小鼠极体重建卵母细胞的体外受精与发育

本实验分别以昆明系、ICR系和C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb系小鼠（即转绿色荧光蛋白基因小鼠,简称荧光标记小鼠）为主要试验动物,探索其卵母细胞第一极体核重组卵母细胞的生殖功能。超数排卵后采集小鼠卵丘卵母细胞复合体（COCs）,利用链霉蛋白酶酶解法分离出第一极体（PbI）;以形态学和台盼蓝染色相结合的方法对不同温度保存条件下COCs中PbI进行活力鉴定和分级;采用显微操作术将PbI核供体注射到去核卵母细胞中,卵母细胞,进一步观察重建卵母细胞体外受精和体外培养发育能力。结果表明：注射hCG后12～14h回收的PbI活力最佳, 4℃条件下保存48h 后PbI仍保持活性;117枚昆明系和ICR系小鼠重建卵母细胞经体外受精获得13枚2-细胞胚胎, 38枚荧光标记小鼠的卵母细胞中有3枚卵裂成2-细胞胚胎。本研究初步证明小鼠第一极体重建卵母细胞可持续随后受精及其早期发育过程,为发掘和利用其它哺乳动物母本基因资源提供了参考依据。     

哺乳动物第一和第二极体的研究

卵母细胞在减数分裂过程中相继排出第一和第二极体,这些极体内的染色体和留细胞内的染色体同样具有遗传和生殖潜力,可用作生产有生殖能力的后代。因此,从理论上讲用一个卵母细胞的染色体可能繁殖出４个子代。     

玉米小孢子胚胎发生的细胞形态学观察

通过观察玉米小孢子胚胎发生的细胞形态学特征,发现：离体培养条件下单核后期的花粉可以通过均等分裂和不均等分裂两条途径形成胚状体,与前人的研究结果一致。淀粉的积累,多核小孢子的液泡化以及花药壁的衰退都可影响雄核发育。将诱导培养3周的花药转移到降低蔗糖浓度、去除TZBA并附加KT的分化培养基上,有利于球形胚和梨形胚的极性分化和成熟,而发育较迟的胚状体则停止发育,趋向退化。因此胚状体之间出现明显的两极分化。     

小鼠极体重组卵母细胞的体外受精与发育

分别以昆明系、ICR系、C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb系(即转绿色荧光蛋白基因小鼠,简称荧光标记小鼠)和无标记C57BL/6J系小鼠(Mus musculus)为试验动物,探索其卵母细胞第一极体核重组卵母细胞的生殖功能.超数排卵后采集小鼠卵丘卵母细胞复合体(COCs),利用链霉蛋白酶酶解法分离出第一极体(Pb Ⅰ);以形态学和台盼蓝染色相结合的方法对不同温度保存条件下COCs中PbⅠ进行活力鉴定和分级;采用显微操作术将Pb Ⅰ核供体注射到去核卵母细胞中,进一步观察重组卵母细胞体外受精和体外培养发育能力.结果表明,注射hCG后12～14 h回收的Pb Ⅰ活力最佳,4℃条件下保存48 h后Pb Ⅰ仍保持活性;117枚昆明系和ICR系小鼠重组卵母细胞经体外受精获得13枚2-细胞胚胎,38枚荧光标记小鼠的卵母细胞中有3枚卵裂成2-细胞胚胎.初步证明小鼠第一极体重组卵母细胞可体外受精和体外早期发育,为发掘和利用家畜母本基因资源提供了参考依据.     

利用自制简易采卵器采集牛卵子并体外受精生产胚胎的初步报道

本研究利用自制的简易牛活体采卵器盲采了8头次母乳牛,共收集到12枚卵子,其中10枚卵子卵质致密均匀、卵丘细胞2－3层,1枚卵子的卵丘细胞稍微扩散,1枚卵子卵质不致密均匀、无卵丘细胞,质量好的卵子比率为83．3％（10／12）,卵子回收数为1．5枚／头／次（12／8）。9枚卵子经体外受精后卵裂率77．8%(7/9);发育形成可移植的桑椹胚和囊胚总数为3个,占总卵母细胞数的比例为33．3％（3／9）,占卵裂数的比例为42．9％（3／7）,囊胚孵化率为50％91／2）。说明了在资金缺乏的国内条件下,可以自制简易、廉价的牛活体采卵器采集具有良好发育潜力牛卵子,通过体外受精技术生产具有遗传价值的牛胚胎,用于商业用途。     

