马立克氏病病毒感染鸡羽髓上皮细胞差异蛋白质组学研究

为鉴定鸡羽髓上皮细胞感染马立克氏病病毒(MDV)前后差异表达的蛋白,本研究以MDV强毒GA株人工感染SPF鸡,并通过双向电泳技术进行分析.结果显示:在病毒感染后4 d、7 d、14 d和21 d显著差异表达的蛋白点分别有2个、8个、25个和9个;而通过质谱技术鉴定出29种蛋白质,其中包括能量代谢相关蛋白、增殖和凋亡相关蛋白、细胞骨架蛋白、信号传导蛋白、转录相关蛋白、免疫相关蛋白和其他功能蛋白质.本实验首次对鸡羽髓上皮细胞感染MDV后各时期蛋白表达水平的变化进行研究,鉴定了多种差异表达蛋白质,为进一步揭示MDV与宿主的相互关系、感染性病毒粒子的成熟和致病机制提供了依据.     

传染性法氏囊病毒感染SPF雏鸡哈德尔腺和盲肠扁桃体TGF-β1 mRNA表达变化

为探索鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染对SPF雏鸡消化道和呼吸道局部黏膜免疫组织转化生长因子-β1 (TGF-β1)mRNA表达的影响,以21日龄SPF雏鸡为研究对象,应用荧光定量PCR方法,对SPF雏鸡感染IBDV后,其哈德尔腺和盲肠扁桃体中TGF-β1 mRNA表达的动态变化进行检测.结果发现,21日龄SPF雏鸡感染IBDV强毒后1～28 d,其上述局部黏膜免疫组织中TGF-β1 mRNA表达均不同程度的高于对照雏鸡,其中哈德尔腺TGF-β1 mRNA表达于病毒感染后3～28 d极显著高于对照雏鸡(P＜0.01);而盲肠扁桃体的上述被检指标于病毒感染后3～14 d极显著高于对照雏鸡(P＜0.01).表明IBDV感染所致的雏鸡免疫抑制与雏鸡消化道和呼吸道局部黏膜免疫组织TGF-β1 mRNA表达增加密切相关.本研究为进一步阐明IBDV的免疫致病机制提供了重要的参考依据.     

鸡马立克氏病病毒感染对鸡神经系统损伤的研究

为研究不同毒力的鸡马立克氏病毒(MDV)在鸡神经系统中的感染规律及其对神经系统的损伤进程,本研究选用不同毒力的血清1型MDV (MDV-1)病毒株感染4日龄的SPF鸡,在接毒后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d、25 d、28 d和35 d动态检测病毒载量的变化,并对感染后5 d和21 d的不同病毒株感染鸡的脑部和坐骨神经进行组织病理学观察。结果显示,MDV-1强毒株在SPF鸡脑部的复制能力显著高于弱毒株(p<0.05);特超强病毒株BS在脑组织中出现的时间最早,早期复制最快。但不同毒力的MDV-1株在坐骨神经处的复制能力与其毒力无直接的关系。组织病理学观察显示,在感染早期MDV-1强毒株对SPF鸡脑组织的损伤强于弱毒株;在感染后21 d,强毒株和弱毒株造成的脑部损伤存在明显的不同;而在坐骨神经处,强毒株造成的损伤明显强于弱毒株。本研究揭示了不同MDV病毒株在SPF鸡脑和坐骨神经的复制动力学特征和组织病理学特征,为MDV-1在宿主神经系统中的感染、增殖及造成的损伤提供了实验依据。     

