拟南芥转录因子CBF1基因的克隆与原核表达

CBF1转录激活因子与植物的抗逆密切相关,根据GenBank中拟南芥（Arabidopsis thaliana）CBF1（C-repeat/dre binding factor 1）基因的编码区设计1对特异引物,通过RT-PCR扩增出拟南芥CBF1基因,随后亚克隆到pMD18-T载体,测序、序列分析表明与拟南芥CBF1对应区域相似性为100%。将该片段亚克隆到原核表达载体pET22b（＋）中构建原核表达质粒,转化大肠杆菌ER2566,在IPTG诱导下产生CBF1蛋白,SDS-PAGE结果表明表达的蛋白约24ku,与预期一致。     

拟南芥bZIP23基因过量表达载体的构建及过表达植株的筛选

[目的]以拟南芥为材料克隆bZIP23基因,构建bZIP23基因的过量表达载体和筛选过表达植株,为验证其功能奠定基础.[方法]提取拟南芥总RNA和RT-PCR克隆bZIP23基因,用限制性内切酶切割和T4 DNA连接酶连接,使bZIP23基因连接到35S强启动子的pART27载体上;将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中,筛选阳性单克隆进行菌落PCR鉴定并测序验证,获得重组质粒.将该重组质粒电激转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,浸花法转化拟南芥野生型植株.[结果]通过单菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,bZIP23基因与35S过量表达载体已连接,获得了重组载体;抗性筛选与遗传鉴定获得相应的转基因过量表达阳性植株.[结论]构建的过量表达载体及筛选得到的过量表达植株为验证bZIP23基因功能奠定了基础.     

大豆GmF-box基因植物表达载体的构建及转化拟南芥

为了研究大豆(Glycine max)Gm F-box基因的功能,以含有Gm F-box基因全长c DNA序列的p JET1.2-Gm F-box质粒为模板,通过PCR扩增获得Gm F-box基因的c DNA序列,并将该基因构建到植物表达载体p EGAD中,构建了由Ca MV35S启动子驱动Gm F-box基因的植物表达载体p EGAD-Gm Fbox,利用冻融法转入农杆菌GV3101菌株,通过农杆菌浸染方法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)。通过除草剂筛选和PCR检测转基因拟南芥,初步证明已获得转大豆Gm F-box基因的拟南芥。     

拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达研究

[目的]研究拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达.[方法]构建XCD1原核表达载体,根据NCBI基因序列设计引物,并以PCR扩增得到大量目的片段XCD1,将XCD1连接到原核表达载体pET-32a＋,并对重组质粒进行测序鉴定,将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21（DE3）,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.IPTG诱导表达获得目的蛋白,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.[结果]XCD1序列全长为1 242bp,与PCR产物大小一致.蛋白XCD1-pET-32a＋较适表达条件为在30℃0.1 mmol/L的IPTG诱导1.5h.[结论]该结果为进一步蛋白纯化及酶活测定试验奠定了基础.     

拟南芥血红蛋白1（AtGLB1）超量表达载体和RNAi表达载体的构建及转化

为研究拟南芥血红蛋白1基因(AtGLB1)的功能,将AtGLB1基因构建入超表达载体pMD和RNAi载体pZYI中,并采用花序浸染法将重组质粒转化拟南芥Columbia得到了转基因植株。对超表达株系和RNAi株系的纯合体进行Northern分析,结果表明:超量表达的拟南芥株系中AtGLB1的表达水平比野生型高很多,而表达被抑制的RNAi株系中几乎检测不到AtGLB1基因的表达。这些AtGLB1表达水平不同的拟南芥株系的获得可为该基因功能的后续研究以及在农业生产中的应用奠定一定基础。     

紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

[目的]构建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表达载体。[方法]根据紫花苜蓿CONSTANS类似基因MsCOL1基因(登录号:DQ661682)序列,设计含有酶切位点的一对特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,获得MsCOL1基因完整编码区DNA序列,并将目的片段插入表达载体pBI121的相应位置,构建植物表达载体35S∷MsCOL1,再利用农杆菌介导方法将35S∷MsCOL1转化到拟南芥中。[结果]分析测序结果显示,所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆。经RT-PCR检测,证明转基因植株中MsCOL1基因能够顺利表达。[结论]该方法成功构建植物表达载体35S∷MsCOL1,并获得了转基因拟南芥植株。     

玉米ZmPti1基因表达载体的构建及遗传转化

Pti1基因在植物的抗病信号传导中起着非常重要的作用。为了研究玉米中一个类Pti1基因ZmPti1的功能,把ZmPti1的cDNA连接到植物表达载体pGreen0029中,通过农杆菌介导转入拟南芥中进行过量表达。PCR及Western-blot分析表明,ZmPti1已经转入到拟南芥中,并且在大多数转化植株中稳定表达。通过试验,为以后对ZmPti1的生物学功能验证打下基础。     

