多重RT-PCR检测猪口蹄疫病毒、猪水泡病病毒和猪水疱性口炎病毒的研究

建立了一种同时检测猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪水泡病病毒(SVDV)和猪水疱性口炎病毒(VSV)三种病原体的多重RT-PCR方法。参照文献报道的基因序列,设计合成了三对特异性引物;PCR扩增条件进行优化后,用这三对引物对同一样品中的FMDV、SVDV、VSVRNA模板进行扩增,结果同时得到了三条特异性条带,大小与试验设计相符:FMDV(208bp)、SVDV(862bp)、VSV(638bp),且对猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)核酸扩增结果为阴性;三种病毒RNA模板检出的最小量均为10fg。试验证明,此方法经济、快速、敏感、特异,可用于FMDV、SVDV和VSV这三种猪水泡性疾病的鉴别诊断及流行病学调查。     

猪塞内卡病毒A、猪水疱病毒和口蹄疫病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种鉴别猪塞内卡病毒A(SVA)、猪水疱病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)的方法，针对3种病毒的基因保守区域设计引物和探针，建立了可同时检测上述3种病毒的TaqMan三重荧光定量PCR方法。该方法仅能特异性扩增SVA和FMDV病毒基因以及SVDV阳性质粒，与猪繁殖与呼吸综合征病毒、经典猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒的阳性样品cDNA或DNA无交叉反应，对3种病毒核酸的最低检出限均为10 copies/μL,组内和组间变异系数均小于4%。应用该方法对2019-2022年采集的吉林省部分地区267份病料和本实验室留存的30份猪血清样品进行检测，未检出SVA、FMDV以及SVDV。建立的三重荧光PCR方法有利于对3种病毒进行有效的流行病学调查，可给快速准确鉴别致猪水疱症状病毒性疾病提供诊断方法。     

水疱性口炎病毒RT-LAMP快速检测方法的研究

根据逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)原理,针对水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G基因序列中的6个区域设计内外各1对特异引物,建立扩增VSV糖蛋白(G)基因的RT-LAMP方法。扩增产物电泳呈特异的阶梯状条带分布,扩增产物加SYBR GREEN I染色呈特征性的黄绿色,肉眼可直接观察判定。同时,还建立了可以进行定量检测的实时RT-LAMP方法。特异性试验显示,本方法可快速检验鉴别VSV与口蹄疫病毒(FMDV)和猪水泡病病毒(SVDV)。敏感性试验显示,建立的实时RT-LAMP方法检测VSVRNA的最低检测量为0.01 PFU,比实时荧光RT-PCR显著提高。建立的LAMP方法可检测p-VSVNJ质粒DNA的最低量为6.36×10-3pg/μL(1.4×103copies/μL),比PCR也显著提高。综合表明,本研究建立RT-LAMP检测VSV的方法具有特异、敏感、快速、简便的特点,具有开发应用前景。     

印第安纳型水疱性口炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

根据印第安纳型水疱性口炎病毒（VSV）L蛋白的序列，设计了一套特异性引物，建立了检测VSV核酸的一步法RT-PCR方法，并用该法检测了不同的组织样品。结果显示，人工感染VSV小鼠组织检测为阳性，而口蹄疫、猪水疱病、猪瘟、猪生殖与呼吸综合征等病料检测均为阴性，表明该方法具有较好的特异性。     

用多重PCR鉴别猪伪狂犬病野毒与疫苗毒的研究

根据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)各基因的序列，设计了与PRV的gB、gD、gE基因序列互补的3对引物。对样品中的PRVDNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化，结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带，分别为549bp(gB)、429bp(gD)、366bp(gE)。用这3对引物对三基因缺失疫苗毒的样品DNA模板进行多次多重PCR扩增，均能稳定得到与设计相符合的2条特异性条带。敏感性试验结果表明，多重PCR可以检测到106Pg三基因缺失疫苗毒或756PgPRV野毒的核酸模板量。特异性试验结果表明，以正常对照细胞及猪圆环病毒和猪细小病毒DNA为模板进行多重PCR扩增，均无任何条带。     

实时荧光定量RT-PCR检测猪水疱病病毒的研究

按照猪水疱病病毒结构蛋白VP1基因序列,设计合成引物和探针,经各反应条件的优化,建立了实时荧光定量RT-PCR技术,对猪水疱病病毒进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,实时荧光TaqManRT-PCR可检测到每个反应相当于1×102拷贝病毒RNA;与FMDV、VSV等其他水疱性病毒不发生交叉反应;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0.993;与常规的RT-PCR比较,该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点。     

