鸡神经肽Y（NPY）基因在毕赤酵母中的表达

为通过毕赤酵母的表达获得鸡NPY蛋白,根据GenBank上的鸡NPY基因序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性合成编码鸡NPY蛋白的基因,将其插入真核表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-NPY,并将重组质粒电转入毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母菌GS115/pPICZαA-NPY,用终浓度为1%的甲醇诱导表达阳性转化菌,用Tricine-SDS-PAGE和Western Blot检测表达蛋白。结果成功构建表达载体pPICZαA-NPY,转化后的重组酵母菌成功分泌鸡NPY蛋白,获得分子量约为35 kDa的鸡NPY蛋白。     

棉铃虫葡萄糖氧化酶HaGOX在毕赤酵母中的重组表达和性质研究

毕赤酵母是使用最广泛、最具有发展前景的异源蛋白表达系统之一。在毕赤酵母GS115中实现了来源于棉铃虫(Helicoverpa armigera)葡萄糖氧化酶基因hagox的异源表达。以棉铃虫hagox基因连接pPICZαA质粒构建重组表达载体,电击转化毕赤酵母GS115H菌株后得到含有hagox基因的重组酵母菌株。通过平板显色、酶活力测定和SDS-PAGE分析,重组酵母中HaGOX成功表达。HaGOX含606个氨基酸,理论分子量66.9 kD,预测等电点pH 4.78。经测试重组HaGOX的最适pH为6.0～7.0,最适温度为40℃,对6-脱氧-葡萄糖和D-葡萄糖具有高催化活力,以D-葡萄糖为底物的比活力为13.63 U·mg~(-1),对其他吡喃糖和二糖没有催化活力。     

猪视黄醇结合蛋白在毕赤酵母中的表达及检测

采用RT-PCR技术从猪的肝脏中扩增到RBP基因,将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC重组构建了重组表达载体pPICZαC-RBP,测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌GS115,经ZeocinTM抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达,Western Blot分析结果表明,诱导表达的培养上清液中表达出具有生物活性的RBP重组蛋白。     

捻转血矛线虫H11基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

将捻转血矛线虫H11基因亚克隆到酵母表达载体pPICZαB后,用氯化锂法转化巴斯德毕赤酵母菌株X-33,通过含ZeocineTM抗生素的YPD平板筛选出72个重组子.重组酵母用甲醇诱导后,经RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot检测,结果表明捻转血矛线虫H11在巴斯德毕赤酵母中实现了表达.     

来航鸡FOXL2基因的真核表达及纯化

【目的】对来航鸡FOXL2基因进行真核表达及纯化,为其生物学功能研究奠定基础。【方法】根据GenBank已发表的来航鸡FOXL2基因序列(GenBank登录号:JF_708868.1)设计引物,以来航鸡全血DNA为模板,PCR扩增FOXL2基因,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后定向克隆于pPICZαA中,获得pPICZαA-FOXL2真核表达载体。将pPICZαA-FOXL2转化毕赤酵母菌GS115,用甲醇进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测。【结果】克隆了918bp的FOXL2基因;成功构建了pPICZαA-FOXL2真核表达载体;实现了FOXL2基因在毕赤酵母菌GS115中的融合表达,获得了分子质量约为37ku的重组蛋白FOXL2,经Western blotting检测其具有较好的生物学活性。【结论】成功地在毕赤酵母中表达了来航鸡FOXL2基因。     

捻转血矛线虫H11基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

将捻转血矛线虫H11基因亚克隆到酵母表达载体pPICZαB后，用氯化锂法转化巴斯德毕赤酵母菌株X-33，通过含Zeocine^TM抗生素的YPD平板筛选出72个重组子。重组酵母用甲醇诱导后，经RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot检测，结果表明捻转血矛线虫H11在巴斯德毕赤酵母中实现了表达。     

