临床健康宠物猫杯状病毒的分离鉴定及其ORF2序列分析

为了解猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)在健康猫群中的流行情况,分析病毒衣壳蛋白基因的遗传变异特性,本试验采用荧光定量PCR方法检测了8份采集自吉林省临床健康宠物猫的口腔棉拭子,利用F81细胞对检测呈阳性的样品进行病毒分离培养,通过电镜观察、PCR方法对所分离的病毒进行鉴定。结果分离到1株病毒,鉴定为猫杯状病毒,测定其ORF2基因序列全长为2 007 nt,与国内外参考毒株的核苷酸同源性为68.8%~78.4%。遗传进化分析表明,来自中国的3个分离株处于同一分支,亲缘关系较近。     

猫杯状病毒不同分离株致病性的比较

为确定猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)SH、JL-1、JL-2分离株毒力强弱,将其分别人工接种6~11周龄健康非免疫家猫,分成接种组和对照组。接种前后分别测定各组猫体温、体质量,观察发病情况及临床症状,按照欧洲药典对症状进行计分。于感染后14d麻醉处死,制备病料组织切片,观察组织器官的病理变化。结果显示,家猫感染FCV后总发病率为100%,死亡率为66.7%;SH、JL-1、JL-2组临床症状平均得分分别为8、4、9,对照组得分为1。病理解剖观察发现,猫感染FCV后,以鼻、眼分泌物增加,口腔溃疡为特征,消化道病变较轻微,肺部出现不同程度的变性、出血,呈明显病理性"肉样变";病理组织学观察发现,肺脏有数量不等的肺泡上皮细胞和巨噬细胞脱落,伴随少量纤维蛋白渗出和弥漫性肺泡损伤。结果表明,FCV SH、JL-1、JL-2分离株均有一定的致病性,其中以JL-2株的毒力最强。     

华东地区猫杯状病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了解猫杯状病毒(FCV)在中国华东地区的流行状况及其遗传变异和演化特征,本研究采集30份疑似感染FCV的猫眼鼻拭子,通过常规方法分离鉴定出9株FCV,经RT-PCR和测序获得了 FCV VP1的基因序列,与文献报道的流行株、高致病力FCV(VS-FCV)株和疫苗株VP1基因同源性进行比对及遗传进化分析.结果显示,9株...     

猫杯状病毒自然弱毒株的分离鉴定及对猫的免疫试验

在进行猫狂犬病流行病学调查时,从猫的唾液中发现了杯状病毒.通过对病毒进行分离和形态学、理化学、动物感染试验和分子生物学等鉴定,证明该病毒为猫杯状病毒(FCV)自然弱毒株.免疫试验证明,该毒株可以诱导猫产生较高水平的中和抗体,且能持续50周以上,并能抵抗FCV强毒株攻击而不发病.     

猫杯状病毒分离鉴定及其VP兽医临床1基因序列分析

为了解我国猫杯状病毒(FCV)流行情况,于2019年1月～3月从京津地区4家宠物医院收集并检测眼鼻肛拭子297份,FCV、猫疱疹病毒1型和猫泛白细胞减少症病毒阳性率分别为15.49％、30.98％、30.64％.病原学调查结果显示,未免疫的小于1岁幼猫对FCV更易感.将FCV单纯阳性病料接种于F81细胞进行病毒分离,通...     

上海市宠物猫杯状病毒、疱疹病毒及流感病毒的分离与鉴定

为了解上海市猫上呼吸道疾病病例中猫杯状病毒(FCV)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)和猫流感病毒(FIV)的感染比例及其遗传变化特点,对上海市冬季53份表现上呼吸道症状宠物猫的眼结膜、口咽和鼻黏膜拭子,进行FCV、FHV-1和FIV分离与鉴定,并对分离的病毒进行遗传进化分析.结果显示:53份样品中,FCV分离率为58.4...     

