东北雅罗鱼微卫星分子标记的筛选及特征分析

通过磁珠富集法筛选东北雅罗鱼的微卫星分子标记.采用限制性内切酶Sau 3AI对东北雅罗鱼基因组DNA进行酶切,选取400～900 bp的片段进行PCR全基因组扩增,并利用生物素标记的(CAG)8、(TGA)8、(AGAT)6、(GATT)6 4个探针进行微卫星片段的富集.将得到的片段与T载体连接后转入DH5α大肠杆菌中...     

磁珠富集法筛选马尾松微卫星标记

将马尾松核基因组DNA用Sau3A Ⅰ酶切后,电泳回收300～1 000 bp片段.在回收的片段上连接接头PCR后与用生物素标记的微卫星探针(AC)15、(AG)15杂交运用磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段.将获得的序列通过PCR扩增后,连接pGEM-T载体,转化入感受态大肠杆菌,得到微卫星序列文库.然后用PCR法直接对文库进行扩增,获得58个阳性克隆,经测序分析,获微卫星序列33个,并成功设计出马尾松微卫星引物19对.     

基于ISSR和AFLP标记开发甜菜 SSR 引物的研究

本研究以ISSR-PCR和AFLP标记原理为基础,介绍一种新的分离甜菜基因组微卫星引物的方法。首先对甜菜基因组DNA进行酶切并连接已知序列的接头,构建基因组DNA酶切文库,同时用一个或两个ISSR引物,扩增文库中两端含微卫星序列片段并进行克隆测序,根据测序结果设计微卫星序列间的IP1引物和IP1与微卫星序列间IP2 引物;再根据侧翼序列克隆原理,采用巢式PCR进行基因组步移,扩增IP2引物下游序列,根据巢式PCR产物测序结果,设计微卫星序列另一侧的引物IP3 ,IP2和IP3即为SSR标记引物,对获得的SSR引物进行PCR验证,结果表明SSR引物产率为16%,本研究获得的SSR引物具有较高的多态性,对于后续的遗传多样性检测和遗传连锁图构建具有重要意义。     

甜叶菊微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选

甜叶菊是我国一种重要特种经济作物, 其分子标记相关遗传背景研究甚少。本研究基于生物素与链霉亲和素的强亲和性原理, 用链霉亲和素顺磁颗粒捕捉人工合成的标记有生物素的寡核苷酸探针(AG)₁₅, 间接筛选出含有甜叶菊基因组微卫星序列的DNA酶切片段, 将筛选得到的片段连接到pUC-T载体中, 构建甜叶菊微卫星序列的富集文库。挑取354个克隆进行菌落PCR检验, 从中筛选出158个阳性克隆进行测序。结果表明, 134个(84.81%)克隆中含有微卫星序列, 其中完美型85个(63.43%)、非完美型15个(11.19%)、复合型34个(25.38%)。根据微卫星序列共设计出71对微卫星引物, 其中62对能扩增出稳定的条带。利用24个甜叶菊品系对这62对引物的遗传多样性的分析表明, 有16个位点表现出多态性, 等位基因数为2~8个, 平均每个位点扩增得到4.5个等位基因, 多态性信息含量在0.3163~0.7595之间, 观测杂合度(H_o)与期望杂合度(H_e)的范围分别为0.2174~0.9167与0.3555~0.8076。通过聚类分析, 将甜叶菊分为大小叶两大类。本研究开发出的微卫星标记可为甜叶菊的分子遗传育种提供有效的遗传标记。     

基于ISSR和AFLP标记开发甜菜SSR引物

基于AFLP和ISSR标记原理,采用基因组步移技术,建立了一种新的分离甜菜基因组微卫星引物的方法。具体步骤为:(1)构建基因组DNA限制性内切酶文库,ISSR引物扩增文库中两端含微卫星序列的片段并进行克隆测序,根据测序结果设计微卫星序列间的引物IP1和IP2;(2)巢式PCR进行基因组步移,扩增IP2引物下游序列并测序,进而设计微卫星引物IP3,引物IP2和IP3即为SSR标记引物。对获得的SSR引物进行PCR验证,结果表明,SSR引物产率为16%,研究获得的SSR引物具有较高的多态性,对于后续的遗传多样性检测和遗传连锁图构建具有重要意义。     

用磁珠富集法分离亚麻基因组微卫星分子标记

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针(CT)₁₅与亚麻基因组DNA酶切片段杂交,捕获300~1 500 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD18-T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库。利用接头引物和根据微卫星核心序列设计的引物VRV(CT)₁₅使用PCR方法直接对文库筛选,从422个转化子中获得了104个阳性克隆,对其进行测序分析,获得了97个微卫星序列,微卫星序列的富集效率达到22.99%,PCR扩增筛选效率93.27%。对97个微卫星序列进行比对分析,其中51个重复序列的两端序列高度相似,据其设计的特异引物对阳性克隆进行2次筛选,能淘汰相似度高的同类序列,提高筛选亚麻微卫星标记的效率。     