在毕赤酵母中表达人溶菌酶蛋白的研究

将化学合成的人溶菌酶基因htYZ（444bp）构建到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ上;载体质粒用SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母菌株GS115,在含Zeocin的抗性培养基筛选后PCR鉴定获得了9株重组菌株。重组菌株经甲醇诱导后取表达上清液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,重组hLYZ在毕赤酵母中成功表达,在诱导60h时表达量最高。用镍亲和层析柱纯化重组hLYZ,用Bradford法测得其含量约为324mg·L^-1。比浊法活性测定结果显示所表达的重组人溶菌酶活性达到4473U·mL^-1。本研究利用毕赤酵母分泌型表达载体成功表达了重组人溶菌酶,井探索了简单有效的纯化和活性测定方法,为利用毕赤酵母系统规模化生产重组人溶菌酶奠定了技术基础。     

基于重组毕赤酵母的鳜鱼β-防御素生物合成及其抑菌活性

鳜鱼β-防御素(Siniperca chuatsiβ-defensin,ScBD)多肽链由N端的信号肽和C端的成熟肽组成,通过构建产鳜鱼β-防御素的毕赤酵母重组菌株,以解决天然免疫小分子抗菌肽的来源问题。通过RT-PCR从鳜鱼脾脏中分离编码β-防御素成熟肽的基因ScBD,将其与表达载体pPICZαA连接后构建重组表达载体pPICZαA-ScBD并转入毕赤酵母X-33;通过含高浓度博来霉素的YPD平板筛选阳性转化子后,于28℃、250 r/min和pH 6.0的条件下,使用1%甲醇诱导表达96 h;经镍离子亲和层析对重组毕赤酵母菌株的产物进行纯化,并对纯化产物进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定;通过平板涂布法和浊度法检测该重组菌株产物的抑菌活性。结果表明:基于质谱分析的一级结构鉴定证明纯化产物为分子量6.35 ku的预期重组ScBD;抑菌实验显示重组菌株产物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的抑制率分别为94.34%、86.97%和85.92%。本文构建的重组毕赤酵母菌株能有效合成具有生物学活性的重组ScBD,为鱼类来源天然小分子抗菌肽的进一步开发提供了技术途径。     

昆虫抗真菌肽基因的分泌型表达及活性鉴定

 【目的】黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)抗真菌肽Drosomycin (Drs)及其同系物Drosomycin-like C (Drs-lC)和斑腹刺螠蝽(Podisus maculiverntris)抗真菌肽Thanatin对丝状真菌具有广谱高效的抑杀作用。实现抗真菌肽基因在酵母中的高效分泌型表达，对探讨利用转基因酵母的发酵液直接进行果蔬、食品和农产品防腐保鲜的生物技术研发有重要意义。【方法】将Drosomycin基因（Drs）及其同系物基因Drs-lC和Thanatin基因分别与酵母分泌型表达载体pPICZαA重组，构建成重组表达质粒pPICZαA-Drs、pPICZαA-Drs-lC和pPICZαA–Thanatin。利用电转化将重组质粒转化毕赤酵母GS115，经表型筛选和PCR鉴定获得的重组毕赤酵母转化子，在甲醇诱导下进行抗真菌肽的分泌表达。【结果】3种抗真菌肽基因的酵母表达产物对6个供试真菌中的5个有明显的抑制作用，Thanatin同时对供试细菌有抗菌活性。【结论】Drs、Drs-lC和Thanatin抗真菌肽基因成功地转化毕赤酵母，并实现其分泌型表达。     

重组菌丝霉素在毕赤酵母中的分泌表达及活性研究

为获得一种能分泌菌丝霉素的毕赤酵母菌并探讨菌丝霉素的活性,将优化的目的蛋白碱基序列与标签MBP基因序列融合,通过双酶切将重组基因序列插入到毕赤酵母pGAPZaA表达载体上并进行连接反应。取10μL连接产物转化至感受态细胞,挑取含Zeocin(25 mg/L)平板筛选出的单菌落进行PCR鉴定,将阳性克隆送往测序公司测序。对鉴定正确的含有重组质粒的大肠杆菌DH5α进行活化培养并提取其质粒,得到的重组质粒进一步线性化和纯化,并电转入GS115感受态细胞中筛选出阳性克隆,诱导分泌蛋白,对其进行Western blot检测、纯化、活性分析和质谱鉴定,得到的重组蛋白为55 Ku左右,浓度为700 mg/L,纯度达到80%以上。质谱鉴定结果表明,蛋白序列的覆盖率达到98%,纯化后的蛋白也对金黄色葡萄球菌具有抑制作用,成功构建出一株能够分泌菌丝霉素的毕赤酵母菌,这为菌丝霉素的工业化生产和研发新型绿色的饲料添加剂奠定了基础。     