猪的水疱样疫病的流行特点调查与控制

猪的水疱样疫病是由一种或几种病原体协同感染引起猪以皮肤（多数在蹄部、口腔、鼻端和母猪乳房部）黏膜上发生水疱、浅表性溃疡等损伤为特征的具有高度传染性的急性、热性、间接接触性传染病的总称,这些病原体可能是口蹄疫病毒（FMDV）、水泡性口炎病毒（VSV）、猪水疱病病毒（SVDV）、猪痘病毒（SPV）或猪水疱疹病毒（SVEV）等。     

口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒二重RT-LAMP鉴别检测方法的建立

LAMP技术是一种快速新型的核酸检测技术,该技术利用4条引物在恒温下扩增目的 DNA,特异性好敏感性高。本试验旨在建立一种能同时鉴别诊断FMDV和VSV的二重RT-LAMP检测方法。根据口蹄疫病毒(FMDV)3D基因和水泡性口炎病毒(VSV)N基因的保守序列,设计了2套特异性引物,在每套引物的内引物中插入酶切位置EcoRⅠ,对反应条件进行了优化,建立了恒温快速的检测方法。结果显示:该方法特异性好,能检测到口蹄疫病毒的A,O,Asia1亚型和水泡性口炎的NJ和IND亚型,并与其他对照牛病原体不发生交叉反应;敏感性高,最低能够检测个100个FMDV病毒RNA和100个VSV病毒RNA;干扰性小,能同时检测两个模板的不同浓度组合。本试验建立的口蹄疫和水泡性口炎二重RT-LAMP方法具有简便、快速、特异、敏感等优点,可用于FMDV和VSV的临床检测和流行病学调查。     

多重PCR检测猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒

根据猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)3种病原体的基因保守序列，分别设计了与CSFV的E2基因、PPV的VP2基因和PRV的gⅡ基因序列互补的3对引物。用这3对引物对人为混合的样品中的PPV和PRV的DNA模板及CSFV反转录后的cDNA模板进行多重PCR扩增和多重PCR反应奈件的优化，结果同时得到3务与试验设计相符的288bp(CSFV)、575bp(PPV)700bp(PRV)特异性条带；敏感性检测结果表明，该多重PCR可以检测到14．5ng／L的CSFV、27．1pg／L的PPV、31．4ng／L的PRV的核酸模板。     

应用RT-PCR方法快速检测水泡性口炎病毒

针对水泡性口炎病毒(VSV)的两种血清型设计了2对引物，建立RT-PCR方法，用于检测VSV。VSV接种细胞出现明显的细胞病变，经RT-PCR检测为阳性，而检测口蹄疫、猪水泡病均为阴性，说明引物具有较好的特异性。     

应用多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒和桃拉病毒

研究建立了一种可同时检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)和桃拉病毒(TSV)的多重聚合酶链式反应(多重PCR)技术。根据WSSV和TSV基因序列，设计合成了2对分别与WSSV和TSV某段基因序列互补的引物，用这2对引物对同一样品中的WSSV DNA和TSV RNA模板进行多重PCR扩增。结果均同时得到了2条特异的与实验设计相符的306bp(WSSV)和231bp(TSV)多重PCR扩增带，而对其他对虾病病原的PCR扩增结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR技术能检出10pg的WSSV DNA和1pg的TSV RNA模板。     

口蹄疫病毒RT-PCR检测与血清型鉴别

针对编码非结构蛋白的3D基因合成一对引物进行口蹄疫病毒RT-PCR扩增,不同血清型病毒的RNA样本均显现一条457bp的目的带,与预期设计的长度相符合。在敏感性试验中,O型、A型和AsiaⅠ型病毒的最小RNA检出量分别为0.8ng、8ng和8ng。根据GenBank发表的口蹄疫病毒VP1和2A基因序列,采用多重RT-PCR鉴别口蹄疫病毒血清型,O型、A型和AsiaⅠ型病毒的特异性扩增片段分别为200bp、340bp和500bp。对9份乳鼠感染病料进行检测,确诊为O血清型口蹄疫病毒感染。     

PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测方法的建立及其应用

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)核苷酸序列,设计并合成能分别特异性扩增PRV、PCV-2、PPV的引物。经条件优化,建立了同时检测PRV、PCV-2、PPV的多重PCR方法,所扩增特异性产物片段大小分别为217bp、394bp、748bp。该方法不仅特异性强、敏感性高,还克服了对上述病原分别进行检测所带来的诸多弊端,为猪伪狂犬病、猪Ⅱ型圆环病、猪细小病的临床诊断和流行病学调查等研究提供了新手段。     

鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank中鸭新城疫病毒(NDV)的F基因和鸭圆环病毒(DuCV)的V1/rep基因的保守序列,各设计一对特异性引物,并对二重PCR的扩增条件进行优化,建立了鸭NDV和DuCV的二重PCR检测方法。对混合样品进行扩增,得到2条大小为493bp(鸭NDV)和218bp(DuCV)的特异性条带,与预扩增片段相符。而对番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源小鹅瘟病毒、鸭H9亚型流感病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌等病原检测,结果为阴性。该方法的敏感性试验表明,鸭NDV的核酸最小量为40fg,DuCV为20fg。     

快速鉴别诊断山羊痘病毒和羊口疮病毒二联PCR方法的建立

参照GenBmk已发表的山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORF)的核苷酸序列设计了两对引物,建立了一种可以快速鉴别山羊痘病毒和羊口疮病毒二重PCR方法,检测结果显示,对山羊痘病毒和羊口疮病毒可以分别扩增出413 bp和595 bp的特异性片段,经敏感性测定,最低能检测到4 pg的DNA。对广西的送检的山羊病料20份进行检测,其中7份可扩增出413 bp的山羊痘特异片段、1份可扩增出595 bp的羊口疮特异片段。该方法能在4 h内完成整个检测过程,不仅快速,而且特异强、敏感性高,很适合于快速诊断。     

禽四种病毒多重PCR诊断技术的建立和应用

根据禽呼肠孤病毒（ARV）、禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）和鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的基因保守区设计了4对特异性引物,建立了针对四种病毒的多重PCR检测体系,并对该体系进行了条件优化及特异性、敏感性试验。该体系扩增的四种病毒基因片断大小分别为199bp（ARV）、264bp（AIV）、362bp（NDV）和459bp（IBV）,且特异性、敏感性良好,能够检出1pgAIV和10PgARV、NDV、IBV的RNA。临床应用结果证明,该体系具有很高的实用价值和应用前景。     

Development and Application of Two-temperature RT-PCR for Detectionof Type O Foot and Mouth Disease Virus

According to the gene sequences analysis of foot and mouth disease virus (FMDV) in GenBank,a pair of specific primers was designed in the conserved sequence of type O FMDV P1 gene. The reaction parameters were optimized using the uniform design method to develop a two-temperature RT-PCR method for detection of type O FMDV.The results of sensitivity and specificity showed that the two-temperature RT-PCR method was only specific for type O FMDV without amplification of the other viruses. The amplified fragment was same with the expected length.The cloning and sequencing results revealed that the sequence of amplified fragment had 100% simililarity to the target sequence,and the minimum detection quantity was 1.665 pg/μL,the effective detection rate was consistent with the three step RT-PCR sensitivity test results. 54 taper toxicity test pigs were detected,and positive identification results and three-step PCR results was consistent.Compared with the three-step PCR,it could save 20 min.These results indicated that the developed two-temperature RT-PCR for detection of type O FMDV was a kind of accurate,rapid,specific and sensitive detection method.     

口蹄疫O型病毒二温式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

试验通过对口蹄疫病毒核苷酸序列的比对分析,在O型口蹄疫病毒的P1基因保守区,设计1对特异性引物,应用均匀设计法优化反应参数,建立口蹄疫O型病毒二温式RT-PCR检测方法。对该法进行特异性试验、敏感性试验检测。结果表明,该二温式RT-PCR方法只对口蹄疫O型病毒敏感,对其他血清型的口蹄疫病毒及常见的猪病病毒均不敏感;扩增条带与预期目的片段大小相符,扩增片段经克隆、测序发现与引物所在基因序列的同源性为100%;检测病毒RNA的敏感性为1.665 pg/μL,其敏感性与三步法PCR敏感性检测结果没有差异。运用该法对54头攻毒试验的动物进行检测,阳性鉴定结果与三步法PCR鉴定结果一致,与三步法PCR相比该法节省了20 min,表明所建立的口蹄疫O型病毒二温式RT-PCR方法是一种准确、快速、特异、敏感的检测方法。