苹果离体叶片培养直接体细胞胚胎发生的形态学研究

研究了苹果离体叶片直接体细胞胚胎发生体系和外植体直接体细胞胚胎发生过程中的形态学特征。结果显示 ,苹果直接体细胞胚胎发生过程经历原胚、球形胚、心形胚、子叶形胚、成熟胚等阶段 ;子叶形胚以前的阶段没有观察到形态学多样性 ,发育至子叶形胚期的直接体细胞胚胎表现出形态学多样性 ,分别观察到一子叶胚、两子叶胚、三子叶胚、杯状胚、多子叶胚、畸形胚等 ,这些类型的胚最终都能发育成正常的成熟胚进而发育成小植株。     

牛胚胎的多代克隆

牛胚胎多代克隆的目的是通过重复细胞核移植产生大量的胚胎和牛犊。现已建立了一些重要的方法,例如：采用体外成熟的卵细胞为南受体;第二次减数分裂未期法核的先进技术;采和体外成熟,体外受精和体外培养形成的胚胎以及经冷冻保存的胚胎为核供体;核移植胚体外培养可发育至囊胚期;克隆胚可冷冻长期保存等。迄今已连续克隆６代获得囊胚期胚胎,移入受体母牛产生了第１～３代的克隆牛。从１枚牛胚胎通过３代克隆获４３枚胚胎,通过     

体细胞核移植技术生产转入溶菌酶基因(hLYZ)牛胚胎的研究

本研究主要探讨经基因修饰和筛选后转基因供体细胞的挑选及处理对牛转入溶菌酶基因克隆胚胎早期发育的影响.用含人溶菌酶基因(human lysozyme,hLYZ)乳腺特异表达载体pEBH重组质粒转染高产荷斯坦牛成纤维细胞,经G418筛选后的转基因阳性细胞作为核供体细胞成功构建了转hLYZ基因克隆胚胎.结果发现,基因转染及筛选过程对转基因重构胚的发育有不利的影响,囊胚发育率显著降低;以注核针内径为参照,挑选直径为15～20μm的转基因阳性细胞作为供体细胞,重构胚的融合率和囊胚率较其它组差异显著(分别为80.4%和33.8%,P<0.05);生长旺盛期的细胞构建的转基因克隆胚的卵裂率及囊胚发育率显著高于经血清饥饿和生长接触抑制处理组(P＜0.05);所有的转基因克隆胚在体外发育的各个发育时期都能观察到绿色荧光蛋白的表达,但表达的强弱在不同个体及相同个体不同发育时期之间存在差异.随机挑选10枚囊胚以PCR法进行鉴定,结果全部为阳性转基因胚胎.研究结果表明,利用体细胞核移植方法可以获得转舰hLYZ基因的克隆胚胎,重构胚可成功的发育到囊胚阶段;挑选生长旺盛期的直径为15～20 μm的转基因阳性细胞作为供体细胞可显著提高转基因克隆胚的融合率和囊胚率.     

