橡胶树胶孢炭疽病菌CgBASP2基因敲除突变体构建及其致病力分析

在前期对橡胶树胶胞炭疽病菌分泌蛋白组进行预测的基础上,通过RT-PCR的方法克隆了1个候选分泌蛋白基因并命名为Cg BASP2(Biotrophy-associated Secreted Proteins 2 of Colletotrichum gloeosporioides)。该基因编码100个氨基酸,相对分子质量约为9.85×103。生物信息学分析结果表明,该蛋白含有1个18氨基酸的信号肽序列,不含任何跨膜结构域。氨基酸序列比对结果表明,Cg BASP2与草莓胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Nara gc5)、西瓜炭疽菌(Colletotrichum orbiculare MAFF)、玉米炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、菜豆炭疽菌(Colletotrichum higginsiaum)和稻瘟菌(Magnaporthe oryzae 70-15)的BASP2同源,同源性分别为100%,90%,87%,87%和67%。为了研究该基因的功能,本研究通过同源重组技术构建了橡胶树胶孢炭疽病菌Cg BASP2基因的敲除突变株ΔCg BASP2。进一步的分析发现,与野生型菌株相比ΔCg BASP2突变菌株不能对橡胶树叶片产生致病性,由此可见,Cg BASP2基因在胶胞炭疽病菌的致病过程中起重要作用。     

禽流感病毒新疆株A/Duck/XJ/4(H5N1)的PB1、PB2和PA基因测序及进化分析

通过RT-PCR技术对禽流感病毒新疆株A/Duck/XJ/4(H5N1)的PB1、PB2和PA基因分别进行了扩增及克隆,测序结果表明该毒株的PB2、PB1和PA基因全长核苷酸序列分别为2341 bp、2282 bp和2187 bp.同源性分析表明A/Duck/XJ/4(H5N1)株与禽源、野生鸟类和猪源的禽流感毒株均有很高的同源性(86.3%～99.6%).与人源毒株相比,PB2和PA与A/HK/156/97(H5N1)株的同源性较低(86.3%～88.7%);与A/Vietnam/CL01/2004(H5N1)株和A/human/Zhejiang/16/2006(H5N1)株的同源性较高(93.0%～98.8%);PB1与人源毒株A/HK/156/97(H5N1)、A/Vietnam/CL01/2004(H5N1)、A/human/Zhejiang/16/2006(H5N1)同源性为91.1%～93.2%.     

九里香、柚花瓣HPL基因保守序列的克隆与分析

根据GenBank中登录的一些植物的脂氢过氧化物裂解酶基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR技术从芸香科的2种植物(九里香、柚)的花瓣中扩增出该基因的cDNA片段。测序表明,片段大小为512bp。2个片段均包含HPL基因的4个活性中心,并且同源性很高。     

新疆油鸡H9N2亚型禽流感病毒PB1基因的克隆与序列分析

为了阐明新疆油鸡H9亚型流感病毒PB1基因的分子特征与进化趋势,本研究采用RT-PCR技术对新疆油鸡分离株A/Chicken/Xinjiang Baicheng/1/2014(H9 N2)的PB1基因进行了克隆、测序及分子进化分析,将PB1基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列与Genbank中已经公布的参考序列进行同源性比较。结果表明,新疆油鸡分离株的PB1基因由2274个碱基组成,编码757个氨基酸,与AIV A/chicken/Henan/89/2013(H7N9)的PB1基因处于同一分支,其核苷酸和氨基酸水平的同源性依次为99.2%和99.4%,新疆油鸡分离株的PB1基因不属于欧亚分支G1、A/CK/BJ/94和Y439的任何谱系。     

新疆南疆驴源H3N8亚型EIVHA基因序列分析

为明确新疆南疆驴是否感染马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)及驴源EIV HA基因特征,根据GenBank登录的EIV基因序列,设计合成1对引物,采集新疆南疆地区2个驴屠宰点33份驴肺组织样品,采用RT-PCR扩增驴源EIV HA基因片段,并对扩增产物进行测序与序列分析。结果表明,中国新疆南疆驴源EIV A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)株HA基因长1 704bp,编码567个氨基酸。同源性分析结果显示,与国内外H3N8亚型EIV参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为88.9%~99.9%和88.3%~99.8%,与国内毒株和哈萨克斯坦毒株在一个进化分支内。与GenBank数据库中唯一1个驴源毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)的比对结果显示,2个毒株裂解位点、糖基化位点、抗原位点和受体结合位点氨基酸完全一致,只是错位2个氨基酸。确定新疆南疆存在驴感染EIV,可能为国内疫情的延续或周边国家传入。     

