电穿孔法诱导GUS基因在坛紫菜原生质体中的瞬间表达

基因工程研究已在高等植物中广泛开展，尤其对重要经济作物如水稻、玉米、大豆等的品种改良不断取得可喜成果。在藻类中基因工程起步较晚。Rochaix和Van Dillewjin于1982年第一次报道了对单细胞衣藻以质粒为载体进行的基因转移[Rochaix等，1982]；Veeck等于1987年以蓝藻为材料进行了基因转移的研究，Boynton等于1988年以衣藻为材料成功地得到了转基因藻株[王素娟．1994]。     

莱茵衣藻MAPK4基因RNAi载体的构建及鉴定

[目的]构建莱茵衣藻2A38的MAPK4基因的RNAi载体。[方法]提取莱茵衣藻细胞总RNA,利用PCR扩增出编码MAPK4的基因片段,用基因工程技术将MAPK4基因片段连接载体p MD18-T上,经过2次不同的双酶切后,与RNAi中间载体p T282连接,最后连接到干涉载体p Maa7IR/XIR上,用酶切及测序鉴定MAPK4基因RNAi载体并转化莱茵衣藻。[结果]经限制性内切酶酶切及测序鉴定,证实为重组质粒,并且该重组载体可在莱茵衣藻中表达。[结论]构建的MAPK4基因RNAi载体结构正确,为进一步利用RNAi技术使MAPK4基因沉默表达,研究MAPK4在莱茵衣藻中的生物学功能奠定了试验基础。     

鱼类基因转移研究中存在的问题与对策

转基因动物技术是20世纪80年代初发展起来的一项生物领域高新技术[1]。转基因鱼模型的构建为鱼类基因工程育种奠定了理论基础,基因导入方法的成熟、胚胎干细胞技术的发展以及基因组学理论的应用为鱼类基因工程育种提供了操作平台。目前,转基因技术在外源基因片段长度、外源基因定点整合率、外源基因表达率、转基因动物存活率等技术方面都有了很大提高。转基因动物的研究内容也非常广泛,从基础理论到应用技术,从实验室到生产也都有了较大发展,如基因表达的调控、基因产品的制备、动物品种的培育等[2]。以下就鱼类基因转移研究中转基因技…     

鱼类基因转移研究中存在的问题与对策

转基因动物技术是20世纪80年代初发展起来的一项生物领域高新技术[1]。转基因鱼模型的构建为鱼类基因工程育种奠定了理论基础,基因导入方法的成熟、胚胎干细胞技术的发展以及基因组学理论的应用为鱼类基因工程育种提供了操作平台。目前,转基因技术在外源基因片段长度、外源基因定点整合率、外源基因表达率、转基因动物存活率等技术方面都有了很大提高。转基因动物的研究内容也非常广泛,从基础理论到应用技术,从实验室到生产也都有了较大发展,如基因表达的调控、基因产品的制备、动物品种的培育等[2]。以下就鱼类基因转移研究中转基因技…     

油菜叶绿体多顺反子双交换表达载体的构建(英文)

[目的]构建甘蓝型油菜叶绿体多顺反子表达载体,以期为油菜叶绿体基因工程研究奠定基础。[方法]根据GenBank中已知的油菜叶绿体DNA序列AF267640和Z50868,设计两对引物,用PCR方法获得了两段甘蓝型油菜叶绿体DNA片段,分别命名为RbcL和ACCD。将这两段甘蓝型油菜叶绿体DNA同源片段克隆到质粒pMD18-T中得到质粒pHBM715,然后再将由壮观霉素抗性基因aadA、甘露聚糖酶基因man和绿色荧光蛋白基因gfp这3个基因串联的表达盒克隆到质粒pHBM715中,从而构建成甘蓝型油菜叶绿体多顺反子表达载体pHBM716,并将该载体在大肠杆菌中进行表达鉴定。[结果]通过平板定性分析对所构建的油菜叶绿体表达载体上的表达盒进行了功能鉴定,表明同一多顺反子的3个基因在大肠杆菌中均得到了表达。[结论]该研究成功构建了甘蓝型油菜叶绿体多顺反子表达载体,为油菜叶绿体基因工程研究奠定了基础。     