不同类型的转基因细胞为核供体生产猪的转绿色荧光蛋白基因克隆胚胎

2005年我国获得了体细胞克隆猪的成功,但是在体细胞转基因克隆猪方面还处于起步阶段。猪的转基因克隆在农业和医学方面有着巨大的应用前景,在农业上可以提高猪肉品质和培育抗病猪种等;医学上可以为人类异种器官移植、疾病模型和新药筛选提供理想材料。体细胞核移植结合基因组修饰技术,是目前生产转基因家畜的一种有效方式。供体细胞的类型是影响转基因克隆效率的一个关键因素,因为供体细胞的类型决定着体细胞转基因效率和重组胚的发育潜力。目前所知,较成功用于生产转基因克隆猪的供体细胞仅限于胎儿成纤维细胞,因为它易培养、增殖期限长、重构胚的发育能力高。此外骨髓间充质细胞,一种成体干细胞,作为转基因克隆猪的供体细胞有着巨大的潜力,国内外仅有个别报道。前脂肪细胞,一种易于获得的体细胞,有报道称利用成年猪前脂肪细胞为核供体构建的克隆胚发育能力和胎儿成纤维细胞相当,并且获得了克隆猪的后代。而利用猪前脂肪细胞生产转基因克隆胚胎,将为后续组织工程研究奠定基础。因此本研究选择猪胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞为转基因克隆的供体细胞,目的是比较不同类型转基因供体细胞对生产克隆胚胎效率的影响。本研究首先建立了近交系五指山小型猪(WZSP)胎儿成纤维细胞系(FF)、新生猪骨髓间充质细胞(MSCs)系和成年猪前脂肪细胞系(PreA)。采用组织块法建立胎儿(27日龄)成纤维细胞系;髓间充质细胞从新生猪后腿骨冲取骨髓,加入到Percoll分离液中离心,吸取中间界层面细胞,贴壁法培养骨髓间充质原代细胞,培养基为低糖DMEM。对间充质细胞向脂肪细胞进行诱导分化,油红O染色鉴定;前脂肪细胞从猪的皮下脂肪取样,用0.1%胶原酶消化法建立前脂肪细胞原代细胞,并对前脂肪细胞进行诱导分化为成熟的脂肪细胞,油红O染色鉴定。为了获得转基因细胞系,利用脂质体lipofectamineTM2000(Invitrogene)介导的方法将质粒pEGFP-N1转染了胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞,经过800μg/mL G418筛选后均获得了阳性细胞株。分别以3种类型转基因和未转基因细胞为核供体进行猪的体细胞核移植,比较克隆胚胎的发育能力。结果如下:(1)比较了3种类型非转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(8.2%)、骨髓间充质细胞(7.1%)和前脂肪细胞(8.8%)囊胚发育率差异不显著(P>0.05);(2)比较了3种类型转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(9.6%)和骨髓间充质细胞(9.9%)最高,前脂肪细胞(3.7%)最低,前两者与后者差异显著(P<0.05);(3)分别比较了每一类型供体细胞转基因和非转基因对重组胚的囊胚发育率的影响,转基因对胎儿成纤维细胞(9.6%vs 8.2%)和骨髓间充质细胞(9.9%vs 7.1%)的重构胚囊胚发育率影响不大(P>0.05);前脂肪细胞转基因重组胚的囊胚发育率显著降低(3.7%vs 8.8%,P<0.05)。以上结果表明,某些供体细胞类型转基因与否对猪克隆胚胎的早期体外发育影响不明显,有些细胞类型转基因对克隆胚的发育能力影响较大。通过体细胞核移植技术,猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞可以有效地生产猪转基因囊胚,但前脂肪细胞转基因克隆胚胎的囊胚发育率能否进一步提高,还需要进一步的实验观察。     

黄牛体细胞核移植初步研究

对牛体细胞核移植的有关影响因素进行了系统研究,结果表明,电场强度为100v／mm,电脉冲2次,脉冲时间为10μs的融合率显著高于30μs的融合率,囊胚发育率差异不显著;在耳部成纤维细胞的注核微滴中添加7％乙醇可提高重组胚的卵裂率,供体细胞的预激活可提高核移植效果;TⅠ期(第二次减数分裂末期)去核卵母细胞核移植总囊胚率低于MⅠ期(第二次减数分裂中期)去核卵母细胞的,TⅠ期去核卵母细胞的核移植效果不如MⅠ期去核卵母细胞的;成纤维细胞直接注射后3h用离子霉素(5μmol／L,5min)和6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP,2mmol／L,3h)激活处理的重组胚发育率显著高于注核后0h和6h激活的重组胚,供体细胞核与受体卵母细胞激活前的胞质因子互作一段时间,有利于核移植胚胎的早期发育。     

模拟微重力对鹌鹑胚胎原始生殖细胞及内脏器官发育的影响

本实验利用回转器旋转模拟微重力的生物效应，以鹌鹑胚胎作为实验材料，研究了鹌鹑胚胎生殖腺内原始生殖细胞的数目及内脏器官的组织学变化。结果表明，回转器旋转可使早期胚胎血液和生殖腺内的原始生殖细胞数减少;生殖腺、心脏、肝脏的组织学结构发生不同程度的损伤，但对肺脏，肾脏没有太大影响。     

用冻干精子生产ICSI小鼠

前期研究中，我们采用小鼠卵母细胞胞浆内精子注射（ICSI）技术，成功地用新鲜精子获得了生理健康的ICSI小鼠。在此基础上，本文结合细胞冻干技术，进行了冻干精子ICSI生产试管小鼠的尝试。B6D2F1成年公鼠的精子在Tris-HCl-EDTA（pH8.2）溶液中冻干4 h后解冻，将其精子头注入到KM小鼠成熟卵母细胞的胞质中。6 h后，83.0%的卵子受精。用CZB溶液体外培养发现，冻干精子生产的胚胎，体外发育至2-C (92.0% vs 99.5%)、4-C（52.7% vs 97.2%）、桑椹胚（36.6% vs 86.3%）和囊胚的比例（21.4% vs 68.7%）极显著地（p<0.01）低于新鲜精子生产的ICSI胚胎。移植2-C期冻干精子ICSI胚胎检测体内发育，结果发现，D10的着床率为63.0%（17/27）；胎鼠的出生比例为21.7%（13/60），这些ICSI小鼠成年后的生理和生殖能力正常。试验结果说明，精子冻干后，仍能生产ICSI动物，冻干技术可以用于哺乳动物精子的保存。     

