鸡β-防御素-9的融合表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的探究重组禽β-防御素6 (AvBD6)、禽β-防御素9 (AvBD9)蛋白的原核表达及其生物学特性。方法将AvBD6和AvBD9成熟肽基因克隆到表达载体pGEX-6P-1上,进而将重组表达质粒转化到BL21(DE3)pLysS 感受态中,用IPTG进行诱导表达后对其进行纯化,SDS-PAGE电泳分析重组蛋白AvBD6和AvBD9的表达情况,继而检测其体外抗菌活性并用透射电镜观察细菌形态变化,检测重组蛋白对鸡红细胞的溶血活性。结果重组AvBD6和AvBD9蛋白诱导表达的分子量约为30 ku,且主要在上清中表达。2种重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抗菌活性。电镜观察显示：菌体内容物外泄,损伤严重,并且重组蛋白对鸡红细胞无溶血活性。结论本研究制备的AvBD6和 AvBD9重组蛋白具有良好的生物安全性和抑菌效果,为进一步研究其抗菌机制及临床初步应用奠定了基础。     

β-防御素研究进展

β-防御素在黏膜上皮细胞广泛表达,在先天免疫系统中扮演重要角色。因具有独特的抗菌机制和广谱抗细菌、抗真菌、抗病毒活性。极难产生抗药性而日益受到人们的关注。就β-防御素的分子特征、生物学活性、抗菌机理、基因重组表达,目前科研中存在的问题及其应用前景做了综述,为临床医学提供参考。     

猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达

用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。     

鸡β- 防御素7 的克隆及表达

以NCBI已登录的鸡β-防御素7(登录号:NM_001001194)为模板,设计特异性引物,扩增鸡β-防御素7基因,目的基因与pET32a载体相连,构建表达质粒并导入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达和抗菌试验。结果表明,PCR扩增的目的片段,经测序证明与鸡β-防御素7基因NM_001001194序列同源性达99%,经IPTG诱导表达的重组蛋白与预期大小相符。平板抑菌试验结果表明,该重组多肽对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌活性。     

慢病毒介导稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系构建及其活性验证

【目的】筛选稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系（DF-1）,并基于单链退火修复机制（Single Strand Annealing, SSA）的报告载体系统,检测 DF-1 细胞系中的 Cas9 核酸酶活性。【方法】将携带 Cas9 蛋白的慢病毒载体质粒与辅助质粒一起转染 293T 细胞包装慢病毒,收集慢病毒 Cas9 上清液感染 DF-1 细胞,经抗生素筛选得到稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞,分别用 PCR 和 Western blot 验证阳性 DF-1 细胞表达 Cas9 蛋白的情况;选择鸡卵清白蛋白（OVA）基因的 sgRNA 序列,将 sgRNA 退火产物克隆至 pYP152 构建 sgRNA 表达载体,并在 sgRNA 靶位点两端设计引物扩增 OVA 基因靶片段,将靶片段克隆至报告载体 pCMV-SSA-mCherry-Hind Ⅲ,以破坏 mCherry 蛋白的表达,之后再将 sgRNA 表达载体与 SSA 报告载体共同转染稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞,最后在荧光显微镜下分析不同稳转株对 mCherry 蛋白表达的修复情况。【结果】经抗生素筛选得到 27 株稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系,采用 PCR 扩增稳转细胞基因组,结果显示这些细胞具有 Cas9 蛋白基因序列,Western blots 试验结果显示上述稳转细胞株均表达 Cas9 蛋白;sgRNA 表达载体与 mCherry-SSA 报告载体共转后,通过荧光显微镜观察发现筛选到的稳转细胞株均可恢复报告载体中 mCherry 蛋白的表达。【结论】成功构建了具有切割活性的稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系,可为后续在稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系上开展鸡相关功能基因研究提供基础材料。     

重组鸡β-防御素12蛋白的原核表达及其生物学特性分析

为探讨鸡β-防御素12（AvBD12）的生物学特性,试验采用RT-PCR方法从鸡脾脏组织中扩增到鸡AvBD12基因,其cDNA大小为198 bp,编码65个氨基酸。将该基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体pProex HTa上,进行原核表达。Tricine-SDS-PAGE电泳表明,重组鸡AvBD12融合蛋白分子质量约为14 ku。对该重组蛋白进行纯化与体外抗菌活性的测定,结果显示,纯化后的重组鸡AvBD12融合蛋白对金黄色葡萄球菌和兔波氏杆菌有较高抗菌活性,对猪霍乱沙门氏菌和乳酸菌的抗菌活性较弱。高盐浓度对其抗菌活性有显著影响。该重组蛋白对鸡红细胞无显著溶血活性。荧光定量PCR结果表明,AvBD12基因在所测定的15个鸡组织器官中均有表达。     