1株猫杯状病毒的分离鉴定及其ORF2序列的遗传演化分析

为了解猫杯状病毒形态特征及遗传演化情况,采用F81细胞从患病宠物猫的鼻拭子样品中分离获得1株猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV),命名为SH1.经电镜观察,病毒粒子呈球形,无囊膜,符合FCV的形态特征.采用RT-PCR方法扩增了该毒株的全基因组,并进行了序列测定和衣壳蛋白基因(ORF2)序列的分析...     

猫杯状病毒全基因组的克隆及序列分析

采用RT-PCR和重组PCR扩增了猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)CH-GD株的全基因,并进行了序列测定,用DNAStar软件对其核苷酸序列和氨基酸序列进行比较分析。结果表明,首次分离于中国广东的CH-GD株与各参考毒株有较大的差异。CH-GD株与各参考毒株之间的同源性仅为75.4%~77.1%,明显低于各参考毒株之间的同源性(78.9%~99.9%)。同时遗传进化树显示,14个分离株形成两大分支,CH-GD株独自在一分支,各分离株无明显的地域性差异。对FCV衣壳蛋白6个区(A~F)的分析结果发现,CH-GD株中A~F区的特点与报道的相符。此外还发现,CH-GD株有3个区域的3个连续的氨基酸发生了变异,与参考毒株相比,CH-GD株在这3个区域的抗原性和亲水性也都发生了相应的变化。     

猫杯状病毒分离株VP1基因序列与致病性分析

旨在了解上海地区猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)VP1基因与致病性,采用常规方法分离鉴定出13株FCV,经RT-PCR和测序获得分离株VP1的基因序列,与参考株VP1基因进行同源性和遗传演化分析,对2株分离株进行动物致病性试验。结果显示,13株上海地区分离株VP1基因核苷酸序列相互间相似性为74.3%～99.8%,与参考株核苷酸序列和氨基酸序列相似性也较低,符合FCV易突变的特征;进化树分析表明,上海地区FCV流行株主要来自国内北方地区,少数毒株来自国外地区;通过对宿主临床症状、VP1进化树和VS-FCV特征性氨基酸位点进行分析,筛选出7株FCV强毒株;动物致病性试结果验表明,FCV-SH202101株和FCV-SH202113株可导致感染猫发病和死亡,潜伏期为1～2 d,接种后第3天即可检测到排毒,不同年龄段猫的病程不一致,可导致幼猫5 d后死亡,成年猫病程可持续11～18 d, 2株分离株在致病性方面均符合VS-FCV特征。本研究丰富了中国FCV的分子流行病学资料,为VS-FCV毒株的筛选提供了有力的证据,也为FCV疫苗的研究提供了技术支持。     

一株猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及其VP2和NS1基因的变异分析

为分析当前猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)基因组遗传变异情况,对FPLV胶体金试纸条检测结果为阳性的猫粪进行病毒分离,通过血凝、分子生物学等试验对分离株进行鉴定。结果表明:病毒在CRFK细胞上盲传5代后产生明显细胞病变,电镜观察病毒粒子直径约25 nm,分离病毒的血凝效价为1∶256,将分离株命名为FPLV BJ04。基因组扩增结果显示,FPLV BJ04基因组大小为5 118 bp。决定病毒宿主范围和抗原性的VP2蛋白系统进化树分析表明,FPLV BJ04株与2017年意大利分离株KX434462株位于同一分支;分离株的VP2、NS1基因与GenBank收录的FPLV VP2、NS1基因相似性分别为99.1%～99.5%和99.0%～99.5%。动物回归试验中攻毒组猫出现临床症状和病理变化。本研究对分离的FPLV北京流行株的VP2和NS1基因进行遗传变异分析,可为更好地预防和控制FPLV提供基础。     

用PCR法检测东北虎感染猫细小病毒的研究

根据GenBank中已发表的猫细小病毒基因组中的保守序列 ,利用Goldkey软件设计了一对能扩增 750bp片段大小的引物 ,对某动物园 1只病死东北虎的脾脏样品进行了PCR检测。结果得到了与设计大小完全相符且与标准猫细小病毒扩增产物大小一致的特异核酸带 ,同时对犬瘟热、犬腺病毒、轮状病毒的核酸扩增结果均为阴性。敏感性试验表明 ,此法可检出血凝价为 1 2 8×脾脏匀浆液上清 1 0 - 5倍稀释的模板 ,远高于血凝试验的敏感性 ,为虎、狮、熊猫等野生动物细小病毒病的快速诊断提供了一个有效的方法     