小冰麦附加系高代材料中染色体的组成和变异研究

[目的]中间偃麦草因含有许多有益基因,在小麦育种工作中经常用来和普通小麦杂交改良小麦。[方法]在本研究中,以小冰麦附加系的高代材料为研究对象,应用FISH、GISH、Mc-GISH技术检测小冰麦异附加系高代材料TAI系列的染色体组成和变异情况。[结果]细胞学检测结果表明:在TAI-I和TAI-II系列高代材料中,均检测到后代染色体发生重构和染色体变异,包括置换、断裂、易位以及着丝粒变异。[结论]这些细胞学水平的染色体结构变异更进一步验证了通过创制育种中间材料实现将有益基因转移到普通小麦中的可行性,同时,这些新材料的创制也为异源新种质的创制奠定基础。     

植物基因工程发展现状与展望

1　植物转基因方法的研究进展到目前为止 ,植物基因工程已经在很多方面有了深入的发展。包括 :目的基因的分离克隆 ,基因工程的克隆载体[1 ] ,转基因方法的研究[2 ,3] ,基因转移的表达 ,转基因作物的利弊探析[4～ 8] ,分子标记的方法 ,分子标记在作物品种资源和遗传育种中的应用等[9～ 1 1 ] 。迄今为止 ,用于植物外源基因的导入方法和技术很多 ,这些方法在不同的植物类型和组织中有着不同的适用范围和优缺点。1 .1　土壤农杆菌转化系统农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌 ,与植物基因转化有关的有两种类型 :一为根癌农杆菌 (Ａ ｇｒｏｂａｃｔ…     

转抗草甘膦基因烟草T-DNA侧翼序列的扩增与分析

[目的]研究抗草甘磷基因在烟草中的插入位点、T—DNA结构等整合情况。[方法]利用现有的3个转抗草甘膦基因的烟草材料,通过PCR Walking的方法扩增出携带抗草甘膦基因的T-DNA侧翼序列,并用DNAMAN、BLAST等生物信息学方法进行分析。[结果]对获得的PCR条带进行分析,结果表明这些侧翼序列均含载体骨架序列且结构各不相同。T-DNA和载体骨架序列都存在重组现象。[结论]研究在转基因植株中检测到了载体的骨架结构,说明转基因的同时有可能会造成非目的基因的转移,即转基因植物存在一定的风险,应对转基因植物转化载体和基因工程技术路线进一步改良。     

羊传染性脓疱病毒B2L基因片段重组腺病毒载体的构建

[目的]利用腺病毒载体系统构建羊传染性脓疱病毒B2L基因重组腺病毒载体。[方法]以从羊传染性脓疱病毒株JLSY04中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增获得B2L目的基因片段;然后将B2L目的基因克隆至PDNR-CMV载体,筛选阳性克隆获得质粒CTC572-6;再将质粒CTC572-6与腺病毒载体进行同源重组,筛选阳性克隆,并进行菌液PCR、酶切、测序等鉴定。[结果]经酶切和基因测序等鉴定,成功构建了携带羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组腺病毒载体CTC572Ade-30。[结论]为羊传染性脓疱基因工程疫苗的进一步研究奠定基础。     

羊传染性脓疱病毒B2L基因片段重组腺病毒载体的构建（摘要）（英文）

[目的]利用腺病毒载体系统构建羊传染性脓疱病毒B2L基因重组腺病毒载体。[方法]以从羊传染性脓疱病毒株JLSY04中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增获得B2L目的基因片段;然后将B2L目的基因克隆至PD-NR-CMV载体,筛选阳性克隆获得质粒CTC572-6;再将质粒CTC572-6与腺病毒载体进行同源重组,筛选阳性克隆,并进行菌液PCR、酶切、测序等鉴定。[结果]经酶切和基因测序等鉴定,成功构建了携带羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组腺病毒载体CTC572Ade-30。[结论]为羊传染性脓疱基因工程疫苗的进一步研究奠定基础。     

铜绿微囊藻与衣藻竞争能力的比较研究

[目的]研究不同营养条件下铜绿微囊藻和衣藻间的种群竞争关系。[方法]以Lotka-Volterra的双种竞争模型为基础,通过纯培养取得参数K和r,变模型的微分形式为差分形式,以生长拐点出现时间作为竞争参数的起始时间,经模拟计算获得2种藻间的竞争参数。[结果]在中、富、重富营养条件下,铜绿微囊藻竞争抑制能力要高于衣藻,而在基础培养条件（M-11培养液）中2种藻的竞争抑制能力相近。[结论]该研究为防控水华的暴发提供理论基础。     

