猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI缺失突变株的构建及生物学特性研究

【目的】为研制针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的疫苗提供候选毒株。【方法】构建针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的gE/gI缺失重组转移质粒pMD-LA-RA及携带EGFP标记基因的重组转移质粒pMD-LA-EGFP-RA,将pMDLA-EGFP-RA与伪狂犬病病毒流行毒株PRV AH进行同源重组,利用EGFP为筛选标记,获得携带EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–/EGFP~+,以此毒株与pMD-LA-RA进行第2次同源重组,筛选去除EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–,并通过生长曲线、易感细胞连续传代和动物免疫评价其增殖能力、遗传稳定性及免疫原性。【结果】通过2次同源重组,结合荧光观察、空斑纯化和PCR检测,成功获得了PRV AH gE~–/gI~–,经PCR鉴定、荧光观察及测序鉴定,证实该毒株g E和g I基因被成功缺失,且不携带EGFP标记基因。生物学特性研究结果表明,该毒株增殖能力与亲本毒株相当,遗传稳定性及免疫原性良好。【结论】采用同源重组技术成功构建了免疫原性良好的猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI基因缺失突变株,为研制针对流行毒株的基因缺失疫苗奠定了一定的基础。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒gG^-基因缺失转移载体的构建

以伪狂犬病毒TK^-／gI^-缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,克隆含gG基因的EcoR V／StuⅠ片断,用限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ缺失gG基因,构成重组质粒pIRV。同时,分别将狂犬病病毒SRV9的株糖蛋白和绿色荧光蛋白克隆入载体pIRESneo,构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白表达盒。将表达盒插入到pIRV,构建gG基因缺失转移载体,为下一步同源重组获得伪狂犬病毒奠定基础。     

PRRSV GP5与GP4蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

[目的]实现PRRSV GP5与GP4蛋白在同一载体中表达各自编码的蛋白,发挥GP5蛋白在体液免疫中的优势和GP4蛋白在信号转导中的作用。[方法]利用RT-PCR扩增出GP5与GP4基因,克隆到pIRESneo载体的多克隆酶切位点及新霉素磷酸转移酶位点中,用XhoⅠ和NruⅠ双酶切含GP5和GP4基因的表达盒,将此表达盒克隆到犬2型腺病毒E3区缺失性载体pPolyⅡ-CAV-2-△E3中,以AsⅠc和PmeⅠ双酶切进行鉴定。[结果]将构建好的重组腺病毒免疫小鼠,可以诱导产生较强的体液免疫应答（ELISA抗体和中和抗体）。[结论]该重组腺病毒具有较好的免疫原性,可为研制有效的亚单位疫苗奠定基础。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒gG-基因缺失转移载体的构建

以伪狂犬病毒TK-/gI-缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,克隆含gG基因的EcoRⅤ/StuⅠ片断,用限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ缺失gG基因,构成重组质粒pIRⅤ。同时,分别将狂犬病病毒SRV9的株糖蛋白和绿色荧光蛋白克隆入载体pIRESneo,构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白表达盒。将表达盒插入到pIRⅤ,构建gG基因缺失转移载体,为下一步同源重组获得伪狂犬病毒奠定基础。     

基于CRISPR/Cas9介导的同源重组技术构建TK、gE和gI基因缺失的伪狂犬病病毒

为构建TK、gE和gI基因缺失的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV),采用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术,对从湖北某猪场送检的病料中分离到的PRV HB2017株进行基因编辑,并利用蚀斑纯化等方法获取基因缺失株.随后,采用PCR、基因测序、间接免疫荧光试验、生长曲线测定及安全性和效力试...     