6例猫杯状病毒病例的诊断及治疗

上海市某宠物店15只猫中有6只患猫出现呼吸道症状.经临床检查发现,6只患猫体温、呼吸、心率都正常;1#、2#、3#、5#和6#患猫血常规检测正常,4#患猫血常规显示有轻度脱水.对6只患猫的样品进行猫杯状病毒核酸检测和基因测序,结果均为猫杯状病毒阳性.对6只患猫进行抗菌、点眼、清洁口腔等治疗,患猫均在10～14 d内恢复...     

猫杯状病毒的分子生物学

猫杯状病毒（FCV）是猫的上呼吸道感染、口腔水疱性疾病及慢性胃炎等疾病的重要病原。该病毒具有典型的杯状病毒结构。其基因组为单股正链含polyA的RNA，全长约7．6kb，编码3个开放读码框（ORFs)。其中ORF1约5．3kb，编码1763个氨基酸（aa)的非结构蛋白；ORF2长约2．1kb，编码671aa的结构蛋白，ORF3位于基因组3‘末端，长320bp，编码106aa的蛋白。该病毒结构蛋白分子量为58－76kDa，分为6个区，各区具有特殊功能。非结构蛋白包括3C多肽，3C半胱氨酸蛋白酶和3DRNA依赖的RNA聚合酶样区等结构。FCV的基因工程疫苗研究已有一定的进并取得了相应的应用价值。FCV分子生物学的研究有助于研究该病毒的毒力和致病机理以及新型疫苗的研制。     

虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2基因的原核表达及其抗原特性

利用PCR技术从虎源猫泛白细胞减少症病毒(FPV)HLJ株细胞培养物中扩增VP2基因,测序后插入原核表达载体pGEX-6p-1构建pGEX-6p-VP2重组质粒,转化BL21(DE3)中进行诱导表达。表达蛋白经切胶法纯化,所得产物用Western blot法检测其抗原活性。以纯化的重组VP2蛋白作为抗原,通过建立检测家猫FPV自然感染抗体的间接ELISA方法来研究该蛋白作为猫科动物猫泛白细胞减少症通用诊断抗原的特性。测序结果显示:该基因全长1755bp,编码584个氨基酸。SDS-PAGE和Western blot显示表达产物以包涵体形式存在,大小约为84000(其中目的蛋白58000,GST标签26000),并具有抗原性。间接ELISA抗体检测法的应用结果显示表达的重组VP2蛋白可以作为诊断抗原用于家猫FPV自然感染抗体的间接ELISA检测。并初步证明该蛋白具有作为猫科动物猫泛白细胞减少症通用诊断抗原的特性。     

检测猫杯状病毒RT-qPCR方法的优化与应用

为建立一种通用性良好的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank上猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV) ORF1保守区域序列,设计合成1对特异性引物,用于FCV的快速检测。灵敏性试验结果显示,该方法的检测下限为4.93×10¹拷贝/μL,比普通RT-PCR检测下限高100倍;特异性试验结果显示,该检测方法与猫疱疹病毒、猫细小病毒、猫传染性腹膜炎病毒等无交叉反应;通用性试验结果显示,针对引物靶位点区间,该方法对所有已知变异位点的人工合成质粒和本实验室保存的不同变异位点的FCV毒株,均能够良好检出;重复性试验结果显示,组内的变异系数为0.09%～0.71%,组间变异系数为0.05%～0.82%,均小于1%。对23份临床样品进行检测,该方法的阳性检出率为60.9%,检出的14份阳性病料分别接种到CRFK细胞中,对细胞病变产物进行扩增并测序,BLAST对比后结果证实为FCV毒株。结果表明,本试验建立的荧光定量RT-PCR检测方法可用于FCV的快速诊断及流行病学的调查。     

