天津滨海新区泡桐丛枝病植原体16S rDNA基因序列分析

利用分子生物学技术对天津滨海新区泡桐丛枝病病原进行分类鉴定。采用植原体16S rDNA通用引物R16mF2/R16mR1对患病植株总DNA进行PCR扩增,得到约1.4 kb特异性片段。克隆测序、Blast比对和iPhyClassifier分析结果表明,天津滨海新区泡桐丛枝植原体16S rDNA基因片段长1 432 bp,与国内泡桐丛枝植原体PY株系相似性最高,达99.86%,归属于16SrI组(aster yellows group,翠菊黄化组)D亚组。系统树构建与分析显示,泡桐丛枝病天津滨海株PaWB-TJBH与16SrI其他亚组亲缘关系较近,同在16SrI组进化枝上,与16Sr I-D组亲缘关系最近;16S rDNA序列RFLP电子酶切图谱表明,PaWB-TJBH属于16SrI-D组一个成员,与同源性比较和系统进化分析结果一致。     

海南省木豆丛枝病植原体的分子检测及鉴定

 利用植原体通用引物R16mF2/R16mR1和rp (Ⅱ) F1/rp (Ⅱ) R1对海南木豆丛枝病植原体16S rDNA和部分核糖体蛋白(ribosomal protein,rp)基因序列进行PCR扩增、克隆和测序。获得海南木豆丛枝病植原体16S rDNA基因片段为1430bp,rp基因片段为1170bp。核苷酸同源性比较和系统进化树构建表明,引起海南木豆丛枝病的植原体应属于16SrⅡ组中的亚组ⅲ。本研究首次从分子水平确定了引起我国海南木豆丛枝病的病原物为植原体,明确了其分类地位,为该病害流行学研究和防治提供了理论依据。     

竹丛枝植原体16SrDNA片段克隆与序列分析

利用植原体16SrRNA基因序列设计合成的引物,对表现丛枝的竹子植株总DNA进行直接PCR及巢式PCR扩增,得到长1.2kb的目的片段。将此片段与pGEMTEasy载体连接并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。通过酶切、PCR鉴定,对筛选得到的重组阳性克隆进行核酸序列测定及同源性比较分析,结果表明其与植原体16SrⅠ组中的西方翠菊黄化植原体(SAY)同源率为99%。依据16SrDNA序列建立了竹子丛枝病植原体株系的系统进化树。对云南竹子丛枝病植原体株系分类鉴定与已报道的结果相似。     

海南长春花黄化病植原体的16S rDNA序列分析研究

 Periwinkle(Catharanthus roseus) yellows is a common disease in Hainan. Periwinkle's leaf tissue with symptoms was assayed for phytoplasma infection by using PCR assay employing phytoplasma universal 16S rRNA gene primers (Rl6mF2/Rl6mR1). A PCR product (about 1.4 kb) was amplified from periwinkle showed yellows. Nucleotide sequencing and phylogenetic tree analysis showed that the amplified 16S rDNA contained 1 432 nucleotides, the most homology was 98.1% with the members of elm yellows group (16S r Ⅴ) and clustered in the same clade, while it was under 96.1% with other phytoplasma groups. Our results suggested that the phytoplasma sample belonged to 16S rⅤgroup and was tentatively named as Hainan periwinkle yellows phytoplasma (PY-Hn). This is the first report of existence of 16S r Ⅴ group phytoplasma in naturally infected periwinkle.     

