玉米转基因成分三重实时荧光PCR筛选检测

本研究开发建立了三重实时荧光PCR反应体系对玉米及其加工制品的转基因成分进行高通量快速检测。以玉米单拷贝内源基因adh1(编码乙醇脱氢酶的基因)、启动子(35S promoter from cauliflower mosaic virus, p-35S)和t-NOS终止子(terminator of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens, t-NOS)等常用转基因元件为靶标基因,以转基因玉米MON863、NK603、MON810、Bt11,非转基因玉米粉2019054以及转基因大豆粉,棉花籽和小麦粉等非玉米农作物样本共8份测试样品进行方法特异性分析,对10个玉米品系种子样本和41份玉米食品样品进行方法适用性分析和日常样本筛查检测,用标准曲线法验证方法的检测低限和重复性。结果表明该体系能在转基因阳性样本DNA为模板的一个反应管中同时检出3个靶标基因,在非转基因的玉米样本中仅检出内源基因,检测结果符合标示值;adh1、p-35S和t-NOS三种靶标基因扩增效率分别为96.84%、94.92%和93.80%,线性相关系数分...     

巢式PCR和SYBR Green I实时PCR检测转基因大豆方法的研究

为了建立转基因大豆检测技术,采用巢式PCR和SYBR Green I实时PCR技术,检测转基因大豆 外源基因(CaMV35S、CP4EPSPS).结果表明,利用巢式PCR可检测出1 ng/μL转基因含量1％　的大豆中　的CaMV35S基因,而轮PCR的检测限为100 ng/μL;利用SYBR Green I染料能结合双链DNA的 特点,应用实时PCR技术可检测到CaMV35S、CP4EPSPS基因扩增所产生的信号,通过扩增产物的熔解 曲线能有效地区分特异性产物,CaMV35S基因的检测限为0.1 ng/μL.同时利用该方法对黄豆、炒黄豆、豆干等样品进行检测,样品中未检出CaMV35S基因成分.巢式PCR方法明显提高了PCR的检测限, SYBR Green I实时荧光PCR方法能有效、快速检测CaMV35S转基因成分.     

巢式PCR和SYBR Green Ⅰ实时PCR检测转基因大豆方法的研究

为了建立转基因大豆检测技术,采用巢式PCR和SYBR Green Ⅰ实时PCR技术,检测转基因大豆外源基因(CaMV35S、CP4EPSPS)。结果表明,利用巢式PCR可检测出1 ng/μL转基因含量1%的大豆中的CaMV35S基因,而第一轮PCR的检测限为100 ng/μL;利用SYBR Green Ⅰ染料能结合双链DNA的特点,应用实时PCR技术可检测到CaMV35S、CP4EPSPS基因扩增所产生的信号,通过扩增产物的熔解曲线能有效地区分特异性产物,CaMV35S基因的检测限为0.1 ng/μL。同时利用该方法对黄豆、炒黄豆、豆干等样品进行检测,样品中未检出CaMV35S基因成分。巢式PCR方法明显提高了PCR的检测限,SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法能有效、快速检测CaMV35S转基因成分。     

超低温11年保存期对转基因作物基体标准样品核酸检测的影响

标准物质是转基因检测结果可靠性、可比性以及准确性的重要参比,不可缺少。本文研究了植物转基因成分检测中基体标准物质的长期保存对PCR检出及低含量标准物质量值稳定性的影响。应用普通定性PCR、实时荧光PCR和微滴式数字PCR3种方法,对不同含量转基因标准物质和转基因检测样品进行了复现性和量值稳定检测。结果表明,-70～-75℃保存条件下, 9年保存期的转基因含量为0.1%的单一作物转化体标准物质中依然能得到清晰的转化体目标片段扩增,且Ct值在36左右。数字PCR定值结果表明, 9年保存期的转基因基体标准物质的量值保持稳定。11年保存期的大豆、玉米、水稻的混合基体样品中各转基因元件均能稳定检出。研究结果表明转基因基体标准物质的长期低温保存不会影响其各转基因元件的检出和作为转基因核酸检测阳性对照的应用。     

