利用组成型表达载体pMG36e电转化乳酸乳球菌ML23的研究

为了探明乳酸菌电转化的最适条件,提高电转化效率,本试验以大肠杆菌-乳酸菌穿梭型质粒pMG36e为载体,以乳酸乳球菌ML23为受体,利用电转化方法研究了受体菌株的生长状态与细胞壁处理方式、质粒浓度、电场强度、复苏培养基组成与复苏培养时间、受体菌株的限制修饰作用对电转化效率的影响。结果表明:含2%甘氨酸和0.5 mol/L蔗糖的MRS培养基培养至对数生长中期的细胞,在电场强度11.0 kV/cm、电阻200Ω、电容25μF下电击转化,转化后细胞在SMRS培养基中培养2 h,获得了较高的电转化效率。采用受体菌株修饰的质粒进行电转化,转化效率又提高了15倍以上,达1.05×105CFU/μg DNA。     

苜蓿中华根瘤菌电转条件的优化

为了研究苜蓿中华根瘤菌电转化的条件,通过对不同的细胞生长周期、复苏缓冲液、电转缓冲液、电场强度和电阻对电转率影响程度来作出变化曲线,以确定电转化的最优条件,从而提高苜蓿中华根瘤菌电转化率.结果表明细胞的对数生长初期、复苏缓冲液Ⅴ、电转缓冲液Ⅳ、23 kv/cm和200Ω适合作为苜蓿中华根瘤菌电转的条件.     

大肠杆菌DH5a菌株高效电击转化条件的优化

为探索大肠杆菌DH5a高效电击转化条件，通过对电击转化条件中细胞生长状态、DNA加入量、感受态细胞体积、电场强度、速冻和恢复时间等关键因素进行优化，筛选出大肠杆菌DH5a高效电击转化条件。结果表明：大肠杆菌在细胞生长状态OD₆₀₀值为0.6时制备感受态细胞，按每管50μL体积分装、-80℃乙醇速冻后，加入10 pg pUC 19质粒DNA,在20 kv·cm^-1电场强度、电容25μF、电阻200Ω条件下电击转化，转化后恢复培养60 min,转化效率达10¹⁰ cfu·μg^-1 DNA以上水平，可满足基因文库构建、抗体库筛选等试验需求。     

罗伊乳酸杆菌高效电转化方法的建立

【目的】建立野生型罗伊乳酸杆菌的高效电转化方法,为乳酸杆菌工程菌的研究提供参考。【方法】采用醋酸锂(LiAc)和二硫苏糖醇(DTT)对不同浓度(0.5×109,1.0×109,2.5×109,5.0×109,10.0×109 mL-1)的罗伊乳酸杆菌分别预处理0,10,20,30min,制备罗伊乳酸杆菌感受态细胞,用于电转化,采用PCR和EcoRⅠ酶切鉴定阳性转化子,建立罗伊乳酸杆菌高效电转化方法。【结果】罗伊乳酸杆菌转化效率随LiAc和DTT处理时间的延长和细胞密度的升高而提高,在本试验条件下罗伊乳酸杆菌电转化的最佳菌体浓度为10.0×109 mL-1,LiAc和DTT的最佳处理时间为20min,在该条件下转化效率达(32.60±7.12)×107 cfu/μg,比未经LiAc和DTT处理的细胞转化效率高104倍以上。【结论】建立了罗伊乳酸杆菌高效电转化方法,电转化的最佳菌体浓度为10.0×109 mL-1,LiAc和DTT的最佳处理时间为20min。     

脆壁克鲁维酵母基因置换技术的建立

以中性乳糖酶生产菌脆壁克鲁维酵母为材料,构建以kan基因为筛选标记、以脆壁克鲁维酵母乳糖酶基因上游调控区为同源臂的质粒pPkan。将质粒pPkan电击转化脆壁克鲁维酵母,对受体菌生长时期、电场强度、电击后培养时间等条件进行优化。结果表明,以OD600为0.8的脆壁克鲁维酵母为受体、电压1.5 kV、电场强度为7.5 kV.cm-1、电击后培养时间为90 min,可获得较高的转化率,最高转化效率为2.37×102转化子.μgDNA。在电击转化的同时加入限制性内切酶10μL,对电击转化的转化率无显著影响。经PCR筛选证实87.5%的转化子为同源重组,从而建立一套有效的脆壁克鲁维酵母基因置换技术。     

外源DNA导入酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)2.558电转化条件的研究

[目的]探讨外源DNA导入酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)2.558的电转化条件,初步确立提高其转化效率的方法。[方法]通过调整电转化的参数,将已构建好的转化载体转化至酿酒酵母2.558的感受态细胞中,对影响电转化的主要因素进行研究。[结果]采用对数生长中期菌体制备的感受态细胞,在质粒DNA加入量为1μg、电场强度为1.8 kV/cm、电阻为225Ω、用复苏缓冲液Ⅱ进行复苏培养的条件下,电转化效率达到最大值。[结论]该研究确定了酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)2.558的最优电转化条件,为其遗传改造奠定了良好的技术基础。     