广东花生丛枝病植原体的分子鉴定

2020年在广东省湛江市遂溪县田间发现表现明显丛枝?小叶, 类似植原体感染症状的花生病株?本研究利用分子生物学技术对其病原进行鉴定?以花生病叶的总DNA为模板, 利用植原体16S rRNA和SecY基因通用引物进行PCR扩增, 获得广东花生丛枝病植原体(PnWB-GDSX-2020)16S rRNA基因片段(1 430 bp, GenBank登录号为MZ427281)和SecY基因片段(1 709 bp, GenBank登录号为MZ437794)?序列一致性和系统进化分析显示, PnWB-GDSX-2020的16S rRNA序列与16SrⅡ-A?16SrⅡ-D和16SrⅡ-V亚组植原体一致性最高, 亲缘关系最近; 进一步利用iPhyClassifier对16S rRNA序列进行在线虚拟RFLP分析, 结果显示, PnWB-GDSX-2020的虚拟RFLP 图谱与16SrⅡ-V亚组的参照株系‘Praxelis clematidea’ phyllody phytoplasma (GenBank登录号:KY568717) 酶切图谱一致, 相似系数为1.00?因此, PnWB-GDSX-2020属于16SrⅡ-V亚组成员?所获得的PnWB-GDSX-2020 Sec Y基因序列与花生丛枝植原体的一致性最高, 亲缘关系最近?本文确定了广东花生丛枝病相关植原体的分类地位, 为当地病害诊断?检测以及防控提供科学依据?     

黄槐丛枝病植原体的检测及鉴定

 应用植原体16S rRNA基因通用引物,对自然表现丛枝的黄槐植株进行巢式PCR检测,得到约1.2 kb的特异片段,证明此植株中存在植原体.将此特异片段与pGEM-T Easy载体连接并转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中,通过PCR鉴定、序列测定及同源性比较分析,结果表明此植原体株系(STWB)16S rDNA片段G+C含量为45.8%,与榆树黄化植原体组(Elm yellows group,16SrV group)中的各株系最高同源率可达99.4%,而与其它组中的株系明显低于97.0%,故认为该植原体株系为榆树黄化植原体组中的成员之一.     

来源于湖北省枣疯病植原体分离物16S rDNA和rp基因的序列分析

以田间采集的来源于我国湖北省枣树产业主产区随州市随县种植的表现为"枣疯病"症状的枣树分离株为试材,对其16S rDNA和核糖体蛋白(ribosomal protein,rp)基因采用Nested-PCR进行扩增以及序列分析。结果表明,湖北JWB-Hubei植原体分离物16S rDNA基因的核苷酸序列与我国山东、河南等地的分离株一致率均为99%以上,在进化树中位于同一亚组的不同进化分支;虚拟RFLP图谱分析表明,JWB-Hubei属于16SrV-B亚组一个成员,与其进化树分组结果一致。JWBHubei分离株rp基因的核苷酸序列也与我国山东、陕西等地区的分离株一致率均为99%以上,在进化树中聚为同一亚组,与报道的基于RFLP分类属于rpV-C亚组的中国枣疯病分离物(JWB)聚集于同一亚组不同分支。该研究结果明确了湖北省枣疯病植原体的分类地位以及与来源于我国不同地区枣疯病分离株之间的遗传进化关系,为进一步研究植原体的株系划分、基因遗传变异研究提供了理论基础。     

紫花苜蓿丛枝病植原体的分子检测及鉴定

 利用植原体16S rRNA基因通用引物对云南昆明发生的苜蓿丛枝病感病植株总DNA进行巢式PCR扩增,得到1.2kb的特异片段,从分子水平证实了苜蓿丛枝病的病原是植原体。从PCR产物的RFLP酶切图谱可看出,该植原体株系的酶切图谱与马里兰翠菊黄化植原体(AY1)相同。对扩增片段进行克隆及序列测定后,利用最小进化法做Bootstrap验证的系统进化树,表明苜蓿丛枝病植原体为Candidatus Phytoplasma asteris成员之一,与植原体16SrI-B亚组成员关系密切。     

杏褪绿卷叶植原体新疆分离物16S rDNA基因克隆与序列分析

利用植原体16S rDNA基因通用引物对新疆轮台县疑似杏褪绿卷叶病植株总DNA进行巢氏PCR检测,扩增出大小约1.2 kb的特异性条带。对扩增产物克隆和测序,确定特异片段大小为1248 bp。序列同源性比较和系统进化分析表明,新疆杏褪绿卷叶植原体不同分离株16S rDNA基因序列同源性极高,达到99.8%~100%。与16SrⅤ组成员的同源性达到98.2%以上,其中与16SrⅤ-B亚组的枣疯病植原体山东宝山分离株,甜樱桃绿化植原体山东分离株同源性最高,达到99.4%~99.6%。进一步虚拟RFLP分析,结果表明该植原体属于榆树黄化组(16SrⅤ)的一个新的亚组,与其相似性最高的是16SrⅤ-B亚组,相似系数为0.94。本研究首次报道了新疆杏褪绿卷叶植原体16S rDNA的序列,确定了其分类地位,为杏褪绿卷叶病的早期诊断和检测提供了基础。     