鸡马立克氏病(MD)的特异性诊断 Ⅰ、使用已知阳性血清作免疫扩散试验诊断MD的研究

使用已知抗马立克氏病病毒(MDV)血清进行免疫扩散试验,共检查了1,933只鸡的羽髓材料,其中未感染MDV的健康鸡104只(全部阴性),实验感染MDV的鸡475只(469只阳性,占98.73％),火鸡疱疹病毒(HVT)免疫的鸡56只(全部阴性),实验感染鸡成髓细胞增生性白血病病毒(AMV)的鸡107只(全部阴性),实验感染鸡新城疫(ND)、传染性支气管炎(IB)和传染性喉气管炎(ILT)病毒的鸡各60只(全部阴性),非MD发病鸡场的鸡545只(19只阳性,占3.48％),MD发病鸡场的鸡466只(252只阳性,占54.08％)。在实验感染鸡中,MDV羽髓抗原的最早检出时间大约在感染后的第13～14天,最适检出时间大约在20～30天。临床耐过鸡的羽髓抗原检出率随时间的延长而降低。另外,把在非MD发病鸡场检出的羽髓抗原阳性鸡的抗凝全血接种于5日龄的鸡胚卵黄囊,接种后14天检查绒毛尿囊膜,在大多数接种胚中可见典型的病毒痘斑,说明羽髓抗原阳性鸡的血流中确实含有MDV;也就是说,用已知MDV阳性血清检查羽髓抗原来诊断MD的免疫扩散试验是特异而可靠的。     

鸡马立克氏病病毒在鸡淋巴细胞和羽髓中的复制动力学分析

马立克氏病（MD）是由鸡马立克氏病病毒血清1型（MDV1）引起的鸡高度接触性淋巴细胞增生性疾病,MDV1在体内的复制状况与其致病性强弱及传播能力直接相关。本实验选择近几年从国内不同地区MD暴发鸡场分离的6株MDV1强毒株、弱毒疫苗“814”株和国内标准MDV1强毒J-1株,分别人工感染SPF鸡,采用双重实时荧光定量PCR（FQ—PCR）方法,检测感染后1d～28d病毒在淋巴细胞和羽髓中的复制状况。结果显示,接种1d后即可在淋巴细胞中检测到MDV1（10^2.6 copies～10^5.2 copies／10^6 cells）;在检测期间,淋巴细胞中病毒载量略有上升的趋势,总体呈现不规律变化,而且变化并不明显。接种7d后羽髓中病毒载量开始显著增加,14d～21d达到峰值,超强毒株峰值处病毒载量可达到10^7 copies／10^6 cells,峰值期病毒载量是感染前期（1d～7d）的100～10000倍。强毒株在体内的病毒载量高于弱毒株,即复制能力高于弱毒株。研究表明,MDV1国内流行的毒株有增殖速度快,病毒载量高的新特点;MDV1致病性的高低与在其在体内的复制能力的高低呈正相关。     

沙门氏菌感染后鸡血液中核苷酸结合寡聚化结构域1基因的表达量变化分析

为了探讨核苷酸结合寡聚化结构域1(nucleotide-binding oligomerization domain containing 1,NOD1)在抗沙门氏菌感染过程中的作用,本试验采用实时荧光定量PCR的方法检测了血液中NOD1基因在转录水平的表达量变化.试验分为3组,鸡白痢沙门氏菌组、肠炎沙门氏菌组和对照组,分别在感染后1、3、5、7 d检测NOD1 mRNA的表达水平.结果显示,感染后的1~7 d,鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌感染后的表达量变化趋势不同,其中,鸡白痢沙门氏菌感染后表达量呈先上升再下降然后再上升的波浪形变化,而肠炎沙门氏菌感染后的表达量呈逐渐上升趋势.与对照组相比,血液中NOD1 mRNA的水平,在鸡白痢沙门氏菌感染后的3和7 d的表达量显著高于对照组(P <0.05),在肠炎沙门氏菌感染后的5、7 d的表达量显著高于对照组(P <0.05).提示,鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌感染后均可促进鸡血液中NOD1基因的表达,NOD1基因可能参与了机体抗沙门氏菌感染过程.     

安全性,免疫效力双重把控——鸡马立克氏病活疫苗(CVI988/Rispens株)

正鸡马立克病(Marek`s disease,MD)由疱疹病毒科的马立克氏病病毒(MDV)引起,MDV具有与宿主细胞结合的能力。鸡是MDV的自然宿主,其次火鸡、野鸡、珍珠鸡等均可自然感染。鸡MDV不易被控制是由于MDV感染鸡只会终生排毒,体内发育成熟后(2~3周)的MDV会随着髓羽根部脱落的皮屑在自然的环境中广泛传播,积存于孵化室、     