新城疫病毒HN蛋白的酵母表达及其活性鉴定

为了制备新城疫病毒(NDV)HN蛋白并研究其免疫原性,将优化的HN基因胞外区插入毕赤酵母表达载体pPICZαA中,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-HN,并将其电转入毕赤酵母X-33感受态中,经PCR鉴定得到阳性转化子,甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot鉴定筛选出目的蛋白表达菌株;通过对诱导剂含量、诱导时间、培养基初始pH值和诱导温度进行优化,研究最佳表达条件;采用镍柱亲和层析对目的蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA对目的蛋白进行鉴定;利用去糖基化酶PNGase F对目的蛋白进行处理,验证其糖基化修饰程度。结果显示,HN重组蛋白在毕赤酵母中成功表达,且在28℃条件下,培养基初始pH值为7.0,用0.5%甲醇诱导5 d,蛋白质表达量最高;通过镍柱亲和层析可获得纯度高于90%的重组蛋白;间接ELISA结果表明,重组蛋白活性良好;去糖基化试验验证了重组蛋白存在糖基化修饰。综上,利用毕赤酵母X-33成功表达了HN蛋白,且纯化产物纯度较高、活性良好,具有糖基化修饰。     

丹毒丝菌SpaA基因免疫保护区的克隆及其在毕赤酵母中的表达

【目的】以毕赤酵母Pichia pastoris X-33为宿主表达猪丹毒丝菌Erysipelothrix rhusiopathiae Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.【方法】以采集于广东某猪场的猪丹毒丝菌为模板,根据NCBI中已发表的Spa基因c DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增得到Spa A-N,并将其连接到表达载体p PICZαC上,得到重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N;用Sac I酶将重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N线性化后电转化入毕赤酵母X-33,经含博来霉素ZencinTM抗性的YPDS平板筛选和PCR鉴定的阳性转化子,用含不同浓度博来霉素抗性的YPDS平板筛选出高拷贝子并进行甲醇诱导培养,分别于诱导48、72、96 h后离心收集上清液,立即做SDS-PAGE,并进行SDS-PAGE及Western-blot试验.【结果和结论】成功克隆并表达了Spa A-N基因,构建了重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N,并以毕赤酵母X-33为宿主成功表达了猪丹毒丝菌Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.丹毒丝菌Spa A-N作为免疫保护区在酵母宿主中得以成功表达.     

猪α干扰素基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达

根据毕赤酵母Pichia pastoris表达系统对于密码子的偏嗜性,将去除信号肽的猪α干扰素(PoIFN-α)基因重新设计改造并合成一段新的核苷酸序列,置于毕赤酵母菌α因子分泌信号的DNA序列后,构建成pPICZαC-PoIFN-α分泌型重组表达载体,电转化进入野生型毕赤酵母菌X-33中,经ZeocinTM抗性筛选后...     

猪α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达

利用PCR技术从长白猪全血基因组DNA中扩增出猪α干扰素的成熟肽(mPoIFN-α)基因,并将其亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母(Pichia pastoris)-大肠杆菌(Escherichia coli)穿梭质粒pPIC9K载体中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFN-α。将SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFN-α电转化毕赤酵母GS115株(组氨酸缺陷型),使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组。转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以G418抗性梯度法筛选多拷贝重组子。该多拷贝菌株经1%甲醇诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明,猪α干扰素在毕赤酵母中成功地获得了分泌表达,并具有免疫活性,表达产物约为19kD,这为进一步研究猪α干扰素的功能奠定了基础。     

