野桑蚕Bmand-Sxl基因的克隆及原核表达

鳞翅目(Lepidoptera)扩充是危害农林业的主要害虫类群,生殖和遗传控制是其生物控制的重要发展方向。Sxl是果蝇性别决定调控网络中的关键基因。本文根据家蚕的Bm-Sxl基因序列(NCBI:AB207267.1,AB207268.1),克隆了野桑蚕2条Bmand-Sxl基因序列,并在大肠杆菌中进行了原核表达了其中一条。     

野桑蚕泛素基因的克隆及原核表达

泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway)是具有高度选择性的蛋白质降解途径,该途径对细胞内蛋白的选择性降解起着重要作用。设计一对特异引物,从野桑蚕体壁细胞中克隆了单体泛素基因的编码区,其GenBank登录号DQ839401。序列分析表明,该编码区的长度为231 bp,编码76个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量约为8.6 kD,等电点为5.73。同源性比较发现,野桑蚕泛素基因与其他真核生物泛素基因在核苷酸水平上有83%同源性,在氨基酸水平上具有94%以上的相似性。将野桑蚕泛素基因片段与pGEX-4T-2连接,构建原核表达载体pGEX-4T-2/ubi,重组载体转化大肠杆菌BL21后在37℃及30℃的培养条件下,泛素基因得到高效表达。     

野桑蚕乙酰胆碱酯酶1型基因(Bmmace1)5′端非翻译区序列的剪切方式分析

通过5′cDNA末端快速扩增(RACE)的方法,克隆了野桑蚕乙酰胆碱酯酶1型基因(Bmmace1)的cDNA 5′端非翻译区序列(5′UTR)区域,与家蚕乙酰胆碱酯酶1型基因(Bmace1)的cDNA 5′UTR(242个碱基)进行比较分析表明,Bmmace1的5′UTR包含有231个碱基,存在2个位点的点突变和一段连续11个碱基的缺失。通过克隆和测序分析野桑蚕基因组中Bmmace1的5′UTR片段,表明Bmmace1和Bmace1基因的RNA剪切都遵循GT-AG规则,但在其cDNA 5′UTR的RNA剪接过程中可能存在差异,Bmmace1在其cDNA上游+33处存在比Bmace1少剪接的序列TGATTTGAAGG,而在其基因组中5′UTR的TGATTTGAAGG序列下游-4位点缺失ACAGA序列。研究结果可为深入探讨Bmmace1基因与野桑蚕产生抗药性的关系提供基础信息。     

野桑蚕谷胱甘肽S-转移酶基因BmmGSTs1的克隆与表达分析

谷胱甘肽S-转移酶(GST)在昆虫对外源物质的解毒代谢中起重要作用。克隆野桑蚕的BmmGSTs1基因,获得了cDNA序列,BmmGSTs1的开放阅读框长度为621 bp,编码206个氨基酸,推导蛋白质分子质量为23.53 kD,理论等电点为6.36。野桑蚕与家蚕的GSTs1氨基酸序列相似度最高,为99.51%。通过qRT-PCR方法测定BmmGSTs1基因在野桑蚕幼虫各组织的转录水平,结果显示该基因在脂肪体、中肠和马氏管的表达量较高,而在丝腺、表皮和血淋巴的表达量相对较低。与正常对照组相比,野桑蚕添食微量氰戊菊酯农药后24 h、48 h,脂肪体和中肠组织BmmGSTs1基因的转录水平均显著上调,推测BmmGSTs1基因表达上调可能与野桑蚕对氰戊菊酯的耐受性有关。上述结果为进一步研究BmmGSTs1基因的功能及其在野桑蚕耐农药中的作用奠定了基础。     