三氧化二砷对鸡马立克病病毒诱导鸡肝脏肿瘤中血管生长相关因子表达的影响

为了探讨三氧化二砷(As2O3)对马立克病病毒(MDV)诱导鸡肝脏肿瘤中血管生长相关因子表达的影响,构建了鸡马立克病病例模型,通过腹腔注射As2O3(3.0 mg/kg体重),于35 d,40 d与45 d观察临床症状及血管组织病理学改变,采用半定量RT-PCR法检测肝脏肿瘤中血管生长相关因子VEGF、KDR及bFGF mRNA表达水平。结果表明,MD病鸡肝脏肿瘤内VEGF、KDR及bFGF mRNA均高水平表达,As2O3能够下调肿瘤组织内VEGF、KDR与bFGF mRNA的表达水平,并呈现时间效应。揭示As2O3能够通过下调肝脏肿瘤组织中VEGF、KDR与bFGF mRNA的表达水平,减少血管的生成,进而抑制肿瘤生长,这是As2O3抗肿瘤作用机制之一。     

不同毒力马立克氏病病毒毒株的vIL8表达水平分析

为研究马立克氏病毒(MDV)编码的vIL8与病毒毒力的相关性,本研究用等剂量的3个不同毒力的MDV毒株(CVI988/Rispens株、GA株和RB1B株)对1日龄SPF雏鸡进行接种,接种后第4 d、7 d和10 d分别采集雏鸡的脾脏组织,提取总RNA。以鸡β-actin作为内参基因,用半定量RT-PCR法测定MDV vIL8和MDV gB基因在接种后不同时间的表达情况,进而分析vIL8的表达量与病毒毒力的关系。结果显示:不同病毒株感染后检测的不同时间均有vIL8和gB的表达,vIL8的相对表达量大于0.25,gB大于0.17;vIL8表达量与病毒毒力呈正相关,毒力越强,vIL8表达量越高,这种现象在病毒接种后的4 d和10 d较为明显;在各个不同时期,vIL8的mRNA表达量均要比gB表达量高。结果表明,vIL8与MDV毒力有一定相关性,参与MDV-1的致病过程。     

不同毒力马立克氏病病毒毒株的vlL8表达水平分析

为研究马立克氏病毒(MDV)编码的vlL8与病毒毒力的相关性,本研究用等剂量的3个不同毒力的MDV毒株(CVI988/Rispens株、GA株和RBIB株)对1日龄SPF雏鸡进行接种,接种后第4 d、7 d和10 d分别采集雏鸡的脾脏组织,提取总RNA.以鸡β-actin作为内参基因,用半定量RT-PCR法测定MDV vIL8和MDV gB 基因在接种后不同时间的表达情况,进而分析vIL8的表达量与病毒毒力的关系.结果显示:不同病毒株感染后检测的不同时间均有vIL8和gB的表达,vIL8的相对表达量大于0.25,gB大于0.17;vIL8表达量与病毒毒力呈正相关,毒力越强,vlL8表达量越高,这种现象在病毒接种后的4 d和10 d较为明显;在各个不同时期,vIL8的mRNA表达量均要比gB表达量高.结果表明,vIL8与MDV毒力有一定相关性,参与MDV-1的致病过程.     

酪氨酸磷酸酶基因ptpn11对乳腺肿瘤生长的影响

乳腺癌是威胁妇女健康和生命的头号恶性肿瘤,但其发生发展的机制及诊疗仍然没有长足的进展。蛋白酪氨酸磷酸酶11(PTPN11)是一个易于突变的基因,参与乳腺肿瘤的发生,但目前关于PTPN11调控乳腺癌的体内证据仍然缺乏。为了明确PTPN11在体内对乳腺癌发生发展的调控作用,利用大鼠乳腺肿瘤的动物模型,用PTPN11蛋白酶活性抑制剂Phps1处理,然后观察乳腺肿瘤发生的情况。结果发现Phps1处理后可延长DMBA诱导的大鼠乳腺肿瘤的潜伏期,延迟肿瘤的发生,并显著降低了DMBA诱发肿瘤的比率(P0.05),但对肿瘤生长的抑制作用不显著。证明了PTPN11参与调控体内乳腺肿瘤的发生,为理解和诊治乳腺癌提供了一个可能新的靶点。     