梭梭液泡膜焦磷酸酶HaVVP基因克隆及序列分析

以梭梭叶片为材料,根据其他植物液泡膜焦磷酸酶基因的保守序列设计引物,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法克隆到1个H+-PPase基因,命名为HaVVP。HaVVP基因编码区长2 734bp,编码767个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的高等植物H+-PPase基因核苷酸序列的同源性均在68%以上、氨基酸序列的同源性达80%以上。     

禽流感病毒A/Duck/Shnghai/02/99(H9)HA基因的克隆及序列分析

根据GenBank已公布的禽流感病毒H9亚型血凝素蛋白编码基因,设计了一对引物(H1和H2),RT-PCR扩增禽流感病毒A/Duck/Shanghai/02/99(H9)的HA基因,扩增片段与载体pUCm-T的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,重组质粒pUCm-T-HA经限制性内切酶酶切和PCR鉴定后进行测序。BlastN分析结果显示该分离株血凝素编码基因与已发表的鸭源禽流感病毒A/Duck/Shantou/1605/01(H9N2)和A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)血凝素编码基因的核甘酸序列同源性为98%,从而从分子水平确定了该分离株为H9亚型禽流感病毒。     

大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5的克隆与分析

【目的】克隆和分析与大豆孢囊线虫寄生密切相关的果胶酸裂解酶新基因,为研究大豆孢囊线虫寄生和致病的分子机理提供依据,并为探讨大豆孢囊线虫的防控新途径提供理论基础。【方法】通过EST分析结合RACE-PCR扩增方法,从大豆孢囊线虫中克隆出1个果胶酸裂解酶新基因;通过原位杂交和半定量PCR的方法确定基因的表达部位和分析不同发育阶段的基因表达;采用Southern杂交方法分析基因的拷贝数。【结果】 从大豆孢囊线虫中克隆出1个全长为957个碱基编码227个氨基酸残基的新果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5（GenBank 登录号HQ123259）。Hg-pel-5 基因组由2个外显子和1个内含子组成。预测蛋白含有20个氨基酸残基的信号肽和4段细菌结构的果胶酸裂解酶第三家族的保守位点。原位杂交确定Hg-pel-5在大豆孢囊线虫亚腹食道腺中表达。半定量RT-PCR结果表明Hg-pel-5在寄生前和寄生过程早期的2龄幼虫大量表达。Southern杂交结果显示Hg-pel-5存在于大豆孢囊线虫基因组中并以多拷贝形式存在。【结论】对大豆孢囊线虫中1个新的果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5进行克隆和分析,表明该基因在大豆孢囊线虫早期寄生过程中发挥重要作用。     

克雷伯氏菌果胶酸裂解酶基因K-PGL的获取与序列分析

【目的】研究克雷伯氏菌果胶酸裂解酶基因K-PGL的序列特征及其编码产物的理化性质、结构特征及同源性等。【方法】根据同源序列相似性设计引物,利用PCR、染色体步移等技术获得了基因序列,并对基因信号肽,疏水性和结构域等进行了分析。【结果】获得克雷伯氏菌2395 bp序列,其中K-PGL基因开放阅读框1710 bp,编码569个氨基酸,分子质量63.37 kDa,等电点7.17。编码蛋白具有信号肽酶切割位点,效率为0.864,序列中不含有半胱氨酸Cys,平均疏水指数为-0.449,为稳定存在的亲水蛋白。基因编码的蛋白具有内切聚半乳糖醛酸裂解酶基因家族特有的保守结构域,进化上与产酸克雷伯氏菌亲缘关系最近。【结论】获得了K-PGL基因序列及其特征,为进一步研究果胶酸裂解酶的生物学功能和应用提供依据。     