孕酮对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1 mRNA表达的影响

旨在研究孕酮(P4)对绵羊输卵管上皮细胞内β-防御素-1( SBD-1) mRNA基因表达的影响及可能参与的信号通路,利用10^-8 mol/L P4培养绵羊输卵管上皮细胞2 h、6 h、12 h、24 h、48 h,利用RT-qPCR技术检测 SBD-1 mRNA的表达变化,选取P4诱导 SBD-1 mRNA表达的最佳时间。分别添加P4核受体阻断剂RU-486、蛋白激酶C (PKC)阻断剂H-7、蛋白激酶A (PKA)阻断剂H-89干预绵羊输卵管上皮细胞1h,再使用P4处理细胞。结果显示,用10^-8mol/L P4诱导绵羊输卵管上皮细胞6 h, SBD-1 mRNA表达显著升高;添加RU-486和H-89显著抑制P4诱导的 SBD-1 mRNA的表达;添加H-7后 SBD-1 mRNA的表达量无显著性差异。以上结果表明,P4诱导的绵羊输卵管上皮细胞中 SBD-1 mRNA的表达通过孕酮核受体(PR)和PKA信号通路介导,与PKC信号通路激活无关。     

奶牛β-防御素5基因的克隆与原核表达

根据已发表的β-防御素5基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增奶牛白细胞β-防御素5基因片段,构建原核表达载体并进行诱导表达.结果表明:将PCR产物插入pGEM-T easy载体后,经琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切及DNA测序证明构建的重组克隆载体完全正确,以该重组质粒为模板扩增目的基因的成熟肽片段,产物用EcoR I+NotⅠ双酶切并与原核表达载体PET28a连接,获得了预期的重组表达质粒.将重组表达质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中,用异丙基--βD-硫代半乳糖苷诱导表达,经尿素-SDS-PAGE检测表明表达产物为6.4 kda的融合蛋白.     

LPS注射后小鼠乳腺中β-防御素1 mRNA表达的变化

为了研究β-防御素1(β-defensin 1,Defb1)基因在小鼠乳腺发生炎症反应时的表达变化,本试验以小鼠第4对乳腺组织为研究对象,用LPS诱导小鼠乳腺组织发生炎症,半定量RT-PCR法研究了小鼠乳腺中Defb1 mRNA表达的相对丰度。试验结果表明,与对照组相比,LPS诱导后各时期Defb1基因的表达量均显著增加(P<0.05),9 h时达到最高峰。     

牦牛β-防御素5基因的原核表达及表达产物的抑菌活性

【目的】克隆与表达牦牛β-防御素5(BNBD5)基因,检测其重组蛋白的体外抗菌活性。【方法】采用RT-PCR方法从牦牛肺组织中扩增BNBD5基因成熟肽编码区,根据已发现的哺乳动物β-防御素5和部分禽β-防御素5的序列构建遗传进化树。将BNBD5基因亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pET32a-BNBD5。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG于37℃进行诱导表达,SDSPAGE检测融合蛋白的表达情况,并对该重组蛋白进行纯化,测定其体外抑菌活性。【结果】克隆得到了BNBD5基因成熟肽编码片段,其长度为138bp,编码45个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现,该基因序列与黄牛的mRNA同源性最高,可达到86.2%。经IPTG诱导,获得了分子质量为25ku的牦牛β防御素-5成熟肽融合蛋白。琼脂糖扩散结果表明,0.08mg/mL的纯化蛋白对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有抗菌作用。【结论】牦牛BNBD5成熟肽在大肠杆菌中得到了成功表达,其产物对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均有抗性。     

鸡β-防御素及其真核表达载体构建分析

本文介绍鸡β-防御素和研究现状,并对其真核表达栽体构建的可行性进行了可行性分析.     