披碱草与野大麦及其杂种F1、BC1F1同工酶分析

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳方法,对加拿大披碱草、野大麦及其杂种F1、BC1F1幼苗的过氧化物酶（POD）和酯酶（EST）同工酶进行了分析。结果表明,杂种F1代POD同工酶谱表现为双亲的互补类型,正、反交F1的酶谱基本相同,杂种F1的EST同工酶谱亦主要表现为双亲的互补类型。杂种F1代POD和EST同工酶谱中亲本的个别酶带有丢失现象,又各产生了2条杂种带。BC1F1代POD同工酶谱的酶谱基本相同,EST酶带特征差异较大,出现双亲互补带和杂种带,并且有酶带的丢失现象。BC1代的POD和EST同工酶谱明显地受轮回亲本野大麦的影响,说明回交使野大麦的某些性状在BC1代进一步加强。聚类分析结果表明,株系P1F1-2与Y1F1-2及P1F1-6与P1F1-7有极其近的遗传关系,野大麦与BC1F1代各株系较披碱草有较近的遗传关系。POD与EST同工酶具多态性,可作为遗传标记用于杂种鉴定和目标性状植株的检测。     

5个黄牛群体垂体转录因子基因变异研究

 为了阐明云南黄牛垂体转录因子(POU1F1)基因的群体变异特征,采用DNA序列分析和PCR-RFLP技术对云南地区5个黄牛群体（3个本地群体和2个引进品种）的垂体转录因子(POU1F1)基因的第5内含子和第6外显子进行了基因克隆测序和群体变异检测分析。在5个群体中均发现存在A和B两个等位基因,在国外引进的短角牛和安格斯牛中,A等位基因为优势等位基因,其基因频率分别为0.944和0.700;而在云南的昭通黄牛、迪庆黄牛和荷斯坦奶牛中B等位基因占优势,其基因频率分别为0.645,0.727和0.917;在短角牛和安格斯牛中,BB基因型频率为0;而在云南荷斯坦奶牛中,AA基因型频率为0。在所检测的座位中,昭通黄牛、迪庆黄牛和安格斯牛具有较高的杂合度,而其他群体该座位杂合度较低。     

甲型H1N1流感病毒NS1蛋白核仁定位的研究

为研究2009年甲型H1N1流感病毒的NS1蛋白的核仁定位情况,采用RT-PCR对其NS1基因进行了扩增,将其克隆至PEGX-KG载体,构建重组质粒KG-NS1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组蛋白.然后采用GST柱亲和层析方法纯化NS1重组蛋白,免疫家兔来制备多抗,Western blot检测抗体.通过间接免疫荧光对表达不同长度NS1 (NS1-219、NS1-230、NS1-237)的3种重组流感病毒进行了核仁定位的研究,3种重组毒的NS1蛋白存在于细胞核和细胞质,但都不能定位于核仁,说明NS1蛋白的截短与否并不影响其核仁定位,其生物学意义有待于进一步研究.     

两株H1N1亚型猪流感病毒NS1蛋白抑制Ⅰ型IFN功能比较

本研究分离得到两株猪源H1N1流感病毒,通过进化树分析发现分别是欧亚类禽H1N1猪流感病毒和类鸭源H1N1猪流感病毒,为了研究两株毒株的NS1蛋白对Ⅰ型IFN产生的抑制能力,分别构建了2个毒株的NS1基因的真核表达载体,将NS1真核表达质粒、Ⅰ型IFN报告质粒与干扰素刺激质粒RIG-I共转染293T细胞,利用双荧光素酶...     

