牛瑟氏泰勒虫吉林株18S rRNA基因的扩增及系统发育研究

本研究根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,对寄生于牛体内的瑟氏泰勒虫基因组DNA进行扩增,得到1 356 bp的18S rRNA基因片段,测序后blast分析表明该虫种属牛瑟氏泰勒虫。将该基因片段序列与GenBank中8种已知泰勒虫的相应序列进行比较分析,建立系统发育树。结果表明,牛瑟氏泰勒虫吉林分离株与水牛泰勒虫亲缘关系最近,与小泰勒虫亲缘关系较远。这一结果说明宿主因素对泰勒虫的基因型影响较大。     

牛瑟氏泰勒虫HSP70 cDNA片段的克隆与系统发育分析

从血液涂片检查为牛瑟氏泰勒虫阳性的病牛血液中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出牛瑟氏泰勒虫HSP70基因,将其重组到pMD-18TSimple载体后进行克隆、序列测定及分析。结果表明该片段长1 966 bp,编码620个氨基酸残基,将该基因片段序列与GenBank中13种已知梨形虫的相应序列进行比较分析,牛瑟氏泰勒虫吉林分离株与已报道的牛瑟氏泰勒虫亲缘关系最近,其次是环形泰勒虫,与马巴贝斯虫亲缘关系较远。     

牛瑟氏泰勒虫ITS基因PCR诊断方法的建立

本试验根据GenBank上登录的牛瑟氏泰勒虫ITS基因序列(AY661522.1),应用Primer Premier 5.0和Oligo 6.31软件设计合成1对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,建立了牛瑟氏泰勒虫ITS基因PCR诊断方法。该方法扩增片段大小为1020 bp,与参考序列的同源性为98%;建立的PCR方法与猪附红细胞体、犬新孢子虫和弓形虫均无交叉反应,最低DNA检出量为1.5 pg/μL;通过对60份临床样品的检测,并与血涂片方法进行比较,结果显示PCR方法具有特异、敏感等特点,适用于牛瑟氏泰勒虫的检测。     

奶牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆及序列分析

研究根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白的基因序列设计合成1对引物,用PCR方法扩增出了牛瑟氏泰勒虫的基因片段,将该基因纯化后连接到pMDl8-T栽体上,进行序列测定和分析,并用此方法对延边某奶牛场10头奶牛进行了检测.结果表明:10份样品中9份为阳性,所扩增的目的基因核苷酸长为868 bp,共编码283个氨基酸;该段基因片段与牛泰勒虫韩国株核苷酸序列同源性为99.4%,氨基酸同源性为99.3%.     

牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆与序列分析

为分析吉林省流行的牛瑟氏泰勒虫基因序列，根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因序列设计合成一对引物，用PCR方法扩增出牛瑟氏泰勒虫的基因片段，并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-TEasy载体上，将经EcoRⅠ酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序。结果表明克隆的基因片段长度为868bp，编码283个氨基酸，有2个潜在的糖基化位点。核苷酸同源性分析表明，该基因片段与韩国株（AF521557）、日本株（AB016280）、俄罗斯株（AB016279）的核苷酸序列同源性分别为99．4％、88.0％、88．1％。     

牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70的克隆与原核表达重组质粒的构建

为了构建牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70(HSP70)基因片段原核重组表达质粒,本试验根据Gen-Bank上登录的牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70基因序列(D12692.1),应用Primer Premier 5.0软件设计合成一对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,扩增片段大小为1 692bp,与参考序列的同源性为99%。将该基因与pET-28a(+)载体进行连接,成功构建了重组表达载体pET-28a-HSP70,本试验为进一步研究牛瑟氏泰勒虫HSP70基因佐剂作用、研制基因工程疫苗奠定了基础。     

牛瑟氏泰勒虫HSP70基因的克隆及原核表达

根据GenBank(D12692.1)上发表的牛瑟氏泰勒虫HSP70基因序列设计、合成1对特异性的引物,采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫HSP70基因片段,将扩增产物与pMD18-Tsimple载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序;用pGEX-4T-1表达载体构建重组质粒pGEX-HSP70,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE、Western-blot分析。结果表明:扩增的HSP70基因与D12692.1序列同源性为99.3%;表达的融合蛋白分子质量约为68ku,而且可与牛瑟氏泰勒虫阳性血清发生特异性反应。     

新疆塔城地区马梨形虫感染的分子生物学诊断及分析

采用常规血涂片镜检和PCR技术对新疆塔城地区疑似梨形虫感染的病马进行检测。通过18S rRNA基因通用引物扩增出目的基因,克隆测序后,与GenBank公布的梨形虫18S rDNA参考序列对比分析同源性,并构建系统进化树,确定梨形虫的种属。血涂片鉴定结果显示,红细胞中发现圆环形虫体,具有马梨形虫的主要特征。分子生物学鉴定发现,18S rDNA序列与马泰勒虫美国分离株核苷酸序列同源性为98.3%;遗传进化分析发现,该虫株与已知的泰勒属在同一大枝上,与马泰勒虫美国分离株、马泰勒虫西班牙分离株有较近的亲缘关系。     