柑桔转化酶基因家族新成员的克隆和序列分析

分析植物可溶性转化酶基因的保守区序列，设计一对PCR引物，以甜橙基因组DNA为模板。采用PCR方法扩增出长约1000bp的DNA片段。克隆入pUCm-T载体，测序结果表明获得柑桔酸性转化酶基因家族的一个新的成员。基因片段长1096bp。包括4个外显子和3个内含子，其序列已在GenBank中登记（登记号为AF433643）。在GenBank中进行同源性检索的结果表明，该成员编码的氨基酸与植物可溶性酸性转化酶的氨基酸同源性较高。与宽皮柑桔（GenBank登记号，AF312229）可溶性酸性转化酶基因编码的氨基酸具有77%的同源性，而与定位于细胞壁的（不溶性）酸性转化酶同源性较低。最高权33%（Fragaria ananassa,GenBankAF000521)。聚类分析结果表明该成员与我们已报道的2个柑桔酸性转化酶基因不同，推测我们获得的基因是转化酶基因家族的又一新成员（CS-VI1）。它与CU-AI1和CSCWI-1的核苷酸同源性分别为45.28%和44.85%。氨基酸同源性分别为27.58%和10.35%。3个成员间核苷酸和氨基酸序列较低的同源性，不会在South-ern,Northern和Western杂交中产生交叉干扰反应。     

GC含量丰富的人I型原胶原蛋白基因片段克隆及其序列分析

鉴于做转基因牛羊乳腺生物反应器的需要,根据GenBank中所公布的人I型原胶原蛋白基因序列设计引物,利用健康人的胎盘中提取的基因组DNA为模板,通过优化的长距离PCR,成功地克隆出GC含量丰富的人I型原胶原基因组DNA片段,序列测定与分析的结果显示中国人I型原胶原蛋白基因组DNA片段与GenBank中所公布出来的序列所对应的部分有99.5%的同源性,其中外显子部分与GenBank中的对应部分完全一致;而在内含子中,本研究克隆到的基因与GenBank中公布出来的序列有不少差异,尤其表现在内含子1和2中,其中内含子2要比GenBank中公布的基因内含子2多出14个碱基,这14个碱基具体有什么作用尚需要进一步阐明,内含子间的差异凸显了东西方人种之间基因序列的多态性。     

猪轮状病毒VP6基因的原核表达载体构建和表达

根据已报道的猪轮状病毒VP6基因序列设计了2对引物,利用pGEM-T-Easy-VP6重组质粒为模板,经PCR扩增获得了1 194 bp的产物。将扩增片段分别插入到pET5α和pGEX-4T-2构建表达载体,并分别在大肠杆菌BL21(DE3)Plyss和ER2566中表达。结果表明:成功构建了重组质粒,而且该片段在大肠杆菌中也成功表达,获得了大小为44 kD的蛋白。     

GC含量丰富的人Ⅰ型原胶原蛋白基因片段克隆及其序列分析

鉴于做转基因牛羊乳腺生物反应器的需要,根据GenBank中所公布的人Ⅰ型原胶原蛋白基因序列设计引物,利用健康人的胎盘中提取的基因组DNA为模板,通过优化的长距离PCR,成功地克隆出GC含量丰富的人Ⅰ型原胶原基因组DNA片段,序列测定与分析的结果显示中国人Ⅰ型原胶原蛋白基因组DNA片段与GenBank中所公布出来的序列所对应的部分有99.5%的同源性,其中外显子部分与GenBank中的对应部分完全一致;而在内含子中,本研究克隆到的基因与GenBank中公布出来的序列有不少差异,尤其表现在内含子1和2中,其中内含子2要比GenBank中公布的基因内含子2多出14个碱基,这14个碱基具体有什么作用尚需要进一步阐明,内含子间的差异凸显了东西方人种之间基因序列的多态性.     