黄花柳基因组微卫星分离及多态性位点检测

以生物素标记的(CT)15和(GT)15为探针进行杂交,借助磁珠筛选出含微卫星的Sau3A I酶切片段,构建了黄花柳微卫星富集文库,获得960个阳性克隆.随机挑选360个阳性克隆进行测序,发现含有微卫星的克隆比例达45%,最后获得的44条非同源性克隆中共含有53个微卫星位点,其中(TC/AG)n,(GA/CT)n,(CA/GT)n比例最高,占74%.随机选取其中的18个微卫星位点设计引物,用5个种个体混合DNA组成模板池,检测引物种间的多态性信息,初步筛选出5对引物在柳属种间有很好的通用性.说明微卫星富集法开发SSR标记不失为一种有效的方法.     

利用FIASCO技术进行波纹巴非蛤微卫星

为揭示波纹巴非蛤种质遗传特性、开发种质库,利用FIASCO(Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing Repeats)技术开展了其基因组微卫星标记的分离与筛选研究。基因组DNA经限制性内切酶Mse I 酶切后与接头连接,用生物素标记的(CA)15或(AAG)7探针与其杂交,然后用磁珠富集、洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增后形成双链,最后进行克隆转化,构建微卫星富集文库。挑选克隆用探针引物(CA)15或(AAG)7和载体引物进行PCR筛选,测序得到含有微卫星DNA的序列,根据序列设计和合成微卫星引物,进行引物适用性分析,并分析了湛江群体的遗传结构。结果表明,8对微卫星引物在湛江群体共检测到108个等位基因,每个位点等位基因数为5~19,期望杂合度为0.666~0.926,观测杂合度为0.400~0.882,4个位点(Pun4,Pun5,Pun6,Pun7)显著偏离哈迪-温伯格平衡(P<0.00625);PIC介于0.62~0.92,所有位点均属于高度多态位点(PIC>0.5)。说明FIASCO技术适合于波纹巴非蛤微卫星标记的分离与筛选,筛选得到的8个微卫星位点能用于波纹巴非蛤遗传多样性分析及野生群体与养殖群体的群体结构分析。     

首批海岛棉基因组来源的微卫星标记的分离、评价和定位

海岛棉(Gossypium barbadense)是世界上最重要的栽培棉种之一。海岛棉纤维品质优良,是优质棉的重要产源。为了研究海岛棉的遗传多样性,为海岛棉育种提供参考依据,从海岛棉遗传标准系中分离基因组来源的微卫星标记用于海岛棉遗传评价。采用两种方法分离微卫星标记,一是用ISSR (inter simple sequence repeat) 引物扩增Pima3-79,克隆测序后从中开发微卫星标记;二是利用简并引物扩增Pima3-79,克隆测序后从中开发微卫星标记。共挑选1 447个克隆,筛选出239个独立克隆。测序后得到214个单一序列,其中包含微卫星并可用于引物设计的序列70个,获得86对引物。86对引物用于扩增56个海岛棉材料和4个陆地棉材料,16对引物没有扩增,43对引物在所有材料中没有多态性;27对引物在海岛棉和陆地棉之间有多态性,19对引物在海岛棉中表现多态性。利用Jaccard相似系数和UPGMA方法进行聚类分析可以明显区分陆地棉和海岛棉,并且将海岛棉分为4类。14对引物在BC₁群体中表现多态性,产生14个位点。9个位点整合到BC₁连锁图的7个染色体上,4个位于A亚基因组,5个位于D亚基因组。海岛棉微卫星标记扩展了棉花微卫星标记,有助于海岛棉遗传多样性的研究,有利于棉花遗传图谱的进一步丰富。     

香椿(Toona sinensis)微卫星富集文库构建及特性分析

采用Dynal磁珠富集法构建了香椿微卫星富集文库,通过测序结果对文库的特性进行了分析。实验使用改良CTAB法提取香椿基因组DNA,用(AC)8、(AG)8和(ATG)123种带有生物素标记的探针与香椿基因组DNA的酶切片段进行杂交,将磁珠捕获的含有微卫星序列的DNA片段插入p MD 18-T载体,并转入感受态细胞Trans 5α构建克隆,经筛选后得到含356个克隆的香椿基因组微卫星富集文库。从富集文库中挑选插入片段长度为400~800 bp的128个克隆进行测序,其中含有SSR的序列77条,得率达60.16%,其中完美型占82.69%,非完美型8.65%,混合型8.65%。上述结果为SSR位点的进一步开发奠定了基础。     