海栖热袍菌电转化技术的研究(英文)

[目的]对海栖热袍菌电转化技术进行研究。[方法]采用不同参数即不同的方型电脉冲参数、指数衰退型电脉冲参数和高电压电击参数对海栖热袍菌感受态细胞进行电转化,得到的转化子进行PCR验证。[结果]试验中发现以150V的低压方形电脉冲,室温厌氧条件下电击25ms、1次,有利于T.maritima MS8的转化,但这种以整合质粒进行的转化效率极低。[结论]为提高T.maritima MS8的基因转化效率奠定了基础。     

海栖热袍菌电转化技术的研究

[目的]对海栖热袍菌电转化技术进行研究。[方法]采用不同参数即不同的方型电脉冲参数、指数衰退型电脉冲参数和高电压电击参数对海栖热袍菌感受态细胞进行电转化,得到的转化子进行PCR验证。[结果]试验中发现以150 V的低压方形电脉冲,室温厌氧条件下电击25 ms、1次,有利于T.maritima MS8的转化,但这种以整合质粒进行的转化效率极低。[结论]为提高T.maritima MS8的基因转化效率奠定了基础。     

一步法制备大肠杆菌BL21(DE3)菌株感受态细胞及转化条件优化

大肠杆菌BL21(DE3)菌株是大肠杆菌表达系统最常用的宿主菌株,因此人们需要1种便捷有效的感受态细胞制备和转化方法。一步法感受态细胞制备操作方便,只加1种试剂即可,更快捷稳定,转化也更方便,不需要热激。研究大肠杆菌感受态细胞一步法制备对BL21菌株的适用性,并对转化过程中的关键参数进行探索和优化。结果表明,该一步法制备的BL21菌株感受态细胞可获得106CFU/μg DNA转化效率,完全能够满足常规转化要求。转化过程中相关参数的最佳条件为冰水浴30 min,室温放置10 min,37℃、150 r/min振荡复苏40 min。     

大肠杆菌感受态细胞转化能力影响因素的研究

探讨了大肠杆菌生长状态、转化溶液浓度、保存温度、冰上放置时间对感受态细胞转化能力的影响.结果表明,以100 mmol/L CaCl2为缓冲液,采用经活化培养的A6000.56的大肠杆菌JM109制备的感受态细胞,在冰上放置6h后转化,所得转化率最高.若感受态细胞要保存备用,液氮保存最好,其次-70℃,添加20%甘油利于冷冻保存,但添加保护剂对转化率有抑制作用.     

应用正交试验法优选茎瘤芥高效遗传转化体系

[目的]建立茎瘤芥高效遗传转化体系,为茎瘤芥及芸薹属植物遗传转化奠定基础。[方法]应用正交试验法研究茎瘤芥遗传转化过程中预培养时间、共培养时间、侵染液浓度、侵染时间、对转化率的影响。[结果]最适合茎瘤芥CRY2基因RNAi载体遗传转化的条件为预培养3 d、共培养4 d、侵染液浓度OD600=0.5、侵染10 min,此时Kana选择压为30 mg/L。[结论]优选出了农杆菌转化的最宜条件,遗传转化率有较大提高。     

蝴蝶兰·文心兰遗传转化体系的初步研究

[目的]优化蝴蝶兰和文心兰的遗传转化条件。[方法]以培养3周的蝴蝶兰原球茎和文心兰愈伤组织为试材,以大肠杆菌为生长培养基,研究3种农杆菌菌株的侵染力,以及菌液浓度、侵染时间、酚类诱导物(AS)和共培养时间对转化的影响。[结果]以蝴蝶兰原球茎为农杆菌介导的外植体进行遗传转化的优化条件为:预培养时间3d,菌液侵染浓度OD600=0.3,菌液侵染时间10min,pH值5.4,菌液侵染后,与农杆菌共培养5d并添加100μmol/LAS,此条件下的瞬间表达率最高。将蝴蝶兰遗传转化的条件运用于文心兰,得到的转化率较低。3种农杆菌菌株中,EHA105菌株侵染力最强,其次是AGL1,LBA4404最弱。[结论]该研究为进一步研究蝴蝶兰和文心兰的遗传转化体系提供理论依据。     

生防假单胞菌FD6电击转化条件的优化

不同细菌电击转化效率各异,为筛选防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)FD6电击转化最佳条件,选取具卡那霉素抗性标记的质粒pBBR-rpoD,从电场强度、电击时间、质粒添加量、电击悬浮溶液和细菌生长阶段5个方面优化电击转化条件.结果表明:当细菌培养至D600nm值1.4左右时,在电场强度为12 kV·cm-1、电击时间为4 ms、质粒添加量为200 ng,并以1 mmol·L-1 HEPES作为电击悬浮溶液时转化效率最高,可达1.1×105转化子?μg-1(DNA).此外,HEPES浓度的改变并未对转化效率产生影响.这一研究建立了一套防御假单胞菌FD6的高效电击转化体系,为今后该菌株在分子水平上的遗传操作提供了重要参考.     

