猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10³～10⁴倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。     

牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

以牛支原体p80基因为靶基因,设计特异性引物与探针,优化反应体系,建立了牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR(TaqMan real-time PCR)检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性评估以及临床样本检测。结果显示,特异性试验中,牛支原体2个菌株Cq值均小于18,其余13个非牛支原体菌株Cq值均大于36;敏感性试验中,最低可检3.89拷贝/μL靶DNA,是普通PCR的10~4倍(普通PCR 3.89×10~4拷贝/μL);重复性试验中,组内、组间重复的变异系数均小于1%;44份牛的临床样品利用TaqMan real time PCR检出6份阳性(阳性率为13.64%),分离培养鉴定检出7份阳性,普通PCR检测全部阴性。本研究建立了一种敏感、特异、稳定的牛支原体TaqMan real time PCR检测方法,可用于牛支原体的快速诊断和核酸定量检测。     

牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种快速检测牛支原体(Mycoplasma bovis)的实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank中收录的牛支原体OPPD/F基因序列(登录号:AF130119),利用Primer 5.0软件设计特异性引物与TaqMan探针,以重组质粒作为绝对定量模板,构建检测牛支原体的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果显示该检测方法线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=0.994,扩增效率E=1.280。荧光定量PCR法检测的敏感性是常规PCR的10倍;特异性良好,检测9种相关细菌和病毒均为阴性;重复性好,组内及组间样本检测Ct值均小于2%。牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法较之于常规PCR方法有快速、特异性强、敏感性高、稳定性好的优点。     

鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和TaqMan探针,建立鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit, CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R²=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。     

猪鼻支原体PCR检测方法的建立

猪鼻支原体是猪鼻腔上的常在菌,引起仔猪多发性浆膜炎和关节炎,是猪场一种重要的消耗性疾病。为了对猪场中猪鼻支原体的感染和发病情况进行初步调查,建立一种可靠的PCR检测体系。方法的敏感性需满足检测要求,能与几种常见的导致猪呼吸道和多发性浆膜炎的疾病区分开。     

巢式PCR检测猪鼻支原体方法的建立及应用

应用巢式聚合酶链式反应(Nested PCR)建立了一种检测猪鼻支原体(Mycoplasmah yorhinis)的方法,试验中以酚-氯仿法制备模板DNA,根据猪鼻支原体P37序列高度保守区设计2对引物,建立Nested PCR诊断方法.在特异性检测试验中,设计的引物不能扩增出猪絮状支原体、猪滑液支原体、猪肺炎支原体、鸡毒支原体、胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原体;敏感性试验表明,第1次PCR和第2次PCR的敏感度分别为3.01 mg/L和3.01×10-4mg/L.对41份临床样品肺组织的检测中,普通PCR和巢式PCR的检出率分别为29.3％(12/41)和82.9％(34/41).结果表明,巢式PCR方法明显优于常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性,为猪鼻支原体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术.     

IBRVgB基因TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank登陆的IBRV保守基因gB序列,利用分子生物学软件Primer Express3．0分别设计2对特异引物及其相应的TaqMan探针,优化反应体系后,建立牛传染性鼻气管炎病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。本方法利用10倍稀释的标准品进行扩增确定该方法的灵敏性,通过对伪狂犬病病毒（PRV）、马立克病病毒（MDV）等检测验证特异性,并进行临床检验。结果显示,建立的IBRVgB基因TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的灵敏度为11个拷贝／μL,而且与PRV等非IBRV无交叉反应。本研究所建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏、准确、等优点,可用于IBRV的检测。     

应用PCR技术鉴定猪鼻支原体的感染

2009年8月份至2010年6月份,广西贵港市、北流市和南宁市3个规模化猪场保育猪陆续出现体温升高、关节肿大、心包炎和腹腔炎等疑似副猪嗜血杆菌病症状,部分病猪发生死亡,为了研究其病原,试验应用PCR技术对病猪肺渗出物和关节液提取的DNA模板进行细菌16S rRNA基因的PCR扩增和测序。结果表明:引起广西省3个规模猪场出现疑似副猪嗜血杆菌病症状的病原是猪鼻支原体。     

猪嗜血支原体PCR及荧光定量PCR检测方法的建立和比较

为了解猪嗜血支原体(Mycoplasma haemosuis)对猪群的感染情况并建立该病的检测方法,本研究根据GenBank登录的M.haemosuis 16S rRNA基因序列(FJ263944)设计合成PCR引物以及荧光定量PCR(FQ-PCR)引物和探针.以含16S rRNA基因的重组质粒为模板,通过对PCR反应...     

猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重PCR检测方法的建立与应用

根据猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的16S rRNA基因设计3条引物, 建立Mhp和Mhr的双重PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验,并使用建立的方法检测了临床样品和疫苗样品。结果显示该方法具有良好的特异性,最低可检测到0.66ng 的Mhp基因组DNA和0.58 ng Mhr基因组DNA,临床样品和疫苗样品检测结果与普通PCR检测结果一致。该双重PCR方法,可用于Mhp与Mhr的鉴别、诊断以及疫苗纯粹性检查,快速而准确。     

基于TaqMan探针的Real-time PCR定量检测空肠弯曲杆菌

空肠弯曲杆菌 (Campylobacterjejuni ,C .jijuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态 (Viablebutnonculturable ,VNC) ,所以传统的生化鉴定结果并不一定可靠 ,并且是一项费时而繁琐的工作。核酸检测方法的出现为空肠弯曲杆菌的检测带来了方便。在本文基于LightCycler为平台 ,建立一种基于TaqMan探针的Real_timePCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌。用该方法检测时 ,发现所有空肠弯曲杆菌 (11株 )都呈阳性 ,所有其它弯曲菌 (3株 )和其它菌株 (5株 )都是阴性。整个检测过程 6 0min内可以完成 ,检测限度为5CFU ,标准曲线的相关系数为 0 .988。结果表明荧光定量PCR方法既为空肠弯曲杆菌提供了一种特异、敏感、快速和简洁的定量检测方法 ,又为研究空肠弯曲杆菌致病机理提供了一种重要方法。     

鸡传染性喉气管炎病毒TaqMan real-time PCR检测方法的建立

为建立鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)TaqMan Real-time PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的ILTV gB基因序列设计了2对引物与一条特异性TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件的优化,特异性、敏感性以及重复性试验,证明该方法在核酸含量108拷贝/μL～101拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;能够检测初始模板中10-3EID50的病毒核酸及16拷贝的标准品;与其它相关的鸡源病毒均无交叉反应,并且批内、批间变异系数均小于2%,具有良好的重复性。该检测方法的建立为ILTV的临床检测和定量分析提供了一种快速、准确的技术手段。     

羊鞭虫病实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测羊鞭虫病实时荧光PCR方法,根据GenBank已经公布的羊鞭虫(Trichuris ovis)ITS基因序列(登录号:JF680987.1),设计特异性引物和TaqMan探针,以重组质粒作为绝对定量模板,建立检测羊鞭虫病的TaqMan实时荧光PCR方法。对反应体系的特异性、敏感性和稳定性进行评价,并用该方法对临床样品进行检测。结果显示,该检测方法线性关系良好,标准曲线的相关系数R^2=0.994,扩增效率E=1.05。该方法特异性强,与其他8种常见家畜寄生性线虫病不发生交叉反应;灵敏度高,最低检出下限为31.7拷贝/μL;重复性好,组内和组间变异系数分别为0.43%~1.04%和1.20%~1.91%,均小于2.00%。用建立的实时荧光PCR方法和显微镜检查方法分别对20份临床样品进行检测,实时荧光PCR和显微镜检查方法检出的阳性样品分别为14和9份。本研究建立的TaqMan实时荧光PCR方法能在粪便中快速、准确、灵敏检测羊鞭虫卵,为羊鞭虫病的检测和防控提供新的方法。     

A real-time polymerase chain reaction assay for the detection of Mycoplasma agalactiae

AIM: To develop a real-time PCR for the detection of Mycoplasma agalactiae, using PCR primers targeting the ma-mp81 gene.

METHODS: A group of 15 M. agalactiae isolates, 21 other Mycoplasma spp. isolates and 21 other bacterial isolates was used in evaluation of the assay.

RESULTS: All M. agalactiae isolates were detected by the assay and none of the non-target isolates was amplified. The analytical detection limit of the assay was 10 fg of purified genomic DNA and 10⁴ cfu/ml milk inoculated with M. agalactiae. When applied to goat-milk samples collected from three herds free of M. agalactiae infection, the assay had a specificity of 100%.

CONCLUSIONS: The assay would be useful in a diagnostic laboratory, providing specific, sensitive and rapid detection of M. agalactiae.     

绵羊肺炎支原体恒温热隔绝式PCR方法的建立

为建立绵羊肺炎支原体(Mo)感染疾病的现场便捷化诊断方法,本研究选择Mo高度保守区域tuf基因设计合成一对特异性引物和探针,建立了恒温热隔绝式PCR(iiPCR)方法并对其特异性、灵敏性进行评价。结果显示,建立的iiPCR方法仅对Mo的典型菌株和其临床分离菌株的DNA呈阳性结果,具有较强的特异性;对Mo基因组DNA的检出下限为24fg/μL,具有较高的敏感性。利用该方法检测临床样品,结果显示该方法可以从临床采集的羊鼻拭子及支气管拭子中检测出MoDNA,对扩增产物的测序表明检测结果具有较高的准确性。本研究建立的iiPCR方法为Mo的检测及其感染疾病的诊断提供了快速、便捷的技术手段。     

非洲猪瘟病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因核苷酸序列设计特异性引物和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)-TaqMan探针,建立了基于P72基因的LNA-TaqMan探针的ASFV荧光定量PCR方法.结果显示,所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量P...