多重PCR结合DHPLC方法检测番茄中转基因成分

应用多重PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,检测转基因番茄华番1号中的转基因成分。对番茄中特异的PG内源基因、华番1号中含有的CAMV35S、NOS和NPTII外源基因进行多重PCR扩增,将扩增产物测序验证。利用DH-PLC分离多重PCR产物,建立了多重PCR-DHPLC技术检测转基因番茄的方法;将样品进行稀释,确定了该方法的检测灵敏度。试验结果表明,所建立的多重PCR-DHPLC方法操作简便,快速准确,能够同时检测转基因番茄4个内、外源基因,检测限达0.5ng/μL,可用于番茄中转基因成分的检测。     

转基因甜菜H7-1实时荧光PCR检测方法

运用实时荧光PCR方法对转基因甜菜H7-1外源基因FMV 35 S启动子、E93’终止子、CP 4-EPSPS外源基因和品系特异性进行了检测.建立了快速、准确的转基因甜菜H7-1转基因成分的PCR检测方法.本研究采用的FMV 35 S启动子、E93’终止子、CP 4-EPSPS和品系特异性检测引物探针能有效检测转基因甜菜H7-1中转基因成分,具有特异性,且灵敏度达到0.01％.     

玉米样品中转基因玉米Bt176含量检测

根据其检测特异性,转基因产品检测技术可分为筛选、基因、构建和转化体特异性检测四类.由于转化体特异性检测方法的具有高度特异性,目前,一些发达国家对于转基因产品检测方法正逐步过渡到转化体特异性序列的检测方法.本研究针对转基因玉米Bt176的外源基因3'端与玉米基因组DNA相接区序列设计具有转化体特异性的引物和荧光探针.利用实时荧光定量PCR,以已知Bt176含量样品为标准样品建立内外源基因标准曲线,利用该标准曲线对多个玉米样品Bt176玉米成分含量进行检测,结果显示该方法检测结果准确,检测特异性强,Bt176玉米检测极限浓度达到0.001 ng/μL.同时该方法操作简单,适合转基因样品大批量检测.     

黑龙江省大豆产区疑似转基因大豆的分子检测

利用表型鉴定和PCR分子检测相结合的方法,对黑龙江省国储库拒收的疑似转基因大豆进行了转基因成分检测.表型鉴定方法为草甘膦叶片涂抹,PCR分子检测对象为CaMV35S启动子、NOS终止子及目的基因CP4-EPSPS.利用大豆自身的凝集素基因作为PCR检测的内标基因,以有效排除DNA质量、实验操作等因素对检测结果的影响.结果表明,所测材料不抗草甘膦除草剂,也不合所检测的外源基因,由此判断该批次材料不是转基因大豆.     

抗病转基因水稻M12及其产品成分的定性、定量PCR检测方法

通过定性PCR扩增了转基因水稻M12转化体特异性片段和水稻内标基因(sps)片段, 将PCR产物酶切连接后构建到T载体, 得到适于转基因水稻M12品系特异性PCR检测的质粒分子pM12, 建立了事件特异性定性、定量PCR检测方法。定性PCR结果表明, 本方法可特异性检测出M12, 检测限可达100拷贝单倍体水稻基因组; 定量PCR结果表明, M12和sps定量PCR标准曲线R ²为0.998和0.997, 扩增效率为95.3%和108.4%, 重复性分析标准偏差范围为0.043~0.276, 定量极限和检测极限可达100和10拷贝。对转基因含量为1.0%的混合样品定量结果的相对偏差在8.0%以内。本研究建立的方法可用于转基因水稻M12及其加工产品成分的检测。     