质粒导入不同种农杆菌冻融法的探讨

利用冻融法,使用不同的CaCl2浓度对不同细胞生长状态的农杆菌进行重组质粒导入的研究,以确定最适的导入条件.结果表明,菌体OD600值和不同的CaCl2浓度对转化有不同程度的影响.在OD600值为0.4时,液氮条件下用浓度为50mmol·L-1的CaCl2溶液对菌体进行处理得到的转化率最高.实验得到转化子,并通过菌落PCR技术鉴定.     

长期保存活力低下的大肠杆菌制备感受态细胞条件的优化

研究了Ca Cl2溶液处理方法、长期保存的原始菌种活化次数、离心条件对感受态细胞最终转化效率的影响,并分析其最佳转化效率参数、优化感受态制备和转化方法。结果发现:使用过滤处理的Ca Cl2比灭菌处理的Ca Cl2制备的感受态细胞转化效率高。在其他条件相同的情况下,长期保存的大肠杆菌菌种活化3次以上的转化率最高;制备感受态细胞第1次离心在4℃、4 000 g条件下离心15 min,第2次离心时在4℃、4 000 g条件下离心5 min得到的感受态细胞转化率最高。     

质粒导人不同种农杆菌冻融法的探讨

利用冻融法,使用不同的CaCl2浓度对不同细胞生长状态的农杆菌进行重组质粒导入的研究,以确定最适的导入条件。结果表明,菌体OD600值和不同的CaCl2浓度对转化有不同程度的影响。在OD600值为0.4时,液氮条件下用浓度为50mmol·L^-1的CaCl2溶液对菌体进行处理得到的转化率最高。实验得到转化子,并通过菌落PCR技术鉴定。     

杜氏盐藻新型遗传转化方法的建立(英文)

本研究采用LiAc/PEG介导法首次成功地将外源基因导入盐藻细胞,组织化学染色发现转基因盐藻为蓝色,表明外源的基因在盐藻细胞中得到了成功表达。同时还进行了生长状态、转化温度、质粒浓度等因素对转化率影响的研究,优化了转化条件。结果表明,盐藻处于对数生长早期、质粒DNA浓度为600μg/ml、转化温度29℃是最理想的转化条件,其转化率为74.8‰。PCR扩增和PCR-Southern杂交结果证明,目的基因已整合到基因组中,且能够遗传。     

高效JM109感受态细胞制备及转化条件的优化

采用不同的转化液制备大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞,并进行pUC18质粒的转化,考察细菌生长状态、转化液、转化的热激时间和转化后所用培养基对转化率的影响.结果表明,菌液A600nm为0.705时采用TB转化液制备感受态细胞,在42℃热激45 s,转化后采用SOC培养基振荡培养,转化效率最高,可达8.59×108 CFU/μg质粒.     

尾巨桉遗传转化体系研究

以尾巨桉(Eucalyptus urophylla×E.grandis)32-29无性系为研究对象,研究了不同农杆菌种类以及侵染时间因素对尾巨桉茎段和愈伤组织遗传转化的影响,探讨了适宜尾巨桉转化的卡那霉素和抑菌抗生素使用浓度。结果表明,茎段外植体较愈伤组织转化率高,侵染时间为4min。LBA4404转化效率高于EHA105,GUS检测转化率分别为80.7%、63.5%。适宜生长在50mg.L-1的卡那霉素4、00 mg.L-1头孢唑林钠的筛选培养基上。     

Hepa1-6细胞的最佳培养条件研究

[目的]探索Hepa1-6细胞的最佳培养条件。[方法]以小鼠Hepa1-6肝癌细胞为材料,采用正交试验设计研究RPMI1640和DMEM2种不同培养基及细胞接种密度、血清浓度、双抗浓度、D-Hanks漂洗次数、胰蛋白酶浓度和消化时间6个不同因素对Hepa1-6传代培养的影响;根据细胞在6个时间点的生长状况评分,筛选出Hepa1-6细胞的最佳培养条件。[结果]Hepa1-6细胞在含有20%血清的RPMI-1640培养基,接种密度为4×104个/cm2,100U/ml的双抗浓度,贴壁率在90%以上时,D-Hanks漂洗1次,0.5%胰蛋白酶消化2min,传代效果最好。[结论]通过正交设计筛选,为Hepa1-6细胞体外培养探索出最佳培养条件。