猪繁殖与呼吸综合症病毒结构蛋白GP5-M腺病毒载体的构建及其在山羊乳腺中的表达

猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)是严重威胁养猪业的病毒性疾病,疫苗免疫是预防该病的最有效途径,PRRSV糖蛋白GP5和基质蛋白M融合后制成的基因工程疫苗能够有效激发机体产生免疫应答。通过在GP5和M基因的5′端依次加上组氨酸标签序列、信号肽序列,利用Linker(GP)序列将GP5和M基因连接构建融合表达GP5和M蛋白的重组质粒pMD18T-SignalP-His-GP5-M。以该质粒为模板,构建重组腺病毒载体并包装腺病毒。结果表明,用包装的腺病毒感染乳腺上皮细胞,测得最佳感染复数(MOI)为25,定量PCR和Western blot方法均检测到GP5-M的表达。大量扩增腺病毒并使用不连续氯化铯浓度梯度离心纯化病毒,使用纯化的病毒灌注山羊乳腺,采用Western blot在收集的乳汁中也检测到GP5-M蛋白的表达。结果证实,利用腺病毒载体作为基因转导的媒介,在山羊乳腺中可以表达GP5-M融合蛋白。     

新型伪狂犬病病毒基因缺失株的构建及生物学特性研究(初报)

以伪狂犬病病毒Fa株为起始材料 ,构建的 pp6 3LacZ转移载体质粒与PRVFaDNA经磷酸钙转染 ,在MDBK细胞内同源重组获得PRVFagE-/gI-/LacZ基因缺失株。以PDTK3 - 6 ,5 - 6TK缺失质粒与上述基因缺失株在TK-143细胞内同源重组 ,获得PRV -SA2 15等三基因缺失株。经核酸杂交证实构建是成功的。生物学特性观察显示 ,该基因缺失株对多种动物安全 ,具有良好的免疫原性 ,有望成为一株优秀的PRV疫苗候选株。     

狂犬病病毒P和M基因重组突变体的生物学特性分析

【目的】探索狂犬病病毒（RABV）强毒株P基因替换及P-M基因联合替换至弱毒株获得的重组突变体在宿主细胞内的传播能力、复制与转录能力及致病性,为掌握RABV强毒株P蛋白和M蛋白的生物学特性打下基础。【方法】以RABV广西街毒株GX01为研究对象,利用反向遗传技术将其P基因分别替换到弱毒株rRC-HL和r RC-HL(GX01M)株的对应位置,通过间接免疫荧光试验（IFA）及基因测序鉴定拯救的病毒,并测定重组突变体的多步生长曲线、荧光灶面积及N基因表达水平等,同时通过4周龄昆明小鼠攻毒试验验证P基因及P-M基因联合替换后对RABV致病性的影响。【结果】利用反向遗传技术能成功拯救重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M),通过IFA测定病毒荧光灶面积及多步生长曲线发现,r RC-HL(GX01P-M)株在BSR/T7-9细胞上的生长能力及传播能力均较rRC-HL(GX01P)株和rRC-HL(GX01M)株强。在复制与转录水平上,rRC-HL(GX01P)株的N基因相对表达量高于r RC-HL(GX01M)株,但低于rRC-HL(GX01P-M)株。在昆明小鼠攻毒...     

伪狂犬病病毒Fa 株gI和gp63基因缺失株的构建

用限制性核酸内切酶NcoI消化含有伪狂犬病病毒(PRV)Fa株BamHI-7片段的质粒PBB7,以低融点琼脂糖回收目的片段,经连接并转化 E.coli DH5a,获得缺失了gI和部分gp63基因的重组质粒PPB7-1.将PRVFa与PPB7-1DNA共同转染PK15单层细胞,待出现50%以上细胞病变时收获病毒,并以蚀斑法得到纯化重组病毒株,命名为PFDI/D63.小鼠试验证实,缺失株对小鼠具有一定的免疫原性.     

表达Cre重组酶的真核细胞系的建立及在重组伪狂犬病病毒研究中的应用

根据Cre基因序列设计并合成1对引物,PCR扩增出Cre基因编码区,克隆于pIREShyg载体,得到重组质粒pIREShyg-Cre,转染HEK-293A细胞后经400 μg·mL-1 Hygromycin B的筛选,将其中1个阳性克隆命名为293A-Cre.利用伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)S03109株(带有gfp报告基因表达盒及loxP位点)感染293A-Cre细胞,荧光显微镜观察、PCR及Western blot检测gfp基因的表达.结果表明,S03109感染293A-Cre二代后loxP位点间的gfp表达盒被删除,获得重组病毒S0419.将S0419感染已转染pBlulox的293A-Cre细胞,在RK13细胞上筛选得到表达LacZ的重组病毒S06293.S06293在293A-Cre细胞上传代2次,X-Gal原位染色表明LacZ的表达消失.测序结果证实,在Cre重组酶作用下,2个同向loxP序列之间的外源基因序列被正确除去.以上结果表明,本研究构建的稳定表达Cre重组酶的293A-Cre细胞系可以用于在包含有loxP位点的PRV基因组中外源基因的快速删除或整合.     

