针叶树G ID1同源基因分离鉴定与功能预测

GID1作为赤霉素(GA)受体蛋白,是GA信号通路的重要组成部分,其编码基因GID1在被子植物中已经被广泛克隆,但在针叶树种中的研究十分滞后。为了分离针叶树GA受体GID1基因并推测其功能,本研究以拟南芥GID1s序列为探针,在油松高质量参考转录组内筛选并鉴别出了油松GID1直系同源基因;基于该基因序列同源克隆了樟子松、白皮松、赤松GID1基因,通过BLAST获得了日本落叶松、火炬松、白云杉与挪威云杉的GID1-like基因;对针叶树GID1基因进行序列保守性、蛋白结构和组织表达活性分析。结果表明:针叶树种很可能只含有一个GID1基因,该基因在针叶树中具有很高的保守性;虽然与被子植物GID1之间的序列一致性较低,但其保持GA亲和活性所必需的氨基酸残基十分保守,与其下游DELLA蛋白相互作用的功能域与结构同样十分保守,推测其在针叶树GA信号转导中具有受体功能;表达分析显示GID1在挪威云杉不同组织和油松雌雄球花不同发育阶段间表达较为稳定,表明GID1可能广泛参与这些组织的发育过程,针叶树GA信号调控通路中GA受体的转录调控可能并不是核心调控机制。研究结果为GID1基因在针叶树生长发育过程中的分子调控机制研究奠定了基础。      

苹果矮化中间砧"SH6"中GID2基因的克隆及生物信息学分析

探究GID2基因在调控植物生长发育方面的作用机制.从苹果矮化砧木"SH6"中克隆到GID2-1和GID2-2基因,运用MEGA7、SWISS-MODEL、DNAMAN 7.0等生物信息学工具分析其序列、蛋白质结构;通过qRT-PCR分析GID2-1和GID2-2基因在不同激素处理下的表达情况.序列分析表明,GID2-1基因的CDS序列长度为591 bp,GID2-2为597 bp,分别编码196、198个氨基酸的蛋白质;GID2基因具有F-box结构域.qRT-PCR分析表明,在GA处理下,表达量下调;相反,在PAC处理下其表达量上调.结果表明,GID2基因可能在苹果生长发育方面发挥重要作用.     

植物赤霉素受体GID1基因的分析

从NCBI数据库在线网站搜集了赤霉素受体基因核苷酸序列,分析了所获基因的进化关系.结果表明,植物的98个GID1基因拥有共同的根系,进化为Group A、Group B、Group C和Group D 4组.Group A GID1基因在单子叶植物纲中没有GID1a、GID1b、GID1c分类现象,在双子叶植物纲中基因有简单的Group B GID1b,Group C GID1a,且GID1c聚类现象;Group D由被子植物门单子叶植物和双子叶植物及苔藓植物门小立苔藓植物的基因组成;GID1基因组在进化过程中可能出现复制突变,所有GID1基因具有相同的保守区域,可利用基因之间的保守性来克隆未知基因;102条序列归属于91种植物,尚有更多单子叶植物、裸子植物和蕨类植物的GID1基因有待克隆.     

尼罗罗非鱼Dmrt基因的序列分析

参照不同物种DM结构域设计了1对兼并引物,扩增出1条带,长约150 bp.对扩增产物进行克隆,阳性克隆采用SSCP 分析筛选不同基因片段,进一步对筛选的不同基因进行了 DNA 测序.结果获得2个不同的DmDmrt基因,采用 BLAST 方法与人类相应DmDmrt基因进行序列比对,发现其与人类相应的DmDmrt基因的氨基酸序列一致性分别为89.1% 和100.0%.根据尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的拉丁文名,按习惯将其命名为OnDmDmrt1和OnDmDmrt2.根据扩增出的DmDmrt1 DM-domain的序列设计上游引物,用3′RACE(rapid amplification of cDNA ends) 法分离和测定了DmDmrt1 cDNA的3′序列,得到1 108 bp的片段,共编码262个氨基酸,与奥利亚罗非鱼、虹鳟、新月鱼、青鳉等动物的DmDmrt1的氨基酸序列进行比较,同源性分别为99%、62%、73%和41%.     