单壁碳纳米管对莱茵衣藻光合产氢的影响

[目的]研究单链DNA包裹前、后的单壁碳纳米管(SWCNT)对莱茵衣藻光合作用和光合产氢的影响,为利用藻类高效产氢提供新思路。[方法]对单壁碳纳米管进行单链DNA修饰,利用光谱学等方法表征其理化性质。将单链DNA包裹前、后的单壁碳纳米管引入莱茵衣藻培养体系共孵育,观察单壁碳纳米管在衣藻细胞中的分布及其对衣藻光合作用和光合产氢的影响。[结果]单链DNA修饰可以增加单壁碳纳米管在溶液中的稳定性,减少纳米管团聚引起的衣藻细胞聚集。单链DNA包裹前、后的单壁碳纳米管对莱茵衣藻生长仅有轻微抑制。在缺硫条件下,与对照相比,2种形态单壁碳纳米管(ss DNA/SWCNT、SWCNT)均造成衣藻PSⅡ活性下降,呼吸速率显著高于光合速率,从而诱导衣藻细胞更快进入缺氧状态。2种形态单壁碳纳米管均可促进莱茵衣藻光合产氢,但未经包裹的单壁碳纳米管效果更加明显,可提高产氢量5倍以上。[结论]单链DNA包裹可提高单壁碳纳米管在溶液中的稳定性和分散性。单壁碳纳米管可通过影响PSⅡ活性和增强呼吸代谢的方式促进莱茵衣藻光合产氢。     

甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复材料的创制(英文)

[目的]萝卜细胞质雄性不育(OguCMS)是甘蓝型油菜杂种优势利用理想途径,但由于恢复基因仅存在于萝卜基因组难以直接利用,转育萝卜恢复基因是实现甘蓝型油菜OguCMS应用突破的关键。[方法]本研究以萝-蓝(Rap hanobrassica,2n=58)为恢复基因供体材料,利用嫁接克服远缘杂交生殖障碍,并对获得的属间杂种通过甘蓝型油菜性状、自(异)交结实性状以及恢复率稳定性状等强化筛选,育成了一份甘蓝型油菜OguCMS纯合恢复材料CLR650。[结果]该恢复材料体细胞染色体数目在38～40条之间,减数分裂过程中部分细胞存在染色体落后及形成染色体桥等异常现象,但细胞异常对正常花粉最终形成没有明显影响,恢复株自交、测交均为100%可育。以基于OguCMS恢复基因(Rf0)设计的特异分子标记进行检测,证明该材料存在OguCMS恢复基因。以与之连锁其它萝卜分子标记分析比较,表明其萝卜片段长度短于国外同类恢复系R113。[结论]CLR650的育成为甘蓝型油菜OguCMS创制了新型恢复材料。     

低浓度磷酸盐对绣源河铜绿微囊藻和衣藻生长的影响

[目的]研究低浓度磷酸盐对铜绿微囊藻和衣藻生长的影响。[方法]以BG-11培养基为基础,配制成不同磷酸盐质量浓度的培养基,使用叶绿素a含量与培养液吸光度作为指标检测铜绿微囊藻和衣藻的生长状况。[结果]磷酸盐是铜绿微囊藻生长的限制性因素,其浓度为0.02~0.10 mg/L时,随磷酸盐浓度增加,铜绿微囊藻生长速率增高,在磷酸盐质量浓度为0.10 mg/L时,生长情况最好;当浓度达到0.20 mg/L时,生长速率不再增高。而对于衣藻,磷酸盐质量浓度0.01~0.15 mg/L可以促进衣藻的增殖,在质量浓度为0.10 mg/L时,其生长最好;而浓度达到0.20 mg/L时,衣藻的生长出现了轻微的抑制现象。[结论]该研究可为绣源河风景区水体富营养化的评价和预防提供可靠的数据参考。     

