中国农科院烟草所首次揭示植物蛋白质的巴豆酰化修饰

正近日,中国农业科学院烟草研究所烟草病虫害防控科研团队在烟草蛋白质翻译后修饰研究方面取得新进展,发现烟草蛋白质巴豆酰化参与细胞碳代谢等多种生物学进程。科研团队利用高质量的巴豆酰化修饰泛抗体,将烟草细胞内发生巴豆酰化的蛋白质组进行富集,通过液相二级质谱(LC-MS/MS)共鉴定到637个发生巴豆酰化的蛋白质。研究表明:这些蛋白参     

R262K点突变将紫穗槐二烯合酶变为(3R)-(E)-nerolidol合酶

倍半萜合酶家族催化单一底物法尼基焦磷酸形成近300多种链式、单环、双环和三环倍半萜烯、醇,进一步的加工修饰产生种类更加繁多的倍半萜衍生物。详细了解倍半萜合酶产物特异性性决定机制将会为倍半萜合酶的理性设计,定向生成新型化合物打下基础。本研究利用定点突变技术,对紫穗槐二烯合酶RxR基序及相关的D300位点进行了点突变,发现保守基序中R262K单点突变后其酶促反应主产物为(3R)-(E)-nerolidol,而R262L突变使酶失去活性,R264K突变则对产物比例无影响,显示保守基序中第一个精氨酸在活性中心疏水环境的维持中非常关键。D300突变结果显示此氨基酸对酶的活性维持非常必要,结合R262突变结果,推测R262和D300间的非键相互作用对酶活性的维持起重要作用。由于RxR基序在倍半萜合酶家族中非常保守,因此其作用是否具有普遍性值得进一步验证。     

培养液pH值对小鼠精子体外培养过程中活力及蛋白修饰的影响

为了探究不同pH对小鼠成熟精子体外培养过程中活力参数及蛋白修饰的影响,研究采用不同pH值(6.6~7.8)培养液培养小鼠精子2h,利用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)、蛋白免疫印迹(WB)及免疫荧光技术,分析测定小鼠精子活力参数、蛋白修饰的变化情况,并对小鼠精子磷酸化蛋白及乙酰化蛋白进行细胞亚组分定位。结果显示,pH为7.2~7.4时精子能动性(sperm motility,MOT)、平均路径速度(path velocity,VAP)、平均直线运动速度(straight line velocity,VSL)和平均曲线运动速度(curvilinear veiocity,VCL)都有较高值,pH为6.6或7.8时精子活力受到显著抑制(P0.05);培养液的pH为7.4处理组,小鼠精子蛋白磷酸化、乙酰化和琥珀酰化修饰均达到较高水平,无论pH降低(7.2)还是升高(7.4)这些蛋白修饰水平都减弱,与精子活力参数变化趋势一致;免疫荧光定位结果显示,获能组磷酸化蛋白及乙酰化蛋白荧光强度明显高于未获能组,磷酸化蛋白及乙酰化蛋白遍布精子整个鞭毛区域,其中头部核区蛋白乙酰化修饰水平较高。上述研究表明pH值7.2~7.4为小鼠精子体外培养的最适pH值范围,pH值可能通过影响精子体外培养过程中的蛋白磷酸化、乙酰化及琥珀酰化作用调节精子活力及功能。本研究对探究pH值调控哺乳动物成熟精子活力的分子机理及体外培养具有重要意义。     

小麦面筋蛋白琥珀酰化改性研究

 采用琥珀酸酐对小麦面筋蛋白进行酰化改性的研究表明 ,小麦面筋蛋白琥珀酰化的最佳反应条件为 :面筋蛋白浓度为 10 % ,反应温度为 4 0℃ ,琥珀酸酐用量为小麦面筋蛋白用量的 15 % ;琥珀酰化改性后的面筋蛋白 ,溶解度、乳化能力和起泡能力得到了提高 ,琥珀酰化小麦面筋蛋白对弱筋粉粉质特性的改善效果强于普通谷朊粉。     