黄独赤霉素受体基因DbGID1s克隆及生物信息学分析

【目的】克隆黄独赤霉素受体（GID1）基因DbGID1s,并对其进行生物学信息分析,为深入探究DbGID1s蛋白在黄独生长发育中的作用机制提供理论参考。【方法】采用RT-PCR技术克隆DbGID1s基因,利用生物信息学软件对其理化性质、结构域、磷酸化位点及系统发育进化进行预测分析。【结果】克隆获得4个DbGID1s基因序列,命名为DbGID1A、DbGID1B1、DbGID1B2和DbGID1C,GenBank登录号为MT648372、MT648374、MT648375和MT648373,长度分别为862、1273、1081和1164 bp,编码292、340、289和360个氨基酸残基。4个DbGID1s蛋白的分子量为32079.17~40301.83 Da,理论等电点（pI）为6.05~8.62,为不稳定的外在膜亲水性蛋白,不存在信号肽序列,其磷酸化位点主要以丝氨酸（Ser,S）为主,且4个蛋白的磷酸位点均有重合位点和突变位点,不仅具有α/β折叠水解酶超级家族羧酸脂肪酶水解活性区域,还具有激素脂肪酶（HSL）的保守结构域（HGG和GXSXG）和催化联合位点（S、D和H）。DbGID1s蛋白与其他植物GID1蛋白序列具有较高的氨基酸序列相似性,其中与山药的相似性达90%以上。【结论】DbGID1s基因具有多种植物GID1基因的基本特征,其编码的蛋白具有GID1蛋白典型的结构域,其可能参与赤霉素（GA）信号转导,调节黄独的生长发育。     

葡萄GA受体基因GID1初探及其在果实GA处理条件下的差异表达

本研究通过分析在其他植物中已经确认的GA受体基因序列,对葡萄全基因组进行BLAST比对,获得了可能编码葡萄GA受体GID1的7个基因片段序列。经过聚类分析,根据其序列特征,分别设计特异性引物,以无核白鸡心葡萄(Vitis viniferaL.cv.Centennial seedless)不同组织器官为试材提取RNA,反转成cDNA-1链后,进行半定量RT-PCR,结果显示这些基因在成叶、幼叶、花序、新梢顶尖和休眠芽中存在差异表达。以30 mg/L的GA3在盛花后12 d处理无核白鸡心果穗,并于处理后1、3和7 d(果实第1次快速生长期),33 d(缓慢生长期),49 d(果实第2次快速生长期)进行采样,提取果实RNA,半定量RT-PCR结果显示除VvGID1-4和VvGID1-5外,果实中这些推测的GID1推测基因的表达水平在GA处理条件下均有上调或下调表达,推测上述研究结果为葡萄GA受体的全基因克隆与功能验证奠定了基础。     

玉米赤霉素受体基因ZmGID1a的克隆及功能研究

为研究赤霉素(GA)受体GID (gibberellin insensitive dwarf),克隆编码玉米GID的同源基因ZmGID1a,分析其在物种间的保守性和系统进化关系。通过实时定量PCR分析该基因在玉米中的表达特性以及不同激素对该基因表达水平的影响。亚细胞定位确定蛋白在细胞核和膜上,利用酵母双杂技术分析Zm GID1a与GA负调控因子玉米DELLA-8和DELLA-9的互作。还分析了表达Zm GID1a转基因烟草的生理指标。这些结果表明Zm GID1a和其他已报道的同源蛋白功能相似。     

猪干扰素IFNE1基因克隆及重组表达载体的构建

依据电子延伸序列设计一对克隆引物,用RT-PCR法从猪胃组织扩增出猪干扰素epsilon1(IFNE1)基因的完整编码区并进行序列分析;再根据克隆的序列设计一对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出EcoRI/XhoI酶切位点的猪IFNE1片段,插入原核表达栽体,转化至宿主菌,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白.结果表明,克隆的猪IFNE1基因包含完整的开放阅读框架,长为586bp.ORF为582bp,编码193个氨基酸,与人、小鼠的同源性分别为83.6%和69.2%,推测的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为76.2%和55.2%,表达的融合蛋白分子量约为47kD.     