地黄微卫星富集文库构建及特性分析

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针(AC)8,(AG)8和(ATG)12与地黄基因组DNA酶切片段杂交,捕获含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD 18-T栽体上,转入感受态细胞Trans 5 α,构建地黄富集微卫星文库.利用M13F和M13R载体序列引物筛选文库,对插入片段长度为400～ 800 bp的克隆进行测序.共获得96条序列,48条(50％)含有微卫星位点,其中完美型占66％,非完美型22％,混合型12％.微卫星重复基元中,二核苷酸(AG)n和三核苷酸(CAT)n最为常见.     

ISSR分子标记及其在植物研究中的应用

ISSR(inter simple sequence repeat)分子标记是一种以微卫星序列为引物,进行多位点PCR扩增的技术.ISSR技术简易、快捷,同时兼备AFLP(扩增酶切片段多态性)、SSR(简单序列重复)和RAPD(DNA随机扩增多态性)等分子标记方法的优点.引物设计无需预知基因组序列,只要是目标区域的长度在可扩增范围内,就能扩增出微卫星重复序列间的DNA片段.ISSR标记以其高多态性,已被广泛应用于种质收集、品种鉴定、遗传多样性、系截系、遗传作图、基因定位、标记辅助选择、预测基因组SSR基序的丰度以及SSR引物开发等研究.本文对ISSR技术及其在植物研究中的应用进行全面的概述.     

利用多元回归分析鉴定与白桦纤维长度性状相关的分子标记

通过对天然白桦群体583株个体纤维长度测定，选取其中有代表性的100株个体，利用随机扩增多态性DNA标记（random amplification polymorphism DNA，RAPD）技术对其基因组差异分析，通过扩增条带与性状表现间的多元回归分析，筛选出与白桦纤维长度显著相关的分子标记。经过20个RAPD引物筛选，有6个引物的7个片段与纤维长度显著相关，其中片段“BFL”与纤维长度的相关系数为0．401，相关性达到5％的显著水平。对此片段进行克隆、测序后，成功转化成与长纤维性状相关的序列特征化扩增区域（sequence characterized amplified region,SCAR）标记，此标记对长纤维白桦的鉴定效率达80％。     

紫云英SSR分子标记的开发及在品种鉴别中的应用

利用生物素标记的(AG)₁₅、(CT)₁₅、(AC)₁₅、(GT)₁₅探针及链霉素亲和磁珠,从紫云英的基因组中富集微卫星(SSR)序列。在用富集片段构建插入文库的950个转化子中,经PCR检测及测序共得到127个SSR序列,微卫星序列的富集效率达15.8%。除去重复或无效的序列,得到33个序列用于引物设计。对征集的9个紫云英品种进行多态性分析,有6对引物扩增出明显且稳定的多态性位点18个。在紫云英的品种水平上,这些SSR位点产生的多态率为50%~100%,有效等位基因数为1.19~1.64,Nei氏遗传多样性为0.13~0.38,Shannon多态信息指数为0.22~0.56;利用这6对引物可将参试品种完全区分开,证明这些SSR位点可用于紫云英品种的指纹鉴别。根据SSR位点的相似性系数,将 9个紫云英品种主要聚成两个类群, 与传统按生育期的紫云英品种划分结果无必然的联系。     

蒙古马MSTN基因第三外显子的克隆及其SSCP研究

依据马肌生成抑制素(MSTN)编码序列设计引物,以蒙古马基因组DNA为模板,利用PCR技术,扩增出MSTN基因第三外显子序列。将所得片段与P^GEM__Teasy载体连接,转化感受态DH5a大肠杆菌。筛选出阳性克隆,酶切、PCR鉴定后,经DNA测序结果表明,所克隆到的MSTN基因第三外显子与文献报道基本一致,有一处单核苷酸有变异。     

辣椒细胞质雄性不育系和保持系线粒体DNA差异的SRAP分析

以辣椒细胞质雄性不育系21A及其保持系21B的线粒体DNA为材料进行SRAP分析,结果表明,从128对引物扩增获得了1 440条100～1 000 bp的条带,多态性位点仅有9个,占0.63%,其中7条多态性条带位于21A中;对多态性条带回收、克隆和测序分析后发现,9个克隆在GenBank中找到了相似的功能,绝大部分与能量代谢有关;利用21A中的多态性序列特点设计SCAR引物,对21A和21B的基因组DNA进行扩增验证,3对引物在21A中扩增出目的条带,表明已成功地将SRAP标记转化为SCAR标记,是新发现的与辣椒细胞质雄性不育基因相关的片段。     