野桑蚕乙酰胆碱酯酶1型基因（Bmmacel）5′端非翻译区序列的剪切方式分析

通过5′cDNA末端快速扩增（RACE）的方法,克隆了野桑蚕乙酰胆碱酯酶1型基因（Bmmacel）的cDNA5′端非翻译区序列（5′UTR）区域,与家蚕乙酰胆碱酯酶1型基因（Bmacel）的cDNA 5′UTR（242个碱基）进行比较分析表明,Bmmacel的5′UTR包含有231个碱基,存在2个位点的点突变和一段连续11个碱基的缺失。通过克隆和测序分析野桑蚕基因组中Bmmacel的5′UTR片段,表明Bmmacel和Bmacel基因的RNA剪切都遵循GT-AG规则,但在其cDNA5′UTR的RNA剪接过程中可能存在差异,Bmmacel在其cDNA上游＋33处存在比Bmacel少剪接的序列TGATTTGAAGG,而在其基因组中5′UTR的TGATTTGAAGG序列下游-4位点缺失ACAGA序列。研究结果可为深入探讨Bmmacel基因与野桑蚕产生抗药性的关系提供基础信息。     

野桑蚕脑组织cDNA文库的构建及化学感受蛋白基因(CSP3)的克隆和序列分析

利用TAKARA公司生产的cDNA Library Construction Kit构建了野桑蚕脑组织的cDNA文库,经鉴定文库的滴度达3.5×105pfu/mL,文库插入片段的平均大小为1.2kb。从文库的测序结果中获得野桑蚕化学感受蛋白基因(CSP3)完整的开放阅读框(登录号:EU439267)并对其进行了序列分析。结果表明:该基因读码框由384个核苷酸组成,编码127个氨基酸,分子质量为14.6kD。通过对该基因编码的氨基酸和其它17种昆虫的CSP编码的氨基酸进行进化分析,发现该基因与家蚕CSP3的同源性最高,达96.85%。该基因的发现对于研究家蚕和野桑蚕对化学农药的敏感性差异具有重要意义。     

野桑蚕铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆分析与原核表达

超氧化物歧化酶是野桑蚕保护酶体系的重要酶类。利用RT-PCR方法克隆出野桑蚕铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)cDNA(EMB I登陆号:AM410997),其开放阅读框ORF长465 bp,编码154个氨基酸。同源性及系统进化分析表明,推导出的氨基酸序列与3种果蝇的同源性平均为69.3%,与线虫为57%,各物种中与Cu/Zn结合的残基高度保守。利用ExPASy的ScanProsite以及PSort和TMpred对此编码的蛋白质结构和功能域分析,预测出其具有2段Cu/Zn-SOD特异序列,且该蛋白不存在信号肽以及跨膜区。将Cu/Zn-SOD cDNA克隆到pET-28 a(+)表达载体,测序鉴定后以IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定其表达的融合蛋白质分子量为19.4 kD。     

野桑蚕肌球蛋白轻链2基因(MLC2)的克隆和序列分析

利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了野桑蚕间接飞行肌(in-direct flight muscle,IFM)的肌球蛋白轻链2(myosin light chain2,MLC2)基因(GenBank登录号:EU332913),其cDNA序列全长979 bp,包括63 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)、603 bp的开放读码框(ORF)、终止密码子TAA和310bp的3′端非翻译区序列(3′-UTR)。克隆该基因的内含子序列并分析基因结构表明,该基因包括3个外显子和2个内含子,编码201个氨基酸,预测蛋白质分子质量约22.0 kD,等电点4.67。用在线软件SMART分析显示,野桑蚕MLC2蛋白有2个Ca2+结合基序(EFh)结构域,可以结合Ca2+,属于肌钙蛋白C超家族成员,并且含有保守的可以磷酸化的氨基酸残基,有可能具有磷酸化过程,参与肌动球蛋白ATPase活性的调节。     

家蚕和野桑蚕酚氧化酶原基因的组织表达差异比较

酚氧化酶在昆虫体液免疫反应中起着非常重要的作用。根据GenBank中登录的家蚕和野桑蚕酚氧化酶原基因cDNA序列设计特异引物,用半定量RT-PCR方法检测了家蚕和野桑蚕各组织中酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)的表达谱,发现该基因在家蚕和野桑蚕组织中的表达差异较大,且具有明显的组织特异性。家蚕PPO1基因只在血液中被检出有很高的表达,而野桑蚕PPO1基因在血液和头部中均有表达,且在血液中的表达量最高;PPO2基因在家蚕组织中的表达量从高至低顺序为血液、脂肪体、卵巢、头部、表皮、精巢、中肠和丝腺,而在野桑蚕组织中的表达量从高至低顺序为血液、头部、中肠、表皮、精巢、卵巢和脂肪体,在丝腺中没有被检出有表达。推测可能是由于起源于野桑蚕的家蚕在长期的驯化及人工选择过程中引起了酚氧化酶原基因功能的变化。     