盐芥ThHKT1基因的克隆

以盐芥为材料,依据拟南芥AtHKT1基因的序列设计引物,扩增出盐芥中ThHKT1基因的部分序列。然后使用快速扩增(RACE)方法,从盐芥中克隆到ThHKT1基因cDNA序列。该序列全长1817bp,推测编码区长度为1503bp,编码500个氨基酸,等电点为8.82。其编码序列和氨基酸序列与拟南芥AtHKT1基因的相应序列同源性分别为82.8%和77.3%。     

猪IgGⅡB类Fc受体基因剪接异构体的克隆及序列分析

根据GenBank中猪IgGⅡB类Fc受体(swFcγ RⅡB)cDNA基因序列,利用Primer软件设计合成了1对特异性引物,应用RT-PCR技术,从猪外周血白细胞cDNA中扩增swFcγ RⅡB基因,将扩增的基因片段插入pTG19-T载体进行测序,利用DNAStar Protean软件对基因的氨基酸序列潜在抗原表位进行预测.结果表明,克隆的swFcγ RⅡB基因序列长度为951 bp,编码316个氨基酸,与已发表序列的核苷酸与氨基酸序列同源性分别为99 3%和98.3%,其胞内区多出19个氨基酸的插入,其氨基酸序列至少存在3个潜在优势抗原表位的区域.swFcγ RⅡB基因存在亚类,所克隆基因是swFcγ RⅡB基因的1种RNA剪接异构体,预示了swFcγ RⅡB基因至少存在2种RNA剪接异构体.     

条斑紫菜Rab1基因的克隆与生物信息学分析

Rab蛋白是小分子量GTP结合蛋白家族中的成员之一,它与植物抗逆性密切相关。以拟南芥Rab基因序列为探针,通过筛选条斑紫菜EST数据库中的同源序列,拼接出了其Rab1基因的含有完整开放阅读框(ORF)的cD-NA序列。根据拼接的序列设计引物,利用RT-PCR成功克隆了条斑紫菜Rab1基因的cDNA。T-A克隆后测序结果显示其cDNA含有长615bp的完整ORF,编码产物含203个氨基酸残基,分子量为22.5kDa。条斑紫菜Rab1与拟南芥Rab1聚为一类,它与多种生物的Rab1具有较高的序列一致性。     

川西高原黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C基因cDNA的克隆及序列分析（摘要）

[目的]为研究以鼠兔LDH-C4为靶蛋白的节育型鼠药奠定基础。[方法]黑唇鼠兔属于兔形目,鼠兔属,在GenBank数据库里没有兔形目物种LDH-C基因的相关序列,故采用设计简并引物的方法进行克隆。设计的3条简并引物序列为：D-Ps：5′-atgtcmacygtcaaggagcagct-3′：D-Pa1：5′-gcagayacabtgtaatcttttcc-3′;D-Pa2：5′-ttacarccacttccratyac-3′。用反转录生成的cDNA作为模板,采用巢式PCR法克隆LDH-C基因的EST,再根据EST序列设计了2条基因特异引物,采用3′RACE技术克隆LDH-C基因的3′端,2条基因特异引物为Pika-Ps1：5-cttgcccttgttgatgttgcaga-3和Pika-Ps2：5-ggatcttcaacatggcagtct-3。核酸序列的分析、拼接和相似性搜索采用Vector NTI Suite 9软件,系统发生树的构建用Mega 4.0软件,采用邻接法。[结果]黑唇鼠兔的LDH-C基因的cDNA全长1 498 bp,其中ORF长996 bp,编码332个氨基酸,3′UTR长486 bp。ORF序列比对显示LDH-C基因在大的分类单位上均很保守。系统树分析显示黑唇鼠兔的LDH-C基因和灵长类及偶蹄目的遗传距离较近,和啮齿目较远。[结论]成功的克隆得到了黑唇鼠兔的LDH-C基因的cDNA序列。     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白(CSL)作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区.利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RTPCR)结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列.应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因.多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71％以上.利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础.     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白（CSL）作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区。利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）结合cDNA末端快速扩增技术（RACE）成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列。应用美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因。多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71%以上。利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础。图5参10     