旋毛虫脱氧核糖核酸酶-Ⅱ酶活及酶活性位点的鉴定

以旋毛虫新生幼虫期(NBL)脱氧核糖核酸酶-Ⅱ(DNaseⅡ)基因家族中全长序列T31D4为研究对象,对其融合蛋白的核酸酶活性进行鉴定并摸索最佳酶切条件;通过序列分析预测其关键活性氨基酸位点,同时利用基因点突变技术对所预测的位点进行验证。结果表明:旋毛虫的DNaseⅡ具有核酸酶酶切活性,最佳酶切pH为5.0,同时发现其在中性(pH 7.0)及偏碱性(pH 8.0)下仍具有活性。利用Maga2软件对包括旋毛虫在内的以及业已发现的来自38个物种的DNaseⅡ的94个氨基酸序列进行比对,发现一个所有物种DNaseⅡ均高度保守的组氨酸位点,该结果与目前国际上所预测的DNaseⅡ关键活性氨基酸位点不同,目前国际上所预测的组氨酸位点在旋毛虫的DNaseⅡ序列中并非组氨酸(H),而是丝氨酸(S)或赖氨酸(K);通过点突变技术进一步验证这个组氨酸位点才是所有物种DNaseⅡ真正的活性氨基酸位点。同时推测旋毛虫的DNaseⅡ可能为一种新类型的DNaseⅡ。     

杜洛克猪精子体外4℃保存过程中活力参数及蛋白修饰变化

为探究体外4℃保存对猪精子活力参数及蛋白修饰的影响,使用猪精液保存稀释液体外4℃保存猪精子7d,利用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)分析测定新鲜精液和保存7d后精液的精子活力指标;使用相应试剂盒检测精子中ATP水平及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性;应用蛋白免疫印迹(WB)技术,比较新鲜精液在4℃保存7d后蛋白翻译后修饰水平的变化。结果表明,猪精液体外4℃保存7d后,精子活力参数呈现下降趋势。其中,运动力(MOT)、快速前进性运动速率(PRO)、平均路径速度(VAP)、平均直线运动速率(VSL)与新鲜精液相比分别降低59.99%、37.03%、12.34%、18.97%,且差异显著(P0.05);发现精子中ATP水平和GAPDH酶活性在4℃保存7d后显著降低(P0.05),即随着体外保存时间的延长,精子细胞内的能量供应不足,代谢水平降低;猪精液4℃保存7d后精子蛋白的磷酸化和酰化修饰明显减弱,这一结果与精子活力、代谢酶活性结果的变化趋势一致。研究结果证实,在体外4℃保存条件下,可能因精子细胞内能量代谢受阻而影响了精子活力及蛋白修饰水平。因此,本研究无论对于丰富精子的能量代谢基础理论,还是对于延长猪精液低温保存时间,提高人工授精效率,均具有重要的理论和实践意义。     

高、低温催青诱导家蚕滞育发生中的蛋白质修饰

【目的】研究高、低温诱导家蚕Bombyx mori滞育发生时蚕卵蛋白质修饰的差异,为后续深入探究昆虫滞育诱导的分子机制提供参考。【方法】饲养二化性家蚕品种,筛选出稳定的受高、低温诱导滞育发生的家蚕品系。以此为材料,分别于25和15℃孵化蚕卵,敏感期和点青期取样进行表观遗传学研究,通过SDS-PAGE电泳和Western blot检测蛋白修饰的差异。【结果】高温(25℃)组蚕卵蛋白的甲基化修饰水平始终高于低温(15℃)组,点青期有显著差异;高、低温处理组之间的乙酰化修饰水平一直差异显著,在点青期高温组显著低于低温组;低温组的泛素化修饰水平始终高于高温组,尤其是发育前期;磷酸化修饰水平整体较高,但高、低温处理组之间差异不显著;丙二酰化在高、低温处理组之间没有明显差异;琥珀酰化的修饰水平始终较低,在发育后期有明显的差异修饰蛋白出现。【结论】蚕卵在25℃催青过程中蛋白质泛素化和乙酰化修饰水平与15℃低温组在全时期都存在显著差异,甲基化修饰水平在点青期存在显著差异,表明甲基化、泛素化和乙酰化修饰在家蚕早期滞育诱导过程中起作用。     