萨能奶山羊β-防御素-3基因的克隆、序列分析及差异表达

β-防御素-3(BD-3)基因在乳腺炎病程中有重要作用,目前尚未见有关山羊BD-3基因的研究报道,根据已发表的牛的BD-3基因序列的编码区(CDS)设计引物,经RT-PCR、连接T载体、挑取克隆和测序,成功克隆出长度为210bp的萨能奶山羊BD-3基因CDS区,并提交至GenBank。分析该CDS区的核苷酸和氨基酸序列,结果表明,所得核苷酸序列与牛、人的序列同源性分别为91.2%和80.9%;其氨基酸序列在萨能奶山羊BD-3蛋白的功能结构域(含23~67个氨基酸)与人的结构域同源性为99.9%,蛋白质三级结构相似。分别用热灭活的金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、大肠杆菌对乳腺上皮细胞刺激0、2、4、6、8h,观察BD-3基因的mRNA水平变化,结果显示,金黄色葡萄球菌刺激4h后,BD-3表达量达到最高,与对照组相比差异极显著(P0.01);停乳链球菌刺激后,BD-3表达量持续升高,8h时与对照组差异极显著(P0.01);大肠杆菌刺激后,BD-3表达量逐渐升高,4h时达到最高,但与对照组差异不显著,之后表达量逐渐下降。成功克隆出山羊BD-3基因,并且在金黄色葡萄球菌、停乳链球菌的刺激下有较高水平的表达,说明BD-3基因在乳腺炎病程中起到重要作用,为乳腺炎的机理研究提供借鉴。     

山羊β-防御素蛋白的理化性质对其抗菌活性的影响

为了解山羊内在防御系统中发挥的重要作用,在山羊防御素保守序列的基础上设计了12条不同理化性质的防御素(DGBD1~12)基因,克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA的EcoR I和Not I酶切位点,构建重组表达载体pPICZαA-DGBD。经SaI线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经PCR鉴定阳性重组菌。经过摇瓶发酵和甲醇诱导,阳性重组菌的发酵上清液对大肠杆菌,金黄色葡萄球菌等具有较强的抑制作用。最小抑菌浓度测定显示重组质粒对大肠杆菌的抑制作用最强。研究结果显示,疏水指数较高的序列DGBD1~DGBD3的抗菌活性较好,稳定指数较低的序列DGBD4~DGBD6抗菌活性仅次于疏水指数,说明DGBD结构稳定性和疏水性对其抗菌活性有较大影响。     

鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达

对鸡β-防御索-3(Gal-3)在毕赤酵母中的分泌表达进行了研究.以重组质粒CaJ-3-T为模板,利用PCR技术扩增出Gal-3基因成熟肽片段,将该片段插入到酵母表达载体pPICZα-C,构建分泌型重组表达载体pPICZα-C-Gal-3,电转入表达宿主菌X-33毕赤酵母,Zeocin抗性筛选重组菌株;挑取阳性菌株经甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳发现在约4.5 kDa位置出现预期条带;对所表达的Gal-3进行抗菌活性检测,发现其具有抗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细黹的活性.     

黄沙鳖β-防御素基因克隆及其表达分析

[目的]明确β-防御素在黄沙鳖先天免疫中的潜在作用,为开展黄沙鳖绿色病害防治及促进其养殖业健康发展打下基础.[方法]运用RACE克隆黄沙鳖β-防御素基因(Hs-BD1)cDNA序列,采用SignalP-5.0、PredictProtein、PSIPRED、Robetta和Clustal X等在线软件进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR检测Hs-BD1基因在黄沙鳖不同组织中的表达特征及细菌感染前后的表达变化.[结果]Hs-BD1基因cDNA序列全长493 bp,包括72 bp的5'非编码区(5'-UTR)、201 bp的开放阅读框(ORF)及220 bp的3'非编码区(3'-UTR).Hs-BD1基因编码66个氨基酸残基,包括22个氨基酸残基组成的信号肽区、3个氨基酸残基组成的前肽区和41个氨基酸组成的成熟肽区.其中,成熟肽区具有6个保守的半胱氨酸残基(31Cys、58Cys、38Cys、52Cys、42Cys和59Cys)及位于C1和C2间的甘氨酸残基(Gly),即Hs-BD1基因属于β-防御素家族.Hs-BD1氨基酸序列与中华鳖β-防御素16的相似性最高(93.9%),基于β-防御素序列相似性构建的系统发育进化树也显示黄沙鳖与中华鳖和西部锦龟聚为一支,其亲缘关系相对较近.6个保守的半胱氨酸残基分别以C1-C5、C2-C4和C3-C6的连接方式形成3个二硫键;Hs-BD1成熟蛋白三级结构是由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成.Hs-BD1基因在黄沙鳖肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的相对表达量较高,在心脏、肠道、肌肉、脑组织和表皮中的相对表达量均较低;以温和气单胞菌攻毒后,Hs-BD1基因在黄沙鳖脾脏中的相对表达量呈上升—下降—上升—下降的变化趋势,在攻毒后第3和36 h共出现2个表达峰值,对应的相对表达量分别是攻毒前(0 h)的20.8和10.6倍,差异均极显著(P<0.01).[结论]Hs-BD1基因在黄沙鳖的多个组织中均有表达,尤其在肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的相对表达量较高,且可被温和气单胞菌感染诱导表达,说明Hs-BD1基因在黄沙鳖抵抗病原感染的过程中发挥调控作用.     