基于菜心(Brassica campestris)基因组Survey测序开发多态性SSR标记

为解决菜心SSR标记数量不足、已开发的位点多态性差等问题,本研究利用高通量测序技术,对‘四九-19’和‘3T6’两份菜心材料进行基因组Survey测序,规模化开发多态性SSR标记。两个菜心材料分别获得55 649 657个和59 300 433个Clean reads,分开拼接组装得到430 483个和499 876个Contig。在两个材料的Contig中搜索到共有的SSR位点为30 696个,其中以二和三核苷酸重复基序最为丰富,占总SSR位点的67%。分析比较发现,3 652个(12%) SSR位点在两份测序材料间具有潜在多态性,随机挑选50个SSR位点进行PCR扩增验证,48对(96%)引物在4份菜心材料中扩增出清晰的条带,其中31对(62%)引物在两份测序样品间具有多态性,19对(38%)引物在另两份菜心材料间具有多态性。结果表明,利用基因组Survey测序能开发SSR标记和开发具有多态性的SSR标记,本研究开发的多态SSR标记将进一步为菜心分子标记的发展和应用提供基础。     

苎麻基因组微卫星的分离与鉴定

以苎麻[Boehmeria nivea (L.) Gaud.]栽培品种芦竹青为材料,经MseⅠ酶切并与相应接头连接,然后与生物素标记的探针(CT)15杂交,再用链亲和素包被磁珠(Dynabeads M-280)捕捉杂交产物,以21碱基接头寡核苷酸为引物经PCR扩增获得了双链目的片段,回收300~1 000 bp DNA片段,然后克隆到pMD18-T载体上,转化至DH5α中,这样就构建了苎麻富含(GA)n微卫星的部分基因组文库。随机挑取36个克隆,以锚定简单重复序列为引物对其进行PCR筛选。测序分析了22个阳性克隆,每个克隆都含有微卫星DNA,阳性克隆率为61.1%,微卫星种类以与探针互补的（GA/CT）_n为主,占83.3%,同时还存在（TG/AC）_n和三碱基、六碱基为单元构成的苎麻微卫星,如(GAC)_n、(ACG)_n、(TCT)_n、(TCG)_n、(GAA)_n、(CCGACG) _n、(GAGAAA)_n等。最后以18个微卫星位点设计了18对苎麻微卫星特异引物。GA/CT重复单元的长度从7到40范围内变化,平均为19.2,显示了它们将产生良好多态性,为一种强有力的遗传标记。苎麻微卫星DNA标记可广泛应用于苎麻基因型鉴定,基因和QTL分析,分子标记辅助育种,系谱分析等。     

杂交油菜"蜀杂6号”特异序列扩增标记(SCAR)建立及其在杂种鉴定中的应用

用100个随机引物对"蜀杂6号”父、母本进行RAPD扩增,选出5个能在父、母本中产生多态性扩增的引物.在杂种F1代中验证它们的特异性和稳定性,从中筛选出能从杂种F1代中稳定扩增"蜀杂6号”父、母本特异标记的随机引物GE204和GE222,并对它们扩增的父、母本特异标记片段进行克隆和测序.根据测序结果设计的特异序列扩增引物,将"蜀杂6     

蒙古莸叶绿体基因组微卫星位点分析及引物筛选

本研究旨在为蒙古莸在分子水平上提供理论依据,以便对濒危稀有种制定科学的保护策略。本研究下载GenBank数据库公布的蒙古莸叶绿体基因组信息,利用生物信息学对蒙古莸叶绿体基因组进行cpSSR分析。利用MISA软件全面搜索蒙古莸叶绿体基因组SSR分子标记,并对其分析;运用Primer Premier 3.0设计并筛选多态性较好的引物用于后续研究。在全长151 707 bp的蒙古莸叶绿体基因组中,共鉴定出31个cpSSR位点,位点间平均分布距离为4 893.77 bp,其中以单核苷酸重复为主,且主要分布于LSC区,占SSR位点总数的74.19%;其次是四核苷酸重复,分布于LSC及SSC两区,占SSR位点总数的19.35%,分布最少为三核苷酸,仅占总位点数的3.23%。将所有31个位点合成31对叶绿体微卫星引物,通过毛细管电泳检测,最终筛选出8对多态性引物。此外,挑选多态性好的马鞭草EST-SSR引物,扩增结果产生非特异性条带,且与马鞭草扩增片段范围相差较大。基于软件的参数设置,单核苷酸重复数量占比最多,三核苷酸重复占比最少;从31对引物筛选出8对多态性引物,扩增率达100%,多态率为26%;...