黄鳝醛酮还原酶的定点突变及对其酶活性的影响

为分析催化四联体中关键氨基酸突变对黄鳝醛酮还原酶活性的影响,本研究利用重叠PCR技术对黄鳝Eakr基因进行了A81K定点突变,将突变基因亚克隆至p ET-28a(+)构建了重组表达载体。重组载体转化BL21(DE3)菌株后经IPTG诱导,镍离子柱亲和层析获得了突变型蛋白(EakrA81K);以NADPH为辅酶,分析了突变型蛋白EakrA81K的底物谱,并比较了野生型(Eakr)和突变型蛋白(EakrA81K)对不同底物的还原活性;最后,以甲醛为底物比较了野生型和突变型蛋白的最适反应温度和最适p H。结果表明:EakrA81K对醛类物质以及中长链酮类物质具有较高的还原活性,而对醇、糖、酸类物质没有明显活性;A81K位点特异突变使得黄鳝醛酮还原酶和底物之间的亲和力显著增加,并提高了酶对大部分底物的还原活性;突变稍降低了黄鳝醛酮还原酶的酸度耐受能力但提升了该酶的温度耐受能力。这暗示着黄鳝醛酮还原酶Eakr的81位氨基酸在底物识别上具有重要作用。     

人泛素结合酶UbcH5c活性突变体的构建·纯化以及催化活性研究

[目的]构建人泛素结合酶UbcH5c的活性位点突变体S22R和F62A,同时分析这2种突变体蛋白与野生型蛋白在泛素化反应中的活性差异。[方法]通过点突变(Site-Directed Mutagenesis)的方法构建2种突变体质粒,利用0.5 mmol/L IPTG分别诱导2种突变体蛋白在大肠杆菌中进行表达;将菌体超声破碎后,依次利用阳离子交换层析法对UbcH5c突变蛋白进行分离纯化,最后利用体外泛素化酶促反应结合蛋白免疫印迹杂交的方法分析野生型UbcH5c与其活性突变体UbcH5c S22R和UbcH5c F62A在泛素化修饰上的差异。[结果]人泛素结合酶UbcH5c的2个突变体蛋白S22R、F62A的泛素化修饰程度明显弱于野生型蛋白。[结论]突变体S22R和F62A突变均不同程度的改变了人泛素结合酶UbcH5c与泛素分子之间的结合活性,即2个突变的位点中第62位苯丙氨酸残基及第22位丝氨酸残基均是UbcH5c结合泛素的关键位点,而且后者对于UbcH5c结合泛素活性的影响更大。     

氧化型辅酶NAD~+及布氏杆菌SahH活性位点对SahH催化活性的影响

[目的]本文旨在鉴定影响布氏杆菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SahH)催化S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)产生同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)的催化活性位点。[方法]将表达载体pET28a-Bru-sahH转化大肠杆菌BL21中,表达、纯化布氏杆菌SahH(Bru-SahH)蛋白,分析辅酶NAD~+、磷酸化修饰及活性位点对Bru-SahH催化活性的影响。[结果]添加NAD~+后,Bru-SahH的催化活性降低85.6%;对Bru-SahH质谱分析表明,其444位丝氨酸为可能的磷酸化位点,对该位点突变后Bru-SahH催化SAH形成HCY的活性降低85.5%;生物信息学分析表明,Bru-SahH的337位和338位氨基酸为其活性位点,分别对上述2个位点进行单突变和双突变,突变后的Bru-SahH催化活性降低90.8%以上。[结论]Bru-SahH的337、338和444位氨基酸是其催化活性位点,添加外源性NAD~+可抑制其催化活性。     