甘薯中fw2.2同源基因的PCR扩增

fw2.2是影响番茄果实重量的一个重要数量性状基因。通过其氨基酸序列的保守区设计简并引物,然后在甘薯中进行扩增,扩增出的片段大小为500bp。测序并从数据库中找到其对应EST序列,全长为751bp,其中包括5’侧翼序列、3’侧翼序列和全部编码序列,EST序列对应的氨基酸序列共190个氨基酸。甘薯与番茄fw2.2的氨基酸序列具有较高的同源性,达到56.4%,由此推断此基因可能就是甘薯中fw2.2的同源基因。     

水稻WRKY转录因子OsWRKY71的cDNA分离和表达分析

WRKY蛋白是植物中最大的转录因子家族之一,对植物的生长发育具有重要调控作用。利用SMART\|RACE\|PCR技术分离获得水稻WRKY转录因子基因（OsWRKY71）的全长cDNA序列,并进行了相关的生物信息学分析。分离到的水稻WRKY转录因子cDNA全长为1 245 bp（GenBank登录号KJ137000）,开放阅读框1 047 bp,编码348个氨基酸,分子量为3828 kDa,OsWRKY71具有WRKY转录因子家族典型的保守结构域,属于第Ⅱ组WRKY蛋白家族。系统进化分析表明,OsWRKY71氨基酸序列与禾本科作物小麦的亲缘关系最近,其中与小麦序列相似性为69%,和大麦的序列相似性为68%。荧光定量PCR检测表明,OsWRKY71在孕穗期剑叶中表达丰度最高,根中最低,具有表达的空间差异性。抗病品种‘IR28’在受到稻曲菌诱导的初期,OsWRKY71基因表达呈现先升高后下降趋势,易感品种‘甬优9号’在受到稻曲菌诱导后表达受到抑制。这些结果表明,OsWRKY71的表达对稻曲菌侵染有应答响应,很可能在水稻防御稻曲菌侵染的机制中发挥作用。     

小麦生育酚环化酶基因全长cDNA的克隆与分析

生育酚环化酶(TC)是维生素E生物合成途径中的关键酶。通过RACE-PCR得到了小麦生育酚环化酶基因的cDNA序列,该基因的cDNA全长1 769bp,包含一个长为1 404bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与水稻、玉米、芝麻、马铃薯、拟南芥的生育酚环化酶基因的一致率分别为91%、88%、71%、68%、67%。系统进化分析结果表明,不同植物来源的生育酚环化酶基因聚为3类。     

水曲柳结构域重新甲基化酶DRM基因片段的克隆及同源性分析

[目的]克隆并分析水曲柳结构域重新甲基化酶（DRM）基因片段.[方法]根据GenBank上已发表的DRM氨基酸序列,采取CODEHOP方法设计合成1对简并引物,采用RT-PCR技术对水曲柳DRM基因进行扩增,将PCR产物与pMD 18-T连接后转化至E.coli JM109感受态细胞,检测阳性克隆,测序并进行序列分析.[结果]克隆得到的DRM基因cDNA序列长802 bp,由267个氨基酸残基组成,命名为FmadrmA.序列比对表明FmadrmA与参考的12个物种的DRM在氨基酸水平上表现出较高的同源性,其与山葡萄、番茄、黄瓜、野草莓、大豆、苜蓿、玉米、烟草、拟南芥、毛果杨、水稻和乌拉尔图小麦的DRM同源性分别为61％、54％、51％、50％、60％、48％、43％、44％、37％、42％、42％和39％.系统进化树分析表明同源的DRM蛋白可大致聚为3类,而水曲柳与其他植物的亲缘关系较远.[结论]该试验成功获得了水曲柳FmadrmA基因片段,并对其进行了同源性分析,为进一步研究结构域重新甲基化酶基因及分析其表达特性奠定了基础.