乌珠穆沁羊DGAT1、NR6A1、MAN1A1基因多态性与其生长性状的关联分析

试验旨在探究甘油二酯酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase 1,DGAT1）基因g.13504098 C>T位点、核受体辅抑制子1（nuclear receptor subfamily 6 group A member 1,NR6A1）基因g.11204707 A>C位点和α-甘露糖苷酶（alpha-mannosidase,MAN1A1）基因g.18795097 C>T位点的多态性与乌珠穆沁羊生长性状之间的关系,为高产乌珠穆沁羊分子选育提供新的遗传标记。运用Sequenom MassARRAY^®SNP技术对乌珠穆沁羊DGAT1、NR6A1和MAN1A1基因的3个多态位点g.13504098 C>T、g.11204707 A>C和g.18795097 C>T进行检测,同时利用线性混合模型分析基因型与其4、6月龄生长性状的关联性。结果显示,在这3个位点中均检测到3种基因型,具体为：g.13504098 C>T位点的基因型为：CC、CT和TT,优势基因型为CC （0.49）,优势等位基因为C （0.70）;g.11204707 A>C位点的基因型为：AA、CA和CC,优势基因型为AA （0.54）,优势等位基因为A （0.73）;g.18795097 C>T位点的基因型为：CC、TC和TT,优势基因型为TC （0.51）,优势等位基因为C （0.55）。卡方检验显示,g.13504098 C>T、g.11204707 A>C和g.18795097 C>T位点在乌珠穆沁羊群体中均处于哈代-温伯格（Hardy-Weinberg）平衡状态（P>0.05）。群体遗传学分析表明,这3个位点在乌珠穆沁羊种群中属于中度多态性（0.25<PIC<0.50）。关联分析结果显示,g.13504098 C>T位点与乌珠穆沁羊4、6月龄的体重、体高、胸围、管围及6月龄的胸宽均呈极显著相关（P<0.01）;g.11204707 A>C位点与乌珠穆沁羊4、6月龄的体高、体斜长及4月龄的体重、6月龄的胸围均呈极显著相关（P<0.01）,与6月龄的体重、管围均呈显著相关（P<0.05）;g.18795097 C>T位点与乌珠穆沁羊4月龄的体高、6月龄的胸围均呈极显著相关（P<0.01）,与4月龄的体重、胸围以及6月龄的胸宽均呈显著相关（P<0.05）。综上所述,DGAT1基因g.13504098 C>T、NR6A1基因g.11204707 A>C和MAN1A1基因g.18795097 C>T位点多态性与乌珠穆沁羊群体部分生长性状具有显著的关联性,可以作为乌珠穆沁羊遗传选育的候选分子标记。     

猪垂体特异性转录因子1基因cDNA的克隆及序列分析

本试验根据公开发表的猪POU1F1基因序列设计1对引物,提取猪垂体总RNA,通过RT-PCR方法扩增出POU1F1基因cDNA全序列,扩增产物用琼脂糖凝胶检测为预期的876 bp特异性条带。将扩增产物克隆入PTZ57R/T载体进行序列测定。经DNAStar软件分析序列与已发表序列同源性为99.7%,克隆获得的序列为进一步对猪POU1F1基因不同拼接形式功能性研究奠定了基础。     

猪流感病毒H1N1分离株HA基因的克隆与序列分析

无锡某猪场发生不同程度的猪呼吸系统疾病.对发病猪采集鼻拭子,经双抗处理后,接种鸡胚,收集24 h后死亡的鸡胚尿囊液.对一株具有血凝性的病毒分离株进行RT-PCR鉴别,结果为H1亚型流感病毒.利用RT-PCR扩增尿囊液中的流感病毒HA基因.经pGEM-T easy载体克隆、序列测定和进化树分析,结果表明,在该猪群中分离获得的该株SIV为古典型H1N1.     

新疆褐牛和中国荷斯坦牛POU1F1基因第六外显子多态性与产奶量的关联分析

以新疆褐牛和中国荷斯坦牛为研究对象.应用PCR-RFLP方法对POU1F1基因第6外显子的多态性及其与产奶量的相关性进行了分析.结果表明,新疆褐牛和中国荷斯坦牛的群体在该位点分别有2种等位基因(A/B),频率分别为0.43/0.57和0.33/0.67.B等位基因是优势等位基因.在新疆褐牛群体中,BB型个体的产奶量显著高于AA型(P<0.05).     

甲型H1N1流感病毒实验室生物风险评估

根据目前掌握的资料,从生物学特性、流行特点、临床表现以及实验室活动等方面对甲型H1N1流感病毒做了初步的风险评估,以期为从事甲型H1N1病毒有关操作的实验室做好相关的风险评估及生物安全防护工作提供依据。