3种卫矛属植物的光合及耗水特性对干旱胁迫的响应

近年来干旱频发，严重限制了城市绿化的推进。为了探究卫矛属植物中观赏价值较高的栓翅卫矛和华北卫矛的光合及耗水特性对干旱胁迫的响应，以便为城市绿化植物的选择提供依据，以1年生实生苗的青海种源栓翅卫矛（Q）、河南种源栓翅卫矛（N）和华北卫矛（H）为试验材料，通过人工模拟水分胁迫环境，测定不同卫矛的光合及耗水特性，并通过隶属函数分析法对干旱胁迫进行评价。结果表明：在整个干旱胁迫过程中，Q、N和H的气孔导度（G_s）、净光合速率（P_n）、蒸腾速率（T_r）和胞间CO₂浓度（C_i）均呈降低的趋势，分别降低了80.8%、89.7%、78.9%、27.8%，97.0%、96.2%、95.5%、11.3%和97.9%、92.9%、96.9%、18.9%；在不同梯度的干旱胁迫下，苗木的耗水速率日变化都只呈现一个明显的峰值，但其峰值点却发生了偏移。隶属函数结果表明，在正常水分条件下抗旱能力为H＞Q＞N，在轻度干旱下为N＞Q＞H，在重度干旱下为Q＞N＞H。综合来看，栓翅卫矛是相对高光合低耗水的树种。其中，Q在相同程度干旱胁迫下，其还能保持相对较好的气体交换和吸水能力来维持正常的生理活动。     

谷子种质资源萌发期抗旱性综合评价及抗旱指标筛选

为探究适宜的谷子抗旱性评价方法,以35个谷子品种为材料,设置0.03 mol/L PEG-6000溶液模拟干旱胁迫以及正常浇水2个处理,采用频次分析和相关性分析比较了9个与谷子萌发期抗旱性相关的指标,依据隶属函数求出最适宜的综合抗旱性鉴定标准,并以此为依据对所选品种进行聚类并划分抗旱等级。结果表明:在干旱胁迫下,受试品种谷子的发芽势、发芽率、萌发指数、根干重、根鲜重、芽干重、芽鲜重、芽长和根长均受到不同程度的抑制,干旱对发芽势的影响最大;除萌发系数以外发芽势与其余各指标均呈显著或极显著相关,通过因子分析将9个单项性状指标转化为4个因子,累计贡献率达86.74%。通过隶属函数结合聚类分析将35个谷子品种的抗旱性划分为4级,其中强抗旱型品种7个、中度抗旱型品种15个、干旱敏感型品种9个和干旱极敏感型品种4个。通过回归分析建立了可准确评估谷子萌发期抗旱性的回归方程y=-0.187+0.554x_RBDW+0.550x_RRL+0.264x_RRFW,筛选出相对根鲜重、相对芽干重和相对根长作为谷子萌发期抗旱性鉴定的重要指标。干旱胁迫下,可通过测定这3个指标对不同品种谷子萌发期的耐旱性进行快速准确的鉴定及评价。     

过表达番茄Sly-miR397基因增强拟南芥的耐旱性

为研究番茄miRNA在非生物逆境胁迫下的表达模式和功能分析。利用Real-time PCR检测番茄miRNA397在非生物逆境(干旱、盐害、ABA)条件下的表达量变化,发现Sly-miR397响应这些逆境胁迫,尤其在干旱胁迫下表达最明显。故将Sly-miR397过表达载体转入拟南芥中,进行转基因功能验证。结果表明:与野生型相比,转基因拟南芥植株叶片相对含水量下降速率更缓慢,保水能力更好,且在干旱胁迫下,转基因植株的长势明显优于野生型,其最大光合效率、3种抗氧化酶活性SOD、POD、CAT均明显高于野生型,同时胁迫所产生的丙二醛含量明显低于野生型拟南芥。表明Sly-miR397能提高拟南芥对干旱胁迫的耐受性,在植物抗旱过程中起着重要作用。     

