虹鳟传染性造血器官坏死病的防控

传染性造血器官坏死病毒是一种严重危害鲑鳟鱼类养殖的重要病原,具有传播快、发病急等特点,主要损伤鱼类的造血器官,因此称为传染性造血器官坏死病。结合国内外研究现状对其临床症状、病理损伤、流行规律、传播途径、诊断方法和预防措施进行总结,以期为该病的防控提供理论基础和实践经验。     

虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗工程菌发酵工艺研究

急性传染性造血器官坏死病(infectious hematopoietic necrosis,IHN)严重威胁虹鳟Oncorhynchus mykiss养殖业,造成严重的经济损失,核酸疫苗已成为虹鳟IHN疾病预防的研究热点。本研究首先检测虹鳟IHN核酸疫苗工程菌的遗传稳定性,结果显示工程菌在连续培养30代后,仍能保持稳定的质粒拷贝数。质粒酶切结果表明:连续培养30代后的质粒依然保持良好的完整性。在筛选高拷贝工程菌的基础上,又研究核酸疫苗的高密度发酵培养基、补料及发酵时间。结果表明:最优的发酵培养基配方为:1.2%胰蛋白胨(Tryptone)、2.4%酵母提取物(Yeast Extract)、0.5%甘油、0.017 mol·L~(-1)KH_2PO_4、0.072 mol·L~(-1)K_2HPO_4;补料配方为:3%胰蛋白胨、1.5%酵母提取物、50%甘油,最佳发酵时间为16h。本研究可为虹鳟IHN核酸疫苗的规模化生产提供参考。     

传染性造血器官坏死病核酸疫苗的构建及其在虹鳟接种部位的消长规律

本研究将传染性造血器官坏死病病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)分离株SD-12糖蛋白(glycoprotein,G)基因克隆进商业化载体pc DNA3.1(+),构建了IHNV G的表达载体,即传染性造血器官坏死病(infectious hematopoietic necrosis,IHN)核酸疫苗,命名为p IHNsd-G。采用背鳍基部肌肉注射的方式,以2μg/尾的剂量免疫虹鳟(Oncorhynchus mykiss)鱼苗(5.0±0.5)g。于免疫后第4天及第7天,利用real-time PCR技术检测免疫虹鳟头肾及接种部位肌肉组织Mx-1基因表达情况;于免疫后第21天,以100倍半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose,TCID50)采取腹腔注射的方式进行攻毒实验,计算核酸疫苗相对保护率(relative percent survival,RPS);于免疫后第60天及150天检测免疫虹鳟血清IHNV中和抗体效价;最后,以p IHNsd-G的启动子序列和氨苄青霉素抗性基因序列为目标基因,利用PCR方法监测p IHNsd-G在免疫虹鳟接种部位的动态分布情况。结果显示:Mx-1基因在头肾和接种部位肌肉中均显著上调表达,并且在接种部位肌肉组织中明显高于同一时间点的头肾组织;攻毒实验中p IHNsd-G对虹鳟的相对保护率高达94.4%;而在免疫后第60天,所有免疫虹鳟血清中均存在中和抗体,其最高效价高达320,在免疫后第150天,最高抗体效价为80,自此,说明已成功获得有效的IHN核酸疫苗。p IHNsd-G在虹鳟接种部位的PCR监测结果显示:在免疫后的第1天即可在注射部位的肌肉中检测到全部p IHNsd-G目标片段,在第84天时已经无法从注射部位肌肉中扩增出全长氨苄青霉素抗性基因,而所有目标基因在第150天时均消失不见。本研究在成功构建IHN核酸疫苗并系统地验证了其有效性的基础上,开展了该疫苗在接种部位的动态分析研究,为IHN核酸疫苗的研发和安全性评价研究提供了基础数据。     

传染性造血器官坏死病疫苗的研究进展

传染性造血器官坏死病(infectious hematopoietic necrosis,IHN)是引起鲑鳟鱼暴发性死亡的急性传染性病毒疾病.IHN分布广、传播快,每年给全球鲑鳟养殖业造成重大的经济损失.疫苗免疫是防控该病的最有效手段.本文总结了 IHN疫苗的研究进展,主要包括灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗...     