基于重组毕赤酵母的鳜鱼β-防御素生物合成及其抑菌活性

鳜鱼β-防御素(Siniperca chuatsiβ-defensin,ScBD)多肽链由N端的信号肽和C端的成熟肽组成,通过构建产鳜鱼β-防御素的毕赤酵母重组菌株,以解决天然免疫小分子抗菌肽的来源问题。通过RT-PCR从鳜鱼脾脏中分离编码β-防御素成熟肽的基因ScBD,将其与表达载体pPICZαA连接后构建重组表达载体pPICZαA-ScBD并转入毕赤酵母X-33;通过含高浓度博来霉素的YPD平板筛选阳性转化子后,于28℃、250 r/min和pH 6.0的条件下,使用1%甲醇诱导表达96 h;经镍离子亲和层析对重组毕赤酵母菌株的产物进行纯化,并对纯化产物进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定;通过平板涂布法和浊度法检测该重组菌株产物的抑菌活性。结果表明:基于质谱分析的一级结构鉴定证明纯化产物为分子量6.35 ku的预期重组ScBD;抑菌实验显示重组菌株产物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的抑制率分别为94.34%、86.97%和85.92%。本文构建的重组毕赤酵母菌株能有效合成具有生物学活性的重组ScBD,为鱼类来源天然小分子抗菌肽的进一步开发提供了技术途径。     

梅花鹿β-防御素-1(siBD-1)cDNA的克隆及序列分析

从梅花鹿的舌黏膜上皮组织中提取RNA,根据已获得的驯鹿β-防御素reBD-1基因序列设计并合成引物,采用RT-PCR技术进行梅花鹿β-防御素siBD-1基因的扩增,将获得的300bp的cDNA进行双向克隆及序列测定分析。结果表明所克隆出的cDNA为梅花鹿β-防御素siBD-1,该cDNA包含由192个碱基组成的开放读码框(ORF),编码64个氨基酸残基的前原防御素,该前原防御素含有β-防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。siBD-1 cDNA的获得为以后更好地研究梅花鹿黏膜防御机制奠定了基础。     

猪β防御素-1基因乳腺特异性表达载体的构建

为构建标记基因可去除的β防御素-1(pBD-1)基因乳腺特异性表达载体,利用RT-PCR方法从猪脾脏中克隆获得pBD-1基因,再插入乳腺特异性表达骨架载体pBC1-neo中;经PCR、酶切电泳以及测序鉴定,确认成功构建出乳腺特异性表达pBD-1的载体。进一步将上述功能片段亚克隆至能将标记基因全部去除的骨架载体MCS-3s-loxP-GFP中,成功构建了一种筛选标记可全部去除的乳腺特异性3s-loxP-GFP-pBC1-pBD1转基因载体。该载体为研究pBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机制,以及创制乳腺高效表达pBD-1的转基因猪育种新材料和通过哺乳以提高新生仔猪抗病力奠定了基础。     

猪β防御素3表达载体的构建及其 在大肠杆菌中的表达

根据Gen Bank上发表的猪β防御素3(p BD3)基因的序列,通过生物学软件预测其成熟肽序列。提取猪舌组织RNA,设计引物,通过PCR的方法扩增得到约150 bp的p BD3成熟肽基因序列,构建其原核表达载体p ETp BD3,并获得工程菌株BL21-pET-p BD3。IPTG诱导表达后,比对照多表达了1条约16 k D的蛋白条带,通过免疫蛋白印记说明所表达的蛋白为带有His·Tag的融合蛋白,证明p BD3成功表达。     

鸭β-防御素9基因的克隆、组织分布及其原核表达

 【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素9（AvBD9）基因,在原核表达重组鸭AvBD9蛋白;研究重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【方法】采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD9基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD9基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD9,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达;亲和层析纯化蛋白,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【结果】从鸭肝脏组织中克隆得到鸭AvBD9基因,序列分析表明该基因大小为204 bp,前体肽包括67个氨基酸残基。AvBD9基因在鸭体内广泛分布。SDS-PAGE电泳表明鸭AvBD9基因在大肠杆菌中高效表达,表达的重组鸭AvBD9融合蛋白以包涵体的形式存在,分子量约31 kD。重组鸭AvBD9蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性,在-70～100℃或pH 3～10处理30 min后仍有抗多杀性巴氏杆菌作用。【结论】鸭AvBD9基因为204 bp,编码67个氨基酸残基,在鸭组织中广泛分布。重组鸭AvBD9蛋白基因在大肠杆菌中高效表达,该重组蛋白具有广谱的抗菌活性,对温度和酸碱性有较高的稳定性。