梭梭 HaNAC20基因克隆及特性分析

为深入分析 HaNAC20转录因子在梭梭抗逆机制中的作用,以梭梭［Haloxylon ammodendron(C.A.Mey.) Bunge］ HaNAC20转录因子为对象,克隆其编码基因,对其基本理化性质、所属亚族及同源基因进行生物信息学分析,使用qRT-PCR方法对 HaNAC20在模拟干旱、高盐、模拟地表高温、IAA、ABA处理下的表达量进行分析,构建表达载体,进行亚细胞定位及转录激活活性分析。结果表明：克隆得到1个编码区全长为822 bp的梭梭NAC转录因子家族基因,命名为 HaNAC20(登录号：KU845314),编码273个氨基酸。系统发育树显示 HaNAC20属于NAC家族中与非生物胁迫相关的SNAC亚族。核定位信号预测及亚细胞定位结果表明 HaNAC20定位于细胞核内。表达量分析结果显示：在模拟干旱、高盐、模拟地表高温、IAA、ABA处理下, HaNAC20表达量均显著上调。转录激活分析结果显示该转录因子C端具有转录激活活性。表明 HaNAC20基因在梭梭响应非生物逆境胁迫、提高梭梭抗逆性中发挥重要作用。     

土壤自然干旱及复水对通关藤抗旱能力的影响

以通关藤为材料,设计4个实验处理组,分析通关藤在干旱胁迫及复水后抗旱生理指标的变化,为通关藤的仿野生栽培提供理论指导。结果表明,脯氨酸及可溶性糖含量随着胁迫程度的加剧,呈"先升高后降低"的变化趋势,2个指标均在第8天时达到最大值,各胁迫处理的含量均显著高于对照;MDA含量呈"先升高后降低再升高"的趋势,胁迫第8~12天时MDA含量显著低于对照;SOD和POD在整个胁迫期内活性均显著高于对照,复水后其活性有所降低,但仍高于对照。上述变化结果表明,干旱胁迫8~12 d达到通关藤抗旱高峰,随后抗旱能力下降,胁迫解除后自身修复能力较强。     

干旱胁迫对小蓬竹生理生化特性的影响

以小蓬竹幼苗为试验材料,采用人工控水的方法,设置田间持水量的60%（轻度干旱,LD）、40%（中度干旱,MD）、20%（重度干旱,SD）3个水分胁迫梯度,以田间持水量的80%为对照（CK）,研究了小蓬竹生理生化特性对水分胁迫的响应情况。结果表明,经过70 d水分胁迫试验,可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸含量,在LD条件下呈上升趋势,MD、SD条件下,上升显著,且脯氨酸含量持续累积。随着干旱胁迫的增强,MDA含量缓慢下降,质膜透性变化不明显,SOD活性变化幅度较小,CAT活性表现为先升后降趋势,但是上升幅度较小,POD活性逐渐上升。研究认为,小蓬竹通过体内的生理生化机制,尤其通过增加渗透调节物质的含量及保护酶间的协调作用,以降低膜脂过氧化程度,实现对干旱胁迫较强的忍耐性和较好的适应性。     