一株虹鳟源传染性胰腺坏死病病毒的分离与鉴定

为明确引起四川石棉某养殖场饲养的虹鳟患病死亡的病原体,实验对自然发病虹鳟进行大体病变观察并对其病原体进行分离,通过人工感染实验及多重RT-PCR鉴定确定病原体WZ160509,并对病原体的主要结构蛋白VP2进行扩增分析,同时对病变组织进行组织病理学观察。结果显示,患病鱼主要临床症状表现为体表发黑,腹部膨大,挤压腹部可见肛门喷射淡黄色黏液便;剖检可见肝脏、肾脏苍白;肠道内无食物,内积黄色黏液。将患病虹鳟组织匀浆液无菌接种虹鳟鱼生殖腺细胞系(rainbow trout gonad cell line,RTG-2)细胞,盲传3代均出现典型的细胞病变。人工感染实验显示死亡率高达90%,并出现与自然患病鱼相同的症状。多重RT-PCR检测发现,自然发病鱼、人工感染鱼以及病变RTG-2细胞均为传染性胰腺坏死病病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)阳性,其主要结构蛋白VP2基因与美国分离株基因组1型聚为一支,且同源性分析表明,WZ160509-VP2与IPNV-VP2(AY026345)的同源性最高,序列一致性为95.8%。组织病理学观察显示,患病鱼胰腺细胞空泡变性,坏死;肝细胞空泡变性,坏死;肾小球轻度炎症,毛细血管通透性增加,肾小囊腔内有红色絮状蛋白类物质渗出,肾小管上皮细胞空泡变性。研究表明,从该养殖场患病虹鳟中分离到的病毒为IPNV。     

传染性造血器官坏死病病毒参考蛋白的研制

为规避活病毒作参考物质存在的生物安全风险,本研究利用毕赤酵母表达系统表达了传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的糖蛋白来制备参考蛋白,作为IHNV免疫学检测参考物质。本研究选用IHNV糖蛋白基因(IHNV-G)为目的基因,根据Gen Bank中IHNV全基因序列设计特异性引物,以IHNV-uk株病毒核酸为模板,通过RT-PCR获得糖蛋白基因片段,将其克隆至真核表达载体p PICZαA,转入毕赤酵母感受态细胞GS115中,使外源基因与酵母基因融合,通过1%甲醇诱导表达外源蛋白,SDS-PAGE分析显示获得可溶性表达蛋白,分子量大于70 ku。经Western Blot和ELISA分析,该表达产物可以被IHNV多抗特异性识别。0.1531 mg的重组蛋白与0.3125TCID50 IHNV在ELISA实验中反应原性相当,–20°C可稳定保存2个月,说明其在一定程度上可替代病毒作为参考物质。该研究为IHNV ELISA检测试剂盒的开发奠定基础。     

进境鱼传播传染性造血器官坏死病风险分析模型的建立

世界动物卫生组织(OIE)将传染性造血器官坏死病(IHN)列为必须报告的动物疫病,我国将其列为二类动物疫病。本文运用风险分析理论,从危害确定(流行地区、传播方式和传染源、临床症状和潜伏期、发病机理及病理变化等)、传入概率、社会经济危害、风险管理(产地选择、时间限制、预防免疫、实验室检疫等)和风险交流(主要为检疫系统评价)等角度切入,建立了进境鱼传播IHN的风险分析模型。风险分析结果:从IHN流行地区进口一尾鲑传入IHN的概率为4.2×10-3。     

传染性造血器官坏死病灭活疫苗的制备及免疫保护效果

为了研发用于预防传染性造血器官坏死病(infectious hematopoietic necrosis,IHN)灭活疫苗,实验以不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)在胖头鱥上皮细胞(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC)上对传染性造血器官坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)进行连续传代培养,通过测定各代病毒滴度,结合病毒收获时间确定最佳增殖方案;采用不同浓度的β-丙内酯(β-propanolactone,BPL)在24℃下灭活,经安全性实验验证后确定最佳灭活条件。以不同剂量腹腔注射免疫虹鳟,以磷酸盐缓冲溶液(PBS)为阴性对照组,通过检测攻毒后相对免疫保护率(relative percent survival,RPS)、免疫相关因子表达量及血清中和抗体效价来分析该疫苗的保护效果。结果显示,最佳增殖方案为以MOI为0.000 1接种,15℃培养3 d;最佳灭活条件为以终浓度3.0 mmol/L的BPL将IHNV在24℃下灭活24 h;以最佳免疫剂量10μL/尾腹腔注射免疫虹鳟,免疫后7、21、45和60 d的相对免疫保护率分别为91.37%、84.28%、84.15%和47.5%,免疫后60 d时RPS显著低于其他时间点免疫组;免疫相关基因的实时荧光定量PCR(realtime quantitative PCR,RT-qPCR)结果显示,与阴性对照组相比,Mx-1和IFN-γ表达量在免疫后7、15和30 d脾脏和头肾中均显著上调,在第7天时达到最大值(5倍);CD4和IgM表达量在免疫后15 d脾脏和头肾中均显著上调;在免疫后第30、45和60天虹鳟血清IHNV中和抗体效价依次为67.25、43.40和29.78,呈下降趋势且各组间差异显著。研究表明,该灭活疫苗可诱导虹鳟产生特异性免疫和非特异性免疫反应,对虹鳟具有显著的免疫保护作用。本研究为IHNV灭活疫苗研发提供参考。     