臭矢菜丛枝病植原体的分子鉴定研究

 本实验采用DAPI荧光显微镜、PCR、克隆和测序等技术,对海南臭矢菜丛枝病样进行了检测和鉴定。以染病臭矢菜总DNA为模板应用3对植原体特异性引物进行PCR扩增,获得PCR产物为16S rDNA(1 430 bp)、16S-23S rDNA(358bp)、rp DNA(1 294 bp)。应用DNA回收试剂盒获得了3个PCR扩增片断的纯化产物,并克隆到DH5α大肠杆菌中测序。应用DNAMAN和MEGA软件对获得的序列与NCBI数据库中植原体序列进行同源性分析和构建系统发育树。结果显示臭矢菜丛枝病植原体与花生丛枝病植原体序列同源性最高,16S rDNA的序列同源性为99.9%,16S-23S rDNA高达100%,rp为99.7%,因而将臭矢菜丛枝病植原体归为花生丛枝组(16SrⅡ),根据16S rDNA的RFLP分析,将其归为16SrⅡ-A亚组。     

小麦蓝矮病植原体16S rDNA基因片段的比较分析

 小麦蓝矮病是陕西乃至西北冬麦麦区的一个重要病害,由介体条沙叶蝉专化性传播。对小麦蓝矮病株叶片和带毒条沙叶蝉进行超薄切片及电镜观察,在叶片韧皮部和叶蝉后肠中均观察到大量典型植原体。利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物对Rm16F2/Rm16R1,应用PCR技术从小麦蓝矮病株叶片中扩增到1.4 kb的特异片段。通过对16S rDNA基因片段序列同源性比较,结果表明小麦蓝矮病病原与三叶草绿变、翠菊黄化、绣球花绿变、草莓矮化和番茄巨芽植原体亲缘关系较近,其同源率为99.2%~99.9%。据此可以判定小麦蓝矮病植原体是属于植原体16SrⅠ组,确定了其分类地位。     

Association of aster yellows subgroup 16SrI-B phytoplasmas with a disease of Rehmannia glutinosa var. purpurea

A new phytoplasma disease of Rehmannia glutinosa var. purpurea was observed in the Czech Republic in 1998. Infected plants showing severely proliferating shoots, leaves reduced in size with vein clearing and chlorosis, shortened internodes and virescent petals died in advanced stages of the disease. Electron microscopy examination of the ultra-thin sections revealed the presence of numerous polymorphic bodies in phloem tissue of leaf midribs and petioles. The disease was successfully transmitted from infected plant via a dodder bridge into periwinkle ( Catharanthus roseus ). The phytoplasma aetiology of this disease was further confirmed by polymerase chain reaction (PCR) using universal primers R16F2/R16R2. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of amplification products indicated the presence of aster yellows related phytoplasmas (16SrI-B) in naturally infected samples of R. glutinosa var . purpurea and in symptomatic periwinkle after dodder transmission of the agent. A comparison of the amplified sequence with 17 sequences available in the GenBank confirmed the classification of the phytoplasma in the subgroup 16SrI-B. This is the first report of natural occurrence of phytoplasma-associated disease in R. glutinosa var. purpurea.     

应用电镜与PCR技术检测琯溪蜜柚黄龙病病原

福建省产区发生琯溪蜜柚叶片斑驳、果实变小及全株矮化的病树是柑桔黄龙病引起的。采用电镜技术与 PCR技术研究 ,证明其病原 BL O在形态、大小与构造上和柑桔黄龙病病原 (BL O)相同 ,其病原 DNA、PCR扩增及 Southern Blot分子杂交的结果 ,证明它与柑桔黄龙病病原 PCR的产物具有很高的同源性。本病具有传染性 ,能通过病梢嫁接传染给琯溪蜜柚的健苗。