苹果GRF基因家族在非生物胁迫下的表达分析

GRF（Growth Regulating Factor）基因家族是一类植物特有的转录因子，它在调控植物的生长发育、渗透胁迫等方面发挥重要作用，主要通过调控细胞增殖过程促进植物组织器官的生长，提高植物对环境胁迫的适应性，因此，研究GRF基因家族在逆境条件下的表达调控具有重要意义。利用生物信息学分析和实时荧光定量PCR技术研究苹果中12个 GRF 基因在干旱、盐害和温度胁迫条件下的表达情况。结果表明：苹果MdGRFs基因参与响应非生物胁迫，干旱、盐害、高温和低温条件下MdGRFs表达量多数有明显变化。分别用干旱、盐害处理苹果幼苗后有相同的4 个MdGRFs基因呈上调表达趋势；分别用干旱、低温处理后也有4 个基因有相似的诱导表达； MdGRF05和 MdGRF07受到干旱、盐害和低温的诱导表达；盐胁迫处理后，12 个MdGRFs基因中有8个明显上调，4个明显下调；高温条件下， MdGRF04、 MdGRF05、 MdGRF07、 MdGRF09和 MdGRF11基因表达上调略明显， MdGRF02、 MdGRF03和 MdGRF10表达均下调，其中高温12 h 后，几乎检测不到 MdGRF10的表达。     

不同水分和双网无梗囊霉对黄芩生长和养分含量的影响

利用土培试验,研究不同水分条件下接种双网无梗囊霉(Acaulospora bireticulata)对黄芩(Scutellaria baicalensis)生长和养分含量的影响。结果表明,接种双网无梗囊霉能缓解水分胁迫对黄芩生长的抑制效应,显著提高黄芩干质量、株高、根冠比和菌根侵染率。接种双网无梗囊霉对植株黄芩苷含量和P、N、Mg、K、Ca、Fe、Zn、茎叶Cu含量有促进作用,明显降低了植株Mn和根部Cu含量。说明接种双网无梗囊霉,能够促进黄芩生长和矿质元素吸收,提高植株养分含量和抗旱性。     

N、P、K营养调控下橡胶实生苗的主要生物学性状表现

对3个品种(GT1、RRIM600、PR107)的橡胶实生苗进行N、P、K营养调控(N、P、K养分胁迫→恢复正常施肥→再胁迫)处理,并分析橡胶实生苗的主要生物学性状指标。结果表明:(1)橡胶实生苗在N、P、K养分调控下出现的缺素症状与橡胶成龄树相似;(2)橡胶实生苗的株高、茎粗,叶蓬距、叶面积等随着N、P、K营养调控而出现生长受阻→恢复生长→再次受阻等规律性变化;(3)橡胶实生苗的叶蓬距、叶面积对N、P、K营养调控的响应较为敏感,可作为主要观测指标;(4)开展橡胶树实生苗N、P、K营养调控研究,应在胁迫处理后新生第3蓬叶时,观测其生物学性状较为适宜。     

甘蓝型油菜WOX基因家族的鉴定与表达分析

对甘蓝型油菜WOX基因家族进行研究，利用生物信息学方法鉴定到58个家族成员，对其理化性质、系统发育树、基因结构、保守结构域、染色体位置、顺式作用元件和表达模式等进行分析，结果表明：氨基酸长度为121~397，分子质量为13 962.77~44 157.46 u，等电点为5.23~9.63，亲水性均小于0，不稳定系数为42.12~75.63，亚细胞定位在细胞核和叶绿体；系统进化树将WOX基因分为3大类和9个亚支；相同亚支的成员motif和基因结构相似或相同；除 BnWOX1、 BnWOX3、 BnWOX4、 BnWOX15、 BnWOX32、 BnWOX42、 BnWOX43、 BnWOX51、 BnWOX53 基因外，其余 49 个BnWOX基因不均匀分布在19条染色体中的18条染色体上(ChrC06 除外)，有38对串联重复基因；基因上游序列中包含转录因子结合位点、逆境响应、光响应、激素响应、分生组织调控等顺式作用元件等；各组织器官表达分析表明，BnWOX基因在根、茎尖、种子、角果中表达量较高；对WOX基因进行定量分析发现，在冷胁迫和干旱胁迫下基因表达量有显著变化，表明BnWOX基因可能在油菜响应冷/旱胁迫的调控机制中发挥着重要作用。