国外传染性造血器官坏死病的研究概况（3）

Clark和Soriano曾报导了一些有趣的工作。他们描述了IHN病毒及两种其它鱼类的病毒(SVC和VHS)在非鱼类细胞培养物中的复制现象。这些病毒能在人体两倍体细胞株WI—38，在BHK／21以及一种或多种爬行类动物的细胞系中杂制，并产生CPE。SVS和VHS病毒在BHK／21细胞中复制的最适温度与在变温脊椎动物细胞培养物中测得的结果相一致。作者们指出，     

四川彭州地区养殖虹鳟传染性造血器官坏死病病毒的分离、鉴定及病理学观察

近期,四川省成都彭州市某虹鳟养殖场暴发流行疾病,导致养殖虹鳟死亡率高达90%。现场采样观察发现患病鱼主要症状为背部发黑,鳔壁、腹膜严重出血,心包积液,空肠、空胃和显著肠炎。同时对病鱼进行细菌学与组织病理学检测,细菌学检查结果为阴性,病理学观察发现脾脏有典型凝固性坏死,肝脏组织广泛变性、坏死,肠道黏膜下层水肿,肠上皮充血及上皮细胞脱落坏死,脑膜和心外膜水肿。将病鱼的脾组织研磨过滤除菌后,腹腔注射60尾健康虹鳟,注射组均表现为急性死亡(累计死亡率达85%),试验鱼出现与自然发病鱼相同的症状而对照组无异常。取病鱼的脾脏组织研磨过滤后接种胖头鲤细胞(fathead minnow cell,FHM),细胞感染3 d后出现典型的细胞病变效应(CPE)。针对编码IHNV糖蛋白(Glycoprotein,G)基因进行逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)检测显示,患病鱼、人工感染病鱼和病变细胞均为IHNV阳性,扩增序列与IHNV糖蛋白基因同源性为98.2%。对该病毒分离株的G基因进行系统发育分析,结果显示,该分离株与亚洲分离株聚为一簇,属于JRt基因型。     

一株传染性造血器官坏死病病毒的致病性研究

为了对分离于山东某虹鳟养殖场的一株传染性造血器官坏死病毒株(IHNV-Sn1203)进行致病性检测与研究,将该IHNV-Sn1203毒株进行虹鳟鱼苗人工回接感染实验。结果显示,8d内人工感染实验鱼累计死亡率高达100%。收集大批濒死的病鱼样本,制备病理组织切片;利用鲤上皮细胞(EPC)进行细胞感染实验、病毒电镜观察、空斑实验、病毒滴度检测和聚类分析。病理组织切片显示,该病毒可造成虹鳟造血器官广泛性坏死;细胞感染实验结果显示,接种24 h后EPC细胞出现葡萄串状典型细胞病变(cytopathic effect,CPE),72 h后大部分细胞崩解脱落形成网状孔洞;电镜下清晰可见弹状病毒粒子大量存在于细胞质内,其在EPC细胞上的滴度为108.36TCID50/mL,并能形成2~4 mm空斑。对病毒核蛋白氨基酸序列的聚类分析结果显示,该病毒与标准毒株RB-1和WRAC的同源性分别为97%和93%,与国内报道的zyx株具有最高的同源性(99%)。研究表明,IHNV-Sn1203毒株能够在鱼体及敏感细胞中稳定繁殖,产生典型病变,具有较高的病毒滴度,对虹鳟鱼苗有很高的感染性和致死性。     

虹鳟鱼的传染性造血器官坏死症

传染性造血器官坏死症(Infectious Hematopoietic Necrosis)简称“IHN”，和传染性胰脏坏死症(IPN)一样，也是由美国传入日本的一种病毒性疾病。日本首次发现是在1971年，当时发生由阿拉斯加(Alaska)引进的红大麻哈鱼卵孵出的稚鱼体。几年来这种病发展很快，已成为虹鳟养殖中一种较严重的疾病。     