鸡大肠杆菌FimH基因C端结构域克隆及特性分析

[目的]通过进一步研究禽大肠杆菌I型菌毛主要结构基因FimH的基因结构及其抗原特性,为深入探索鸡大肠杆菌致病机理及研制基因工程疫苗奠定必要的理论基础。[方法]本文以已发表的Fim H基因C端核酸序列为参考序列,设计并合成引物,扩增鸡大肠杆菌JS1、JS2、JS6三个菌株的Fim H相应基因,使用Lasergene软件对其进行序列比对、蛋白质结构预测以及进化树的绘制等。[结果]JS1、JS2、JS6三个菌株的核酸同源性分别为97.3%、97.7%和97.3%,而氨基酸序列的相似性分别为95.3%、97.6%和95.3%。此外,其抗原决定簇基本相似,但在第78和79位抗原决定簇不同,这说明本研究中的3个鸡大肠杆菌菌株的Fim H基因序列及氨基酸序列的变异可能对Fim H蛋白抗原结构产生了轻微影响。进化树分析发现,本实验室分离的3株鸡大肠杆菌菌株FimH基因与选择的国内鸡大肠杆菌菌株的Fim H基因同源性比较高,同处于一个进化分支中。[结论]本研究结果表明鸡大肠杆菌I型菌毛Fim H基因未发生明显变异,这为后续研究Fim H基因的功能及其基因工程亚单位疫苗研发提供了重要的实验基础。     

阿维链霉菌aveD基因的定点突变(英文)

[目的]获得aveD基因定点突变株,为阿维菌素的遗传育种提供理论依据。[方法]采用重叠延伸PCR技术对aveD基因进行定点突变,并通过体外酶切连接等分子生物学操作,构建了aveD基因的定点突变载体pDC3(pKC1139∷aveD、),导入阿维菌素(Avermectin)产生菌阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)76-9的aveD基因缺失突变株489中。[结果]经过同源重组,获得aveD基因定点缺失突变株536。测序结果表明突变株536,aveD基因编码区中第69位碱基C突变为T,相应的氨基酸序列第23位由Thr突变为Ile。[结论]该研究为研制生产阿维菌素B的基因工程菌奠定了基础。     

矮牵牛PhDFR基因和抗除草剂Bar基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化研究

[目的]构建矮牵牛PhDFR基因的植物表达载体,并对烟草进行遗传转化。[方法]从不同花色的矮牵牛中克隆了2个PhDFR基因,通过目的基因序列克隆、多步载体酶切、连接、转化等技术手段,将其连入通用植物表达载体pCAMBIA2300及pCAMBIA3301。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101继而转化烟草。[结果]构建了含卡那霉素抗性筛选标记基因NPT11和除草剂抗性筛选标记基因Bar的GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA2300-PhDFR-GFP和pCAMBIA3301-PhDFR-GFP。转基因植株的GUS染色结果进一步验证了所构建表达裁体的正确性和实用性。[结论]所构建的表达载体为进一步研究PhDFR基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程研究奠定了基础,为植物基因工程科研工作提供了优良的备选植物表达我体。     

微针注射甜玉米胚芽gus基因转化瞬时表达研究

[目的]研究微针注射甜玉米（Zea mays L.）胚芽gus基因转化瞬时表达,为玉米遗传转化的进一步研究奠定基础。[方法]以农杆菌为介导,采用gus基因瞬时表达技术,建立了胚芽注射开放性基因转化体系。[结果]3 mm长的胚芽为最适转化受体;农杆菌EHA105菌液浓度最适OD值为0.558～0.630;gus基因转化最适共培养天数为3 d。在以上最适转化条件下,微针注射胚芽生长点基因转化率为1%。[结论]该研究可为改良甜玉米遗传性状,培育基因工程新品种提供参考。     

厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达的初步分析（摘要）

[目的]研究厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达。[方法]通过对前期所获得的厚壳贻贝多条mytilin和myticin抗菌肽基因进行筛选,选择其中5条厚壳贻贝抗菌肽基因,采用PCR技术和DNA重组技术构建了相关的真核表达载体,并采用LiAC转化法将其转化到S78酿酒酵母中并进行初步表达分析。[结果]5种厚壳贻贝抗菌肽基因的真核表达载体构建成功,对转化酵母其进行mRNA检测结果表明,5种厚壳贻贝抗菌肽的基因在S78酵母中成功转录。[结论]该研究结果为最终采取基因工程手段表达厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin并在此基础上开展厚壳贻贝抗菌肽的后续研究奠定基础。     

不洁贮藏对葡萄果肉衰老相关基因表达的影响

[目的]研究不洁贮藏对葡萄果肉衰老相关基因表达的影响。[方法]以巨峰葡萄果实为材料,应用实时荧光定量PCR技术对不同处理的相对表达量进行测定。[结果]ACC氧化酶基因、ACC合成酶基因、苯丙氨酸解氨酶基因表达量明显上调;脱落酸调控基因表达量明显下调。[结论]该试验为从基因水平上研究葡萄保鲜机理奠定了基础。