件下ssl2084⁽(+))突变株中C12:0、C16:0和C18:0的含量显著增加,分别为1.50、8.74和0.60 mg·g^-1,与野生型相比分别增加了54.71%、50.82%和155.86%;在20℃低温胁迫培养条件下,C12:0、C16:0和C18:0的含量分别达到1.70、11.85和2.31 mg·g^-1,与野生型相比分别增加了31.94%、47.35%和39.90%。以上结果表明,在集胞藻PCC68...     

集胞藻PCC6803染色体上抗毒素-毒素基因ssl2749-sll1411的转录调控

细菌染色体上的mnt/hepn操纵子构成毒素-抗毒素系统(TA,toxin-antitoxin system)新家族,但该家族成员的生化及遗传特征有待阐明.为了证明集胞藻PCC6803染色体上基因ssl2749/sll1411的转录调控作用,以无启动子的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)为报告基因,构建了lacZ转录融合重组质粒,通过测定含重组质粒的大肠杆菌细胞的β-半乳糖苷酶活性,确定ssl2749 /sll1411编码产物对其启动子活性的调控作用.结果表明,蛋白Ssl2749使β-半乳糖苷酶活性显著增加,提示Ssl2749可激活PTA启动子转录活性,蛋白Sll1411抑制Ssl2749的转录激活作用.因此,Ssl2749可能与PTA中的调控序列结合调控ssl2749/sll1411操纵子的转录,Sll1411对Ssl2749转录激活活性的抑制作用提示二者之间存在相互作用.     

光生物反应器中集胞藻6803的光衰减及其生长动力学研究

[目的]分析集胞藻6803细胞培养体系的光衰减及分批培养条件下藻细胞的生长特性。[方法]以集胞藻6803（Synechocystis sp.PCC6803）为供试藻种,用尤尼柯7200型分光光度计测定藻细胞浓度和用ST-85自动量程照度计测定光强在通过不同光程、不同浓度藻液时的变化。[结果]随着藻细胞浓度和光程的增加,光强迅速下降。在同一光程下,光强随着藻细胞浓度的增加而下降。在培养初期藻细胞浓度较低时,光衰减程度较小;在培养后期,随着藻细胞浓度的增加,光衰减程度逐渐增加。在培养过程中藻体细胞的生长规律与微生物发酵过程中菌体的生长规律相似。藻体细胞生物量曲线与微生物发酵时的菌体生长曲线相似。[结论]Lambert-Beer公式Ln（I/I0）=-KaXL能较好描述藻细胞浓度和光程对光衰减的综合影响;Logistic方程能很好描述藻细胞的生长曲线。     

猪α-干扰素的原核表达

重组质粒pMDIFN-α中的猪α-干扰素基因经双酶切,亚克隆到原核表达载体pET-．28a,构建了重组表达质粒pETIFN-α,经过SDS-PAGE蛋白质电泳,测得表达蛋白的相对分子质量约为26500．表达蛋白的Western-blotting分析显示：改进后的半干胶转印免疫印迹法灵敏度高、特异性强、重复性好;获得的重组融合蛋白具有良好的反应原性．     

产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆及其表达

用PCR方法扩增产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因（ALDC）,得到0.78 kb的DNA片段,扩增片段重组到依赖T4 RNA聚合酶的高效表达载体pQE-30中,在大肠杆菌中得到高效表达,酶活性可高达180　U/mL发酵液,经稳定性测定,重组菌株在37 ℃连续培养至67代时仍保持酶活性。     

α-酮戊二酸对低水氮下冬小麦产量相关性状的影响

[目的]为建立冬小麦抗逆应变的化学调控技术。[方法]以周麦22为材料,在大田条件下研究了外源喷施α-酮戊二酸对低水氮条件下小麦产量形成相关性状的影响。[结果]外源α-酮戊二酸增加了低水氮条件下冬小麦叶片SPAD值、全氮含量及氮素转运率,千粒重、产量及氮肥偏生产力明显提高。[结论]外源喷施α-酮戊二酸是一种改善低水氮胁迫下小麦生长的有效手段。     

抗生素和重金属镉单一和复合污染对集胞藻PCC6803的影响

为评估抗生素和重金属对藻类生态系统的影响,本研究探讨了四环素（tetracycline,TC）/磺胺甲噁唑（sulfamethoxazole,SMX）与Cd²⁺ 的4个单一处理（100 ng/L TC;100 ng/L SMX;0.001 mg/L Cd²⁺;0.5 mg/L Cd²⁺）以及4个复合处理（100 ng/L TC+0.001 mg/L Cd²⁺;100 ng/L TC+0.5 mg/L Cd²⁺;100 ng/L SMX+0.001 mg/L Cd²⁺;100 ng/L SMX+0.5 mg/L Cd²⁺）对集胞藻的生长、光合活性以及抗氧化系统的影响。结果显示,100 ng/L SMX刺激集胞藻的生长和光合活性,而用100 ng/L TC处理则无明显影响;0.001 mg/L Cd²⁺对集胞藻的各项指标均无明显影响,但0.5 mg/L Cd²⁺明显抑制集胞藻的生长和光合作用,破坏抗氧化系统,损伤细胞膜,刺激集胞藻分泌胞外多糖。抗生素与镉复合污染处理方面,100 ng/L TC与0.001 mg/L Cd²⁺共存时,增强集胞藻酯酶活性、刺激分泌胞外多糖;100 ng/L SMX与0.001 mg/L Cd²⁺共存时,促进集胞藻生长、增强光合作用和酯酶活性;100 ng/L SMX与0.5 mg/L Cd²⁺共存时,SMX能缓解高浓度Cd²⁺造成的氧化损伤,较单一高浓度Cd²⁺处理组的ROS产量减少、SOD酶活降低、MDA含量降低、协同刺激集胞藻酯酶活性;而100 ng/L TC不能显著缓解高浓度Cd²⁺对细胞的损伤。研究结果表明,低浓度四环素对细胞生长影响较小,也基本不改变Cd²⁺对集胞藻细胞的毒性,而低浓度磺胺甲噁唑会促进细胞生长,且能够减轻Cd²⁺对集胞藻细胞的毒性,在污染评估时需综合考虑抗生素和重金属的复合污染。     

伞枝犁头霉发酵蔗糖产α-酮戊二酸条件的优化

研究伞枝犁头霉D1利用蔗糖生产α-酮戊二酸的发酵条件优化.结果表明:1)最佳发酵培养基组成为:蔗糖40 g/L,NaNO3 1 g/L,KH2PO4 1.36 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,NaCl 2 g/L,玉米浆0.5 g/L,CaCO3 40 g/L,叶酸2 g/L.2)最佳培养条件为:250 mL摇瓶装液25％,培养温度37℃和转速200 r/min.在此条件下培养84 h,伞枝犁头霉产α-酮戊二酸量最大达14.0 g/L,产酸速率为0.17 g/(L·h),对蔗糖的转化率为34.9％.伞枝犁头霉D1能够有效利用蔗糖发酵产α-酮戊二酸,具有较好的科研价值和工业应用前景.