木薯内参照基因LAM2定性PCR和定量PCR分析

在转基因植物及其产品的成分检测中,内参照基因(endogenous reference gene)起着重要的作用,木薯内参照基因的研究是转基因木薯成分定性PCR和定量PCR检测的基础。本研究选择木薯的亚麻苦苷酶(linamarase,LAM)和Polyubiquitin(PUBQ)基因为研究对象,运用定性PCR的方法在22种木薯的不同品种中进行稳定性分析,在12种大戟科其它植物、20种非大戟科植物及五类主要转基因作物的混合样品(玉米,大豆,水稻,棉花和油菜)中对LAM2和PUBQ1定性PCR引物进行特异性检测分析及灵敏度检测分析。结果显示:LAM2和PUBQ1引物在木薯的不同品种中均能得到稳定性扩增;在12种大戟科其它植物、20种非大戟科植物能够进行特异性扩增,没有发现非特异性扩增产物出现;LAM2在五类主要转基因作物的混合样品(玉米,大豆,水稻,棉花和油菜)中也没有非特异性扩增产物出现,而PUBQ1在五类主要转基因作物的混合样品(玉米,大豆,水稻,棉花和油菜)中却有很多的非特异性扩增产物出现。灵敏度检测发现定性PCR LAM2检测方法的灵敏度达到质量百分含量0.01%,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测结果表明LAM2的灵敏度可达到0.001~0.000 1 ng/μL。选择部分品种的PCR扩增产物进行测序,序列分析表明LAM2在不同品种的木薯的基因组DNA均可以扩增到293 bp的核苷酸片段,比对分析表明所获得的木薯不同品种中LAM2 PCR扩增片段的核苷酸序列一致没有发现变异位点。研究结果表明LAM2引物扩增系统初步符合内参照基因的种内一致性,稳定性,种间特异性的特点,灵敏度检测的要求可应用于转基因木薯成分定性和定量PCR检测。     

转植酸酶基因玉米phyA2基因标准质粒分子构建及其检测应用

质粒分子以其良好的适应性被较多地用作转基因标准材料的替代品。本文根据转植酸酶基因玉米phyA2基因设计引物与探针,并构建了一种包含phyA2基因片段(243 bp)和内标基因片段(178 bp)的质粒分子pPZ。选取不同转基因模板DNA作用于phyA2特异性引物,PCR结果显示只有转植酸酶基因玉米出现131 bp的目的条带;选取不同转基因作物检测体系作用于质粒分子pPZ,只有以pPZ DNA为模板时出现目的条带(131 bp和88 bp)。同时采用pPZ质粒分子和转基因玉米阳性基因组DNA为标准对4个转植酸酶基因玉米混合样品(3.0%、1.0%、0.5%和0.1%)进行定量检测,t检验表明,2种标准产生的斜率、线性相关系数和定值结果没有显著差异。这些结果表明,pPZ质粒分子可以作为转植酸酶基因玉米替代品用于定性和定量检测。     

一种快速高效检测转基因玉米方法的建立

建立高效的目的基因检测方法是保障生物育种研发和产业化进程的重要技术支撑。应用常规PCR法、TaqMan探针实时荧光PCR法及叶片直接PCR法对转基因玉米叶片进行CaMV35S启动子和NOS终止子2个转基因元件的检测。结果表明,叶片直接PCR法分别较常规PCR方法和TaqMan探针实时荧光PCR法节约62%、48%的时间和25%、43%的成本,而且扩增出的目的条带清晰可见,符合目的片段大小,结果真实可靠,适用于大量转基因玉米植株叶片的快速筛选和鉴定。     

转基因玉米MIR162转化事件特异性检测方法及其标准化

转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发出来的新型抗鳞翅目昆虫的转基因玉米品种。本研究目的在于建立该品系转化事件特异性定性、定量检测方法并形成定性检测国家标准。定性PCR体系经实验室内部比对及实验室间循环验证结果表明,该体系特异性强,灵敏度较高(0.1%),具有良好的重复性、再现性。Taqman探针实时荧光PCR检测结果表明,所设计的探针特异性强,检测低限(LOD)在0.01%以下;定量标准曲线R²均为0.999,扩增效率为98.622%和99.602%,SD范围为0.014~0.209,RSD的范围为0.049%~0.879%,稳定性好;对转基因含量为1.0%、0.5%、0.1%的样品定量结果相对偏差在8%以内,结果较为准确。本研究建立的方法完全可用于含转基因玉米MIR162成分样品的检测。     

转基因玉米转化体特异性寡核苷酸芯片测试方法的研制

根据7种转基因玉米Bt11、Bt176、Mon810、Mon863、TC1507、GA21和NK603的重组DNA结构,利用Primer premier 5.0引物设计软件分别设计转化体特异性引物,优化PCR反应条件,对引物特异性及灵敏度进行验证。结果表明,所设计引物特异性强,灵敏度达0.1%。在植物基因组与外源基因的连接区域,利用Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件分别设计和筛选7种转基因玉米40mer oligo转化体特异性探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片,并对芯片检测的特异性、重复性及检测灵敏度进行检验。证明所设计探针特异性强,灵敏度达0.01%。与PCR检测方法相比,基因芯片检测法灵敏度高、特异性强,可有效检测及鉴定多种转基因玉米,大大提高检测的准确率和效率。     