野桑蚕抗性基因P450 cDNA片段的克隆

本实验在对野桑蚕添食NaF的基础上,提取其总RNA,利用特异性引物,通过砌RT-PCR方法,获得了野蚕P450基因的cDNA,经克隆和序列测定,得到了野蚕P450基因片段的序列,经与家蚕P450基因比较分析,两者的同源性达99％。     

中国野桑蚕滞育激素基因的克隆与序列分析

根据家蚕DH PBAN基因序列设计特异引物 ,以中国野桑蚕基因组DNA为模板进行PCR扩增 ,获得了1 5 85kb的目的片段 ,将其克隆进pMD18 T载体 ,测序和同源性比较结果表明 :该片段由 3个外显子、2个内含子组成 ,2个内含子均为典型的GT AG结构 :该片段编码中国野桑蚕滞育激素 (DH)及DH引导肽 ;中国野桑蚕DH及引导肽与家蚕及日本野桑蚕的DH及引导肽氨基酸序列完全相同 ,其基因cDNA序列的同源性分别为 99 3%、97 2 %。研究结果进一步显示了中国野桑蚕与家蚕之间的近缘关系。     

野桑蚕多酚氧化酶的部分生化特性分析

基于开发专一的酶抑制剂控制野桑蚕危害桑园的目的,采用硫酸铵分级沉淀及Sephadex G-100凝胶过滤等方法,纯化了野桑蚕(Bom byx mandarina)多酚氧化酶,纯化倍数为57.14倍。该酶对焦性没食子酸、邻苯二酚和L-多巴的米氏常数(Km)值分别为3.39、2.06和3.17 mmol/L,在pH 7.0、37℃时活性最高。利用硫脲、抗坏血酸等多种氧化酶抑制剂对该酶活性的抑制结果表明,所用抑制剂对其均有不同程度的抑制作用。此外,该酶对乙二胺四乙酸(EDTA)和金属离子比较敏感。     

中国野桑蚕和日本野桑蚕的RAPD研究

用RAPD PCR技术初步研究了中国野桑蚕与日本福冈野桑蚕之间的DNA多态性。结果表明 ,不同地域中国野桑蚕个体之间及其与日本福冈野桑蚕个体之间均呈现出丰富的DNA多态性。中国野桑蚕同家蚕共有带率达 3 5 5 % ,同日本福冈野桑蚕为 4 5 1% ,而日本福冈野桑蚕同家蚕为 3 2 % ;中国野桑蚕与家蚕的平均遗传距离为0 5 2 ,日本野桑蚕与家蚕的平均遗传距离为 0 6 3,与中国野桑蚕的为 0 5 8,而且与中国沈阳地区野桑蚕之间的遗传距离最近 ,为 0 4 8,以此创建了它们的系统进化树。     

野桑蚕性信息素结合蛋白(PBP)亚家族基因的克隆与进化分析

蛾类的性信息素信号传递是研究昆虫化学通讯的模型,性信息素结合蛋白(pheromone-binding protein,PBP)亚家族是研究热点之一。克隆了野桑蚕PBP亚家族的3个基因,命名为pbp1、pbp2、pbp3(GenBank登录号:GQ246497、GQ468569、GQ468570)。分析野桑蚕和家蚕pbp基因的编码区,发现碱基突变主要以转换为主(14/18),氨基酸变异主要为同义突变(16/18),成熟蛋白质的理化性质变化小,二级结构无变化,推测野桑蚕向家蚕的进化过程中PBP亚家族的基因功能没有变化。对具有PBP亚家族3个已知基因的6个昆虫物种进行氨基酸遗传距离和同源性分析,结果表明野桑蚕和家蚕间PBP1、PBP2、PBP3的遗传距离分别为0、0.02、0,同源性分别高达100%、98.6%和100%,物种间基因的进化速率很慢,进化分析显示PBP亚家族在这几个物种分化前已经产生。