草莓FaAP1基因植物表达载体构建及在拟南芥中的超表达

为研究草莓AP1同源基因FaAP1的功能,构建了其植物表达载体pBI121-FaAP1,并导入到农杆菌菌株GV3101中。利用花序浸染法将该基因导入拟南芥,经抗性筛选、PCR检测表明获得了3个转化株系。结果显示,与对照相比,转基因株系明显早花,成花时间可提早10d以上;同时其营养生长受到抑制,植株个体矮小,莲座叶数目减少;在早花的同时,转化株系花器官异常,不能形成种子。表明草莓FaAP1基因参与了成花过程的调控。     

拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建

拟南芥氨基酸透性酶1(AAP1,也叫NAT1)是植物中第一个被分离的氨基酸转运蛋白,在拟南芥主根、侧根、根毛及根表皮细胞中均有增加氨基酸含量的作用。本研究利用RT-PCR的方法,从拟南芥中克隆了该基因,测序结果与GenBank(NM-104616.4)中已发表的拟南芥AAP1(AtAAP1)基因的同源性高达99.93%;并将AtAAP1基因与pCAMBIA3300构建p3300-AAP1植物表达载体,为过表达AtAAP1基因,提高作物氨基酸含量,从而改善作物氮素利用效率提供参考。     

油菜抗逆基因CBF1植物表达载体的构建及对拟南芥的转化

通过RT-PCR技术从油菜中克隆到抗逆相关基因CBF1,将其成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304,并通过农杆菌采用Floral dip法将重组表达载体转入拟南芥。经潮霉素抗性筛选和PCR检测,初步证明,油菜CBF1基因已经转入到拟南芥中。     

玉米蛋白激酶基因ZmASK1表达载体的构建及遗传转化

为了研究玉米蛋白激酶基因ZmASK1的功能,把ZmASK1的cDNA连接到植物表达栽体pGreen0029中,通过农杆菌介导转入拟南芥中进行过量表达.PCR和Western-blot分析表明,ZmASK1已经转入到拟南芥中,并且在大多数转化植株中稳定表达.通过本试验,为以后对ZmASK1的功能验证工作打下基础.     

拟南芥CBF1基因植物表达载体构建及其对野生蕉的遗传转化

从拟南芥中克隆CBF1基因,转入到植物表达载体pBI121的XbaI和SacI位点,得到中间重组质粒pBI121-CBF1,用EcoRI和HindⅢ将35S启动子与CBF1基因从pBI121-CBF1切下,转入到植物表达载体pCAMBIA1301中,构建植物表达载体p1301-CBF1.将构建的植物表达载体转入农杆菌E...     

玉米SNAC转录因子的基因结构特征与逆境调控预测

NAC蛋白是植物特有的转录因子,在植物发育和各种非生物逆境应答中发挥着重要作用。为更好地揭示玉米SNAC(stress-responsive NAM,ATAF1/2,CUC2)家族的耐逆境胁迫功能,对其基因的结构特征及可能的调控机理进行了预测。利用生物信息学方法,鉴定了玉米16个SNAC家族基因,并对该基因家族各编码蛋白的理化性质、基因结构、潜在的磷酸化位点、蛋白质二级结构、基因进化关系、基因组序列结构和启动子结合元件等信息进行分析。分析结果表明：玉米16个SNACs不具有跨膜结构,且均具有N-末端保守结构域和高度可变的C-末端结构域。系统发育分析表明,同一亚群中密切相关的成员具有相似的基因结构,推测在不同植物中会具有类似的耐逆功能。磷酸化位点分析表明,玉米SNAC家族存在着大量的磷酸化位点。二级结构预测表明,玉米SNAC的转录调控区具有高度的内在灵活性。启动子分析表明,玉米SNAC家族基因启动子区域均含有大量的逆境胁迫应答顺式作用元件。这些结果为玉米耐逆境研究提供了候选基因,对促进玉米SNAC家族功能分析的进展具有重要意义。     

拟南芥rd29A启动子的克隆及植物表达载体构建

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA为材料,根据Gen Bank中拟南芥rd29A启动子序列设计引物,采用PCR克隆一段长度为951 bp的rd29A启动子序列。采用Plant CARE启动子在线预测工具分析表明,rd29A启动子序列具有TATA-box、CAAT-box基本的顺式作用元件和1个脱落酸应答元件(ABRE)和2个脱水应答调控元件(DRE)。将rd29A启动子序列亚克隆到pcambia3301载体的多克隆位点,构建了由rd29A启动子驱动的植物表达载体。     