植酸酶基因定性PCR检测方法及阳性质粒分子的构建

植酸酶基因在农业生产中具有很高的应用价值,正被广泛用于农作物的基因工程研究。为了满足转植酸酶基因作物安全监管的需要,通过优化PCR检测条件,建立了植酸酶基因特异性定性PCR检测方法。该方法具有良好的扩增特异性和检测灵敏度,可以满足我国植酸酶转基因作物监管需要。此外,我们将6大作物(小麦、水稻、棉花、大豆、玉米和油菜)的内标准基因和植酸酶基因克隆到同一载体上,构建成了阳性质粒分子pBS Endogenous-phytase。该质粒分子适用于这6大作物中植酸酶基因的筛查检测。本研究为转植酸酶基因作物的安全监管提供了阳性材料和检测方法。     

转基因玉米MIR162转化事件特异性检测方法及其标准化

转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发出来的新型抗鳞翅目昆虫的转基因玉米品种。本研究目的在于建立该品系转化事件特异性定性、定量检测方法并形成定性检测国家标准。定性PCR体系经实验室内部比对及实验室间循环验证结果表明,该体系特异性强,灵敏度较高(0.1%),具有良好的重复性、再现性。Taqman探针实时荧光PCR检测结果表明,所设计的探针特异性强,检测低限(LOD)在0.01%以下;定量标准曲线R²均为0.999,扩增效率为98.622%和99.602%,SD范围为0.014~0.209,RSD的范围为0.049%~0.879%,稳定性好;对转基因含量为1.0%、0.5%、0.1%的样品定量结果相对偏差在8%以内,结果较为准确。本研究建立的方法完全可用于含转基因玉米MIR162成分样品的检测。     

The impact of GM seed admixture on the non-GM harvest product in maize (<Emphasis Type="Italic">Zea mays</Emphasis> L.)

Recently, the introduction of GM maize in agricultural production in the EU and elsewhere has raised the issue of adventitious presence of GM seeds in conventional seed lots. Adventitious presence may occur in all arable farming, and at any step in the production of seeds or grain, or in processing of harvested product in the food/feed chain. As of today, there are no official thresholds governing the adventitious presence of GM seeds in conventional seed lots in Europe. However, it is assumed that GM admixture in seed lots could have a considerable influence on the level of adventitious presence in the non-GM harvested product. The experiments highlighted in this paper aim at the consequences of adventitious presence of GM maize seeds in conventional seed lots. It is shown for varieties belonging to the same maturity group that the final GM rate (% seeds) in the harvest product is nearly same as the initial seed admixture (% seeds). This corresponds to Hardy–Weinberg expectations. The variation depends mainly on the flowering coincidence, the site and climatic conditions. In cases where the admixed seeds are of different maturity group, the level of cross-pollination in the harvest product is reduced. Furthermore a comparison between the visual GM seed detection and real-time PCR detection was done. It is evident that the result of the real-time PCR detection method has a more variable uncertainty associated with its results than the visual seed testing method. The accuracy of prediction from % GM seed to % GM DNA depends on the reference material used for calibration curves.     

猪伪狂犬病毒Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因序列,设计一对特异引物和探针,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果表明：TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法灵敏度可达2.23×101拷贝/μL,比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒（PPV）、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR检测阳性率分别为40%和33%,两者符合率90%。表明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测大量样品,可适合于PRV的临床诊断和流行病学调查。     

非洲猪瘟病毒LNA引物PCR检测方法的建立及优化

为了建立一种便捷、快速且精准的非洲猪瘟病毒的检测方法,本研究根据GenBank中公布的ASFV p72基因序列,设计了一对特异性引物,并对引物中的适当碱基进行锁核酸修饰,通过优化退火温度、引物浓度,建立了非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物PCR检测方法。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,检测灵敏度可以达到3×10¹ copies/uL,比常规引物PCR方法的灵敏度提高了100倍,比real-time PCR方法的灵敏度提高了10倍,对猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒等病原基因组均无扩增,特异性良好。72份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。本研究成功建立了非洲猪瘟病毒的LNA引物PCR检测方法,方法的特异性强、敏感性高,操作简单,为非洲猪瘟病毒的检测提供了一种新的、更加敏感的检测技术。