牛瑟氏泰勒虫表面蛋白p33基因的真核表达

目的构建牛瑟氏泰勒虫表面蛋白p33基因的真核表达载体。方法根据已发表的牛瑟氏泰勒虫（Thei-leria sergenti）表面蛋白p33基因的核苷酸序列设计引物,应用PCR技术从牛瑟氏泰勒虫基因组DNA中扩增p33基因片段并克隆入pMD18-Tsimple载体。进一步将该基因插入到真核表达载体pVAXⅠ,转染Hela细胞后进行RT-PCR检测和IFA检测。结果牛瑟氏泰勒虫表面蛋白p3基因成连接到pVAXⅠ载体中,并在真核细胞中有效表达。结论本研究试验为今后该基因的进一步动物试验奠定了基础。     

牛瑟氏泰勒虫重组腺病毒载体Ad-p33的构建与鉴定

为了研究并构建出牛瑟氏泰勒虫p33基因重组腺病毒载体,试验根据GenBank(D87198)上发表的牛瑟氏泰勒虫p33基因序列设计合成1对特异性引物,采用PCR技术扩增p33基因,克隆至pMD18-T Simple载体后,亚克隆到腺病毒穿梭载体pCR259中,将经酶切鉴定和PCR鉴定正确的重组穿梭质粒pCR259-p3...     

Sequence polymorphism in the ribosomal DNA internal transcribed spacers differs among Theileria species

The genomic region spanning the two ribosomal RNA internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) and the 5.8S rRNA gene was cloned and sequenced from sixteen Theileria isolates. Each Theileria species possessed ITS1 and ITS2 of unique size(s) and species specific nucleotide sequences. Varying degrees of ITS1 and ITS2 intra- and inter-species sequence polymorphism were found among ruminant Theileria species. The spacers were most polymorphic in the agent of tropical theileriosis, Theileria annulata, and were more conserved in two benign species, Theileria buffeli and Theileria sergenti Chitose. Phylogenetic analysis of the rDNA ITS1-5.8S rRNA gene-ITS2 region clearly separated each taxon, placing them in three clusters. One held T. annulata, Theileria parva, and Theileria mutans, with the latter two most closely related. The second held T. sergenti Ikeda, T. sergenti Chitose, and T. buffeli, with the latter two most closely related. The third cluster held the Theileria ovis isolates.     

牛瑟氏泰勒虫MPSP双表位基因的克隆及原核表达

为了探究表位疫苗是否可以应用于预防牛瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti),根据MPSP (Major piroplasm surface protein)基因序列(FJ515689.1)设计合成了2对引物,以T.sergenti基因组DNA为模板,通过SOE-PCR扩增出长约361 bp的双表位基因融合片段,2个表位基因通过linker (Gly4Ser)3相连.将该片段连接pGEX-4T-2,构建pGEX-4T-E1-2重组表达载体,转化BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳显示表达了约39 ku的融合蛋白.Westem blot分析表明该双表位重组蛋白可与T.sergenti阳性血清发生特异性反应,表明融合蛋白具有反应原性.     

吕氏泰勒虫主要表面蛋白P32基因的克隆与序列分析

从吕氏泰勒虫宁县株中提取RNA,用RT-PCR方法扩增主要表面蛋白P32基因的cDNA片段,克隆后测定其核苷酸序列,并推导了相应的氨基酸序列。结果表明,扩增的P32基因长度为875个核苷酸,共编码284个氨基酸。核苷酸序列与已发表的牛的4种泰勒虫的主要表面蛋白基因相比较,其与瑟氏泰勒虫俄罗斯株、日本株、中国辽阳株的核苷酸和氨基酸序列相似性均在98.9%以上。其推导的氨基酸序列中有3个糖基化位点。     

牛瑟氏泰勒虫套式PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33基因序列设计2对特异性引物,建立套式PCR检测方法。该方法与弓形虫RH株、猪附红细胞体和犬新孢子虫均无交叉反应,能检测到的最低DNA量为15 fg。在75份临床样本检测中,62份为阳性,阳性率为82.7%。由此可见所建立的套式PCR检测方法具有较高的敏感性和特异性,可用于牛瑟氏泰勒虫急性感染和隐性感染的早期诊断,为该病的临床检测、流行病学调查、进出口检疫和实验室研究提供了新的技术手段。     

牛瑟氏泰勒虫环介导等温扩增检测方法的建立

为建立快捷、灵敏的牛瑟氏泰勒虫(T.sergenti)检测方法,本研究以感染牛T.sergenti的阳性血液为试验材料,建立了牛T.sergenti P33表面蛋白基因环介导等温扩增(LAMP)检测技术,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验。结果显示,扩增产物经显色、电泳、酶切鉴定后,LAMP方法扩增牛T.sergenti产物检测管显色后呈阳性反应,最低检测量为2.3fg/μL模板DNA,比普通PCR高10倍,牛T.sergenti LAMP产物电泳后呈特征性梯状条带,而弓形虫等对照组均无扩增条带。说明本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛T.sergenti的检测。