嵌合猫杯状病毒F9株感染性克隆的构建及病毒拯救

为构建猫杯状病毒(FCV)弱毒株F9的感染性克隆,本研究利经PCR分段扩增了FCV各基因片段,并拼接出FCVF9全基因组序列。经测序显示,其1823位多出一个碱基造成该序列存在移码突变,经替换为pOK-2280(已构建出的FCV强毒株的感染性克隆)相应序列并对差异氨基酸逐个突变,最终获得嵌合FCVF9全基因组的重组质粒pOK-F9H。将线性化的pOK-F9H体外转录,获得的加帽RNA转染F81细胞,得到了拯救病毒rFCVF9。经过对拯救病毒与亲本病毒的蚀斑形成能力、CPE形成能力和多步生长曲线分析,结果显示rFCVF9与亲本株在复制能力和体外生长能力方面基本一致,表明构建了嵌合FCVF9株的感染性克隆并拯救出重组病毒。本研究构建的嵌合FCVF9株感染性克隆可以为FCV的基因功能研究以及新型FCV疫苗的研发奠定基础。     

广东省两株猪源戊型肝炎病毒的分离鉴定及其全基因序列分析

为进一步了解广东省近年猪戊型肝炎病毒(HEV)基因组特点及其演化情况,本研究于2010年～2011年间从广东省不同地区猪场收集的69份病猪胆汁样品中,分离得到两株猪源HEV(命名为SS19和ZS11).采用通用引物通过PCR方法扩增病毒的全基因序列.应用DNAStar和MEGA 5基因分析软件,将分离株与24株不同基因型的HEV参考序列进行核苷酸全序列比对和遗传进化分析.结果显示,分离的两株猪源HEV SS19和ZS11的核苷酸序列相似性为95.6％,两个病毒分离株与基因Ⅳ型HEV各参考病毒株核苷酸序列最为接近,其相似性分别为83.2 ％～94.5％和83.6 ％～94.6％,并且均属于基因Ⅳ型HEV.实验结果表明,广东省HEV流行病毒株仍以基因Ⅳ型为主,病毒株之间存在一定的地域局限性.     

Survival of equine herpesvirus-4, feline herpesvirus-1, and feline calicivirus in multidose ophthalmic solutions

Objective To determine survival over time of infectious equine herpesvirus‐4, feline herpesvirus‐1, and feline calicivirus in three commercially available and commonly used ophthalmic solutions (eyewash, fluorescein, and proparacaine HCl). Sample population Viruses used in this study were originally isolated from eyes of animals referred to the University of Illinois. Equine herpesvirus‐4 was propagated in MDBK cells and feline herpesvirus‐1 and feline calicivirus in CRFK cells. Procedure After separately inoculating a designated solution with a specific titer of an individual virus, solutions were incubated per manufacturer's recommendations, either at 4 °C or 25 °C. Virus titers within solutions were subsequently measured at 1, 8, and 24 h and 3, 5 and 7 days post inoculation using either plaque or TCID₅₀ assays. Results Equine herpesvirus‐4, feline herpesvirus‐1, and feline calicivirus were present in eyewash for 7 days, 5 days, and 7 days, respectively. Eyewash did not decrease survival time of any virus when compared to controls. Equine herpesvirus‐4 and feline herpesvirus‐1, both enveloped viruses, were not recovered at any time ≥ 1 h post inoculation in fluorescein. Feline calicivirus, a nonenveloped virus, was present in fluorescein for 7 days. Equine herpesvirus‐4 and feline herpesvirus‐1 did not remain infectious in proparacaine at any time ≥ 1 h post inoculation, but feline calicivirus was recovered at up to 24 h post inoculation. Conclusions Equine herpesvirus‐4, feline herpesvirus‐1, and feline calicivirus may be readily transmissible via the eyewash solution used in this study. Risk of iatrogenic transmission of the three viruses used in this study was significantly reduced in both fluorescein and proparacaine solutions. Feline calicivirus, the only nonenveloped virus evaluated, remained viable longer in both fluorescein and proparacaine solutions.