小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL的RGAP分析

根据抗病基因保守序列合成7对RGAP引物扩增携带Pm 21基因的小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL和感病品种Chancellor,结果只有R11R/R11F引物对在6VS/6AL中扩增出1 317 bp的多态性片段。在其他抗白粉病基因载体品系中检测不到该片段。回收、克隆、测序结果的Blast分析表明,该片段第1-199核苷酸、第520-792核苷酸2个区域与GenBank中的已知序列有较高的类似性,这些序列中均含有抗性蛋白的保守区域。与小麦抗叶锈病基因Lr10的序列(AY270159.1)比较结果显示,两区域的类似性达89%和86%。发现由该片段推定的氨基酸序列包含抗病基因的类似序列,有1个不完整的核苷酸结合位点(NB-ARC)。     

利用反向PCR克隆猪圆环病毒2型全基因组

参照GenBank数据库中PCV-2的ORF1基因序列,设计1对特异性引物和1对为反向引物,利用常规PCR扩增ORF1基因片段,再利用反向PCR扩增ORF1基因片段侧翼序列,将2次PCR产物克隆测序,经BLAST分析确认为PCV-2基因组序列,利用Vector NTI 8.0软件将两个序列进行拼接获得PCV-2全基因组。结果表明,克隆到的PCV-2全基因组长为1767bp。     

法氏囊炎病毒VP2基因高变区片段的克隆与鉴定

[目的]研究法氏囊病毒VP2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点。[方法]以接种传染性法氏囊病毒(IBDV)的鸡胚尿囊液为模板,根据Genbank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的全序列设计引物,通过RT-PCR扩增获得VP2高变区部分片段,将其克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1中,经酶切鉴定后,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)BL21,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增获得一个504bp的扩增片段,序列分析结果表明它与GenBank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的核苷酸序列同源性达99.8%,其氨基酸序列的同源性为99.4%,说明各毒株间高变区基因序列保守性很高。[结论]法氏囊炎病毒毒株在两个大小亲水区内的氨基酸都非常保守。     

猪CART mRNA全CDS区序列的克隆与表达载体的构建

选用猪为研究对象,以可卡因苯异丙胺调控转录肽(CART)作为影响猪繁殖机能的多肽,依据NCBI上登录的CARTmRNA序列设计3对特异性引物,用RT-PCR方法从下丘脑内扩增出CART mRNA的部分序列并进行序列分析;再根据扩增出的序列设计一对带酶切位点的特异性引物,用PCR方法扩增出含EcoR Ⅰ/HindⅢ酶切位...     

猪白细胞介素-2基因的克隆与表达

根据GenBank上发表的猪白细胞介素-2（Interleukin．2,IL-2）基因序列,设计1对引物。采用RT-PCR技术,以ConA刺激的猪外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出484bp的特异性片段,将其克隆入pGEM-Teasy载体。序列测定表明;扩增片段为猪IL-2基因,该基因与GenBank上发表的猪IL-2基因的核苷酸序列同源性达99．8％。将其定向克隆至原核表达载体pET32a,构建了表达重组猪IL-2的基因工程菌株,经IPTG诱导表达和层析纯化,获得了纯化的重组猪IL-2蛋白。     

偃麦草E染色体组特异RAPD和SCAR标记的建立

用100条10碱基随机引物，以普通小麦中国春，中间偃麦草为材料进行RAPD分析，筛选到一个偃麦草染色体组特异引物OPF03，并从中间偃麦草中克隆了该引物的特异DNA片段OPF031291。将该片断与比萨偃麦草中的OPF031296（GenBank序号U43516）比较，同源性为88％。根据OPF031291的序列，设计了2对SCAR引物，利用OPF03和引物P3，P4对普通小麦，普通小麦－中间偃麦草的部分双二倍体，长穗偃麦草，中间偃麦草，小麦－二倍体长穗偃麦草代换系，附加系共6类材料进行了RAPD和SCAR分析，发现RAP标记OPR031291没有出现在含E^e染色体组的材料中，而标记SCAR982则出现于所有含E染色体组的材料中。说明，根据E^b染色体组特异RAPD标记转化的SCAR标记，可以同时检测小麦背景下的E^e染色体。     

甘薯抗线虫病相关基因片段克隆及序列分析初步研究

依据甜菜抗线虫病基因(Hs1pro-1)序列设计引物片段,对甘薯高抗线虫病品种金山25的总DNA进行PCR扩增,获得1条600 bp左右的特异片段.序列测定及同源性检索表明,克隆序列与甜菜的Hs1pro-1基因具有一定的同源性.