表达Cre重组酶的真核细胞系的建立及在重组伪狂犬病病毒研究中的应用

根据Cre基因序列设计并合成1对引物,PCR扩增出Cre基因编码区,克隆于pIREShyg载体,得到重组质粒pIREShyg-Cre,转染HEK-293A细胞后经400 μg·mL-1 Hygromycin B的筛选,将其中1个阳性克隆命名为293A-Cre.利用伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)S03109株(带有gfp报告基因表达盒及loxP位点)感染293A-Cre细胞,荧光显微镜观察、PCR及Western blot检测gfp基因的表达.结果表明,S03109感染293A-Cre二代后loxP位点间的gfp表达盒被删除,获得重组病毒S0419.将S0419感染已转染pBlulox的293A-Cre细胞,在RK13细胞上筛选得到表达LacZ的重组病毒S06293.S06293在293A-Cre细胞上传代2次,X-Gal原位染色表明LacZ的表达消失.测序结果证实,在Cre重组酶作用下,2个同向loxP序列之间的外源基因序列被正确除去.以上结果表明,本研究构建的稳定表达Cre重组酶的293A-Cre细胞系可以用于在包含有loxP位点的PRV基因组中外源基因的快速删除或整合.     

猪瘟伪狂犬病重组病毒SA215(A)疫苗株的构建(初报)

采用磷酸钙转染系统 ,将伪狂犬病三基因缺失疫苗SA2 15株DNA与PP6 3LacZE2DNA共转染Vero细胞 ,获得SA2 15 (A) 1、SA2 15 (A) 2和SA2 15 (A) 3等 12个重组病毒株。以光生物素标记的HCVE2基因为探针进行初步鉴定后 ,挑选SA2 15 (A) 1株作BamHⅠ酶切和southern转印杂交鉴定 ,结果表明构建是成功的 ,将其命名为SA2 15(A)。直接荧光抗体检测、SDS -PAGE电泳和western免疫印迹检测结果表明HCVE2基因在重组病毒内获得表达 ,产生大小约 5 1kd的蛋白。对SA2 15 (A)株进行部分生物学特性研究 ,培养特性观察试验表明该毒株可适应Vero、BHK2 1和鸡胚成纤维细胞等多种细胞 ,但对不同细胞系表现有一定的差异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP_5基因重组腺病毒的构建及特性研究

将克隆到的猪繁殖与呼吸综合征病毒全长GP5基因插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒中,再将重组质粒pAdTrack-CMV/GP5用PmeⅠ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-GP5,经酶切充分暴露反向末端重复序列,再与脂质体混合转染AD-293细胞,成功获得了AD-GP5复制缺陷型腺病毒,经检测证实AD-GP5稳定性好,安全性高.转录水平检测证实,GP5蛋白基因得到了转录;荧光检测发现,外源蛋白已得到表达.     

慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑, PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞, 48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在10~6 TU·mL~(-1)之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显, sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。     

狂犬病病毒SRV9株磷酸化蛋白P基因和基质蛋白M基因重组质粒的构建

[目的]重组狂犬病病毒SRV9株磷酸化蛋白的P基因和基质蛋白的M基因,为构建狂犬病毒(SRV9)全长cDNA提供技术支撑.[方法]设计重组PCR引物,分别扩增SRV9的P基因和M基因,构建重组质粒pMD18-PM,并对重组质粒进行酶切、测序鉴定.[结果]PCR扩增的SRV9的P基因和M基因大小分别为893 bp和608 bp,与GenBank已发表的狂犬病病毒SRV9(登录号:AF499686)序列比较,同源性分别为99.66;和99.67;.融合基因PM片段大小为l 501 bp,与预期大小相同,且融合完全.[结论]应用重组PCR成功融合狂犬病病毒SRV9磷酸化蛋白P基因和基质蛋白M基因,为后续构建病毒全长cDNA及感染性克隆奠定基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S-1株GP5蛋白和N蛋白的原核表达