BcMF3反义基因植物表达载体的构建及其对拟南芥的遗传转化

根据编码白菜(Brassica rapa L. ssp. chinensis,syn B. campestris ssp. chinensis)果胶甲酯酶的BcMF3 基因cDNA 序列内部第1 343～1 797个碱基之间序列设计引物,从白菜花蕾cDNA中PCR扩增出455 bp的片段,把该片段作为反义基因连接至双元载体pBI12l上,得到了植物表达栽体pBI-B3,并用"三亲杂交"法导入农杆菌LBA4404菌株中,PCR扩增和酶切结果表明所构建的植物表达载体pBI-B3含有BcMF3 反义基因片断,并已导入了根癌农杆菌(Agrobacterinm tumefuciens)中;采用花序浸润法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)后,播种筛选浸润植株的种子获得了5 株卡那霉素抗性植株,PCR 扩增证明BcMF3反义片段成功整合到拟南芥基因组中;转基因拟南芥子代(T2)的抗性分离符合孟德尔分离比例,表明外源基因是单一位点插入.     

拟南芥DREB1A基因的克隆与植物表达载体构建

用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,序列分析发现,所克隆的DREB1A基因与已发表的DREB1A基因序列(AB007787)的同源性为99.69%.利用基因重组技术成功构建了植物表达栽体pBI121-DREB1A,为进一步利用DREB1A基因综合改良植物抗旱性奠定了基础.     

拟南芥SSP1基因GFP载体构建及GFP植株筛选

[目的]以野生型拟南芥为材料构建SSP1基因GFP载体及GFP转基因植株。[方法]通过提取野生型拟南芥的RNA,反转录成为c DNA,并以c DNA为模板,利用高保真酶,进行SSP1基因的克隆,将克隆所获得SSP1基因和p XB94-GFP质粒进行双酶切,利用T4-DNA ligase进行连接,并转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞中,通过菌落PCR和测序获得阳性单克隆。通过质粒抽提试剂盒提出构建好的重组质粒,并将其转入农杆菌GV3101中,通过菌落PCR鉴定出阳性单菌落。将获得的阳性菌通过花序浸染法转入野生型拟南芥中,并通过抗性筛选获得阳性植株。[结果]克隆SSP1基因成功,菌落PCR显示SSP1基因成功连接到p XB94-GFP质粒上并成功转入农杆菌中,抗性筛选获得了SSP1-GFP转基因植株。[结论]成功获得SSP1-GFP转基因植株,为接下来进一步研究SSP1基因功能奠定了基础。     

拟南芥WRI1基因的克隆及其植物反义载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了拟南芥WRI1基因,并将其克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了该基因全序列.结果表明,该基因全长为1 287 bp.将拟南芥WRI1基因反向克隆到植物表达载体pCambia1300的35S启动子下游,构建了该基因的植物反义表达载体.     

拟南芥PhrIP1基因超表达、GFP和RNAi载体的构建

根据编码拟南芥成膜素相关蛋白(PhrIP1)基因cDNA全序列设计超表达引物,以1～1000bp之间序列设计GFP引物和序列内部第24～240bp之间序列设计RNAi引物,以pMD18-T-PhrIP1为模板,用PCR方法分别扩增出1.8kb、1.0kb和0.216kb的片段,分别克隆至双元表达载体、GFP载体和RNAi载体上,得到了植物超表达载体pBI-PhrIP1、GFP载体pMON-GFP-PhrIP1和RNAi载体Hellsgate2-PhrIP1。用电转化法,将这些重组质粒导入农杆菌GV3101菌株中,PCR扩增结果表明所构建的植物超表达载体pBI-PhrIP1、GFP融合载体pMON-GFP-PhrIP1和RNAi载体Hellsgate2-PhrIP1已导入农杆菌。     

海岛棉GbTCP5基因沉默和过量表达载体的构建及拟南芥转化

海岛棉具有优良的纤维品质,TCP蛋白参与细胞生长和增殖调控,本研究构建海岛棉GbTCP5基因沉默和过量表达植物表达载体。以GbTCP5基因pGEM-T Easy-GbTCP5质粒为模板进行PCR扩增,并将该基因构建到植物表达载体pCAMBIA3301中,利用冻融法转入农杆菌GV3101菌株,通过农杆菌浸染法转化拟南芥植株,初步证明已获得转化海岛棉GbTCP5基因的拟南芥。利用重叠PCR方法替换拟南芥AtMIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRTCP5前体的植物表达载体amiRTCP5-pCAMBIA3301,为深入研究海岛棉GbTCP5基因的生物学功能奠定基础,为研究棉花纤维发育机制提供理论依据。