传染性造血器官坏死病毒表面糖蛋白基因核酸疫苗的构建及对虹鳟血液生化指标的影响

为研究传染性造血器官坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)表面糖蛋白(glycoprotein, G)基因核酸疫苗对虹鳟免疫保护效果及血液生化指标的影响,将IHNV G基因克隆至pMD19-T载体中,连接产物在DH5α中进行转化,获取重组质粒pMD19-TG后回收G基因片段。将鉴定正确的G基因片段利用Bam H I和Xho I酶切位点克隆在真核表达载体pVAX1上,构建核酸疫苗pVAX1-G。重组质粒pVAX1-G按照8μg/尾的剂量注射虹鳟设为pVAX1-G组,同时设8μg/尾空质粒组、PBS对照组和空白组,于免疫后21 d,以100倍半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose, TCID50)通过腹腔注射的方式进行攻毒实验,计算核酸疫苗相对保护率(relative percent survival, RPS),攻毒后收集免疫虹鳟血清进行血液指标检测。结果显示,攻毒后虹鳟血清中16项指标中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)、葡萄糖(GLU)、尿素(Urea)、肌酐(CREA)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLO)与正常虹鳟相比有显著变化,空载组11项指标较pVAX1-G组变化显著;攻毒后14 d pVAX1-G组累积死亡率为19%(19/100),而空载组和PBS对照组分别为62%(62/100)和85%(85/100)。pVAX1-G核酸疫苗对虹鳟免疫保护率为78%。病理学观察发现,免疫pVAX1-G组虹鳟的肝脏、脾脏、肾脏组织未见明显损伤。综上表明,pVAX1-G作为核酸疫苗有助于减轻IHNV对虹鳟的损伤,对IHNV有较好的免疫保护效果。     

鱼类传染性造血器官坏死病临床诊断及检测

<正>鱼传染性造血器官坏死病(Infectious haematopoietic necrosis of fish,IHN)。是一种毒力很强的弹状病毒所引起的的急性、全身性的严重传染病。该病主要侵害虹鳟,包括硬头鳟、大鳞大马哈鱼、红大马哈鱼和大西洋大马哈鱼,银大马哈鱼(银鳟)在自然条件下对IHN病毒有抵抗力。     

两种检测传染性造血器官坏死病(IHNV)方法的比较

传染性造血器官坏死病(IHNV)是一种危害极其严重的鱼类疾病。本实验用一步RT-PCR法和套式PCR法对IHNV的基因进行扩增,通过扩增片段的琼脂糖电泳分析,来判定病鱼是否携带IHNV。实验结果表明,通过一步法RT-PCR可扩增出IHNV的693bp片段;通过套式PCR法可扩增出IHNV的786bp片段和323bp片段。两种方法均能够检测待测样品中含有IHNV。比较发现一步RT-PCR法比套式PCR法更加快速、简便、敏感,减少了被污染机会。     

日本对虹鳟传染性胰脏坏死症的研究

日本养殖虹鳟已有一百年历史了。进入六十年代之后，由于配合饵料研究的突破，虹鳟养殖得到很大发展，目前年产量约17，000吨左右。在鱼病研究方面也取得了一定的成绩。     

水生动物疫病病种介绍：传染性造血器官坏死

2008年农业部兽医局委托动物流行病学中组织专家编写动物疫病释义,为便于解读水生动物的疫病,本刊现将《一、二、三类动物疫病病种名录》中水生动物疫病种类的分类及各病的释义分期进行刊登。     

传染性造血器官坏死病核酸疫苗的构建及其抗性基因对环境细菌抗性的影响

本研究以传染性造血器官坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)分离株XJ-13为研究对象,克隆其糖蛋白(glycoprotein,G)基因并连接到商业化载体pcDNA3.1(+),成功构建了真核表达载体pIHNxj-G。为了检测该载体作为核酸疫苗的可能性,本研究以2μg/尾的剂量采用背鳍基部注射免疫虹鳟(Oncorhynchus mykiss)鱼苗[(5±0.5)g]。在免疫后第4天及第30天,以100 TCID_(50)的剂量利用IHNV-XJ-13对虹鳟进行腹腔注射攻毒;在免疫后第4天及第7天,利用Real-time PCR技术检测虹鳟头肾及接种部位肌肉组织Mx-1基因表达情况;在免疫后第4天及30天检测虹鳟血清IHNV中和抗体效价;在免疫后65 d内,分别于不同时间点采集循环水池里的粪便、水以及虹鳟的肠内容物,进行氨苄青霉素抗性菌的分离鉴定。攻毒试验结果显示,核酸疫苗在免疫后第4天和第30天的相对保护率均高于90%;Mx-1基因检测结果显示,Mx-1基因在头肾和接种部位肌肉中均显著上调表达;中和抗体效价测定结果显示,在免疫后第4天,所有血清中均不存在中和抗体(效价均20);而在免疫后第30天,10尾虹鳟中有8尾血清中存在中和抗体,最高效价为160;抗性菌分离结果显示,分离到的氨苄青霉素抗性菌均是天然具有氨苄青霉素抗性的气单胞菌(Aeromonas sp.)和柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.),并未分离到包括大肠杆菌在内的任何具有氨苄青霉素抗性的指示菌,且实验组和对照组的氨苄青霉素抗性菌的种类和数量均没有发生统计学意义的改变。本研究提供了具有良好保护效果的IHN核酸疫苗,并为IHN核酸疫苗的安全评价提供了基础数据。