将构建好的表达质粒pET-E和pET-N转化到大肠杆菌BL-21中,通过诱导剂IPTG的诱导,在原核表达系统中得到了高效表达,重组蛋白的分子量分别为39 KDa和31 KDa左右。通过Western-blot蛋白免疫印记法检测蛋白活性,发现两种原核表达重组蛋白均能与PRRSV阳性血清发生反应,具有生物学活性,这就为下一步目的蛋白的纯化、蛋白高级结构的研究以及以GP5和N蛋白为抗原ELISA诊断方法的建立奠定基础。     

几株伪狂犬病病毒的增殖特性与保存条件

高滴度的抗原是制备优质疫苗的首要条件。对6株伪狂犬病病毒在仓鼠肾(baby hamster kidney,简称BHK)细胞和猪睾丸细胞(swine testicular,简称ST)细胞上的增殖效率进行了比较,同时测定不同保存温度和冻融条件对病毒滴度的影响。结果表明,几株伪狂犬病病毒在BHK细胞和ST细胞上增殖效率均很高,可达到生产要求。相较于ST细胞,各毒株在BHK细胞上出现病变时间更早。然而,所有毒株在ST细胞上的病毒滴度都高于同期在BHK细胞上的滴度。强毒株AH02LA株在2种细胞上滴度可达10^8.0 TCID₅₀/0.1 mL以上,表现为发生病变早,病毒增殖快,峰值到来早的特性。通过强毒株AH02LA株获得的基因缺失株LA-A株和自然传代缺失致弱株LA2017株峰值均达10^8.0 TCID₅₀/0.1 mL,展现出优良疫苗株的潜质。保存条件试验表明,PRV在-70℃保存30 d和4℃保存12 d内滴度相对稳定,而-20℃保存的病毒滴度下降明显。多次冻融后,滴度有所下降,相较于-70℃,-20℃...     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株gE基因原核表达质粒的构建

为给猪伪狂犬病病毒的诊断及防治提供科学依据,参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因序列,设计1对特异性引物,以PRV GZ-Z1株DNA为模板,进行gE基因的PCR扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经鉴定后测序。结果表明:目的片段为PRV gE基因完整开放阅读框,大小1 734bp,编码577个氨基酸,在pET32a(+)载体中位置正确,表明,pET32a-gE原核表达质粒构建成功。该基因与国内外其他18株PRV的gE基因推导氨基酸序列同源性为94.8%～98.6%;与国外分离株属同一个进化分支,遗传关系相对较近;而与国内Fa、Min、GDSH等毒株亲缘关系较远。     

TK基因重组缺陷山羊痘病毒构建及其生物学特性鉴定

[目的]利用同源重组技术构建TK基因缺陷的山羊痘病毒（GTPV）毒株,为研制出更安全、高效的GTPV弱毒疫苗和病毒载体提供备选毒株.[方法]采用PCR克隆GTPV AV41株TK基因（ORF56）及其侧翼基因组片段,在TK基因内部插入报告基因EGFP抗性基因gpt达盒,构建GTPV重组转移载体pTK-Eg.将重组转移载体pTK-Eg与GTPV AV41株共转染Vero细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,鉴定其生长特性和遗传稳定性,并接种山羊评价其安全性和免疫原性.[结果]成功构建获得一株TK基因缺陷的重组病毒vTK-Eg.与亲本毒株GTPV AV41相比,vTK-Eg的生长特性及其形成的细胞病变均未发生显著改变,只是毒价略微下降100.5个数量级;在原代牛睾丸（BT）细胞上连续传代,至少在10代内保持遗传性状和病毒滴度稳定.接种vTK-Eg的山羊精神和食欲均正常,接种后体温升高和局部反应的严重程度均较接种亲本毒株GTPV AV41的山羊有所降低;vTK-Eg与GTPV AV41株诱导山羊产生的GTPV中和抗体水平无明显差异（P＞0.05）.[结论]构建的TK基因重组缺陷病毒vTK-Eg具有良好的遗传稳定性和免疫原性,较亲本毒株其安全性也有所提高,可作为研制GTPV基因工程弱毒疫苗和活载体疫苗的备选毒株.