人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及体外抑菌活性研究

对重组人溶菌酶真核表达载体的构建筛选、表达与活性鉴定,经过双酶切和测序鉴定表明,重组载体正确。电转化毕赤酵母GWDL菌株,通过G418抗性平板筛选得到高表达高效价菌株,经诱导表达,检测蛋白含量,体外抑菌检测,表达产物15 ku和预期结果一致,筛选得到效价为1 907 U/mL,编号为SMD1168-pPIC9k-HLZ的高效价菌株;采用重组人溶菌酶制剂,检测样品GWDL对5种菌的最小抑菌浓度(MIC),藤黄微球菌的最小抑菌浓度较好,表明重组人溶菌酶在毕赤酵母中成功表达,活性较为稳定。     

鸡α-干扰素在毕赤酵母中的表达及其表达条件优化

选择毕赤酵母表达系统,根据酵母密码子偏爱性合成Ch IFN-α成熟肽的基因序列,连接至载体p PIC9K中,构建重组质粒p PIC9K-α,将重组载体酶切线性后克隆至毕赤酵母GS115,筛选高拷贝转化子及其甲醇利用型,对其表达条件进行优化。结果表明:鸡α-干扰素在毕赤酵母中成功表达,在含2%酸水解酪蛋白,经0.5%甲醇在28℃诱导表达72 h后,重组蛋白表达量最多,抗病毒活性最高。     

鸡源抗菌肽Folicidin-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物学活性鉴定

【目的】研究鸡源重组抗菌肽Fowlicidin-3的生物学特性,并为重组抗菌肽在临床上的应用奠定基础。【方法】根据抗菌肽数据库中Fowlicidin-3的氨基酸序列,选用毕赤酵母的偏嗜密码子,设计抗菌肽的基因,通过SOE法合成得到全长为114bp的Fowlicidin-3基因。将Fowlicidin-3基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-F。将线性化重组表达载体pPICZα-A-F通过电击法转入毕赤酵母宿主菌X-33中,构建分泌型重组酵母表达菌株。【结果】获得分泌型重组酵母表达菌株,Fowlicidin-3多肽表达量达到170mg·L-1,对致病性大肠杆菌K99和鸡白痢沙门氏菌显示出较好的抑制活性,抑菌圈直径分别为1.9cm和2.2cm。优化表达条件结果显示,转接到BMMY培养基中(pH6.0),每24h补加2%甲醇,29℃培养72h后,Fowlicidin-3抗菌肽获得高效表达。【结论】成功构建分泌型重组酵母表达菌株,并获得了具备高效表达能力和较好生物学活性的抗菌肽。     

犬α1干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性研究

亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了CaIFN-α1在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE检测结果表明表达产物相对分子质量约为2.7×104,比其推导结果(约1.9×104)大,推测可能是发生了糖基化。酵母分泌表达的CaIFN-α1具有较高的抗病毒活性,约为1.45×106U·mL-1,蛋白含量约为96mg·L-1,比活性为1.49×107U·mg-1。重组CaIFN-α1的生物学活性具有较强的种属特异性,在犬肾细胞(MDCK)上具有很高的抗病毒活性,在鸡胚成纤维细胞上活性较低,而在猫肾细胞(F81)和牛肾细胞(MDBK)上几乎没有抗病毒活性。进一步研究发现,重组犬α1干扰素对犬瘟热病毒和伪狂犬病毒在犬肾细胞中的增殖具有显著抑制作用。     

内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达

将人溶菌酶、内含肽、弹性蛋白3个基因串联插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC-MIELYZ,经Pme I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达,以探讨内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达情况。结果表明:SDS-PAGE和Western blot证实表达的融合蛋白分子量正确,抑菌试验表明融合蛋白对微球菌具有良好的抑菌效果。说明融合基因在毕赤酵母中成功表达,为后继的纯化工作及新型毕赤酵母表达载体的构建奠定基础。     

猪白细胞介素2的毕赤酵母表达及活性测定

电转化重组pPICZαA-PoIL-2于巴斯德毕赤酵母X-33,经筛选、PCR鉴定,获得含PoIL-2成熟蛋白基因的重组酵母菌株,诱导表达后进行表达产物的SDS-PAGE鉴定,可产生相对分子质量约为18ku的表达产物。以MTT比色法测定,该重组PoIL-2具有对猪外周血淋巴细胞的生物学活性。