三种诱导马氏珠母贝四倍体方法的比较

摘要：比较了3种诱导马氏珠母贝（Pinctada martensii D.）四倍体产生的方法。①由三倍体马氏珠母贝的卵子与二倍体的精子受精，抑制受精卵第一极体的释放，诱导形成四倍体，四倍体率在D形幼虫期为27.7%～35.9%，幼虫死亡率高，在幼贝以后未能检测到四倍体的存在；②药物直接抑制二倍体马氏珠母贝受精卵第一极体和第二极体的释放，诱导四倍体；此法诱导的四倍体率在担轮幼虫期为30%以上，死亡率也较高，但在中贝（养殖7个月的贝）中检测到四倍体，四倍体率为0.0625%；③抑制二倍体马氏珠母贝受精卵的第一次卵裂形成四倍体；此法产生的四倍体马氏珠母贝在担轮幼虫期可达13.1%，但孵化率极低，早期死亡率极高，不能通过变态。比较研究表明，直接抑制二倍体马氏珠母贝受精卵的极体形成可以获得成活的四倍体马氏珠母贝，此方法值得进一步研究。     

Toxicity of seawater and sand affected by the Prestige fuel-oil spill using bivalve and sea urchin embryogenesis bioassays

An evaluation of the toxicity of seawater and sand sampled from an area of the Galician coast (NW Iberian Peninsula), highly impacted by the Prestige fuel-oil spill, was attempted by using marine invertebrate embryogenesis bioassays with bivalves and sea urchins. Water samples were frozen and toxicity testing was delayed until the reproductive season of the sea urchins. Sand samples were elutriated and tested within 13 d from sampling, using bivalves from commercial stocks. Sand elutriates were non toxic for embryos despite visual presence of small tar balls. In contrast, seawater from the most impacted site was highly toxic during the first days after the spill, with complete inhibition of embryogenesis even after 4-fold dilution. In a lower degree toxicity persisted for two months in light-exposed coastal water. These findings stress the impact to water column organisms of the less conspicuous and frequently overlooked water-accommodated fraction, rather than the more visible oil slick.     

HSP27基因在牦牛卵母细胞和体外早期胚胎中的表达

为了探讨牦牛HSP27(heat shock proteins27, HSP27)基因在牦牛卵母细胞和早期孤雌激活胚胎中的表达情况及定位,本试验通过实时荧光定量PCR检测牦牛HSP27基因在未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及孤雌激活不同时期胚胎中的相对表达量,用免疫荧光染色法检测HSP27蛋白在未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及孤雌激活不同时期胚胎中的表达与定位情况。结果显示,HSP27基因在牦牛未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及体外培养孤雌激活不同时期胚胎中均可表达,其中在未成熟卵母细胞中的表达量显著高于成熟卵母细胞;在孤雌激活胚胎中,2~4细胞期表达量最高,囊胚期胚胎表达量最低,随着胚胎的发育,HSP27的表达量呈现逐渐降低的趋势;在2~4细胞期和囊胚期胚胎中的表达与其他组表达存在显著差异性,在5~8细胞期和桑椹胚中的表达无显著差异。免疫荧光染色结果表明,HSP27蛋白在牦牛卵丘细胞和卵母细胞中均有表达,在牦牛孤雌激活2~4细胞期、5~8细胞期和桑椹期胚胎中主要表达于细胞核内和细胞质中,在囊胚期主要表达于细胞核中;而HSP27蛋白的表达水平与基因表达水平基本一致。本研究为后续研究HSP27基因在牦牛生殖生理过程中的作用机制提供了参考。     

Conservation of the red-winged grasshopper, Oedipoda germanica (Latr.): the influence of reproductive behaviour

Reproductive isolation can function as a mechanism to maintain locally adapted gene complexes while decreasing the heterozygosity in distinct populations. As a result, reproductive behaviour should be considered a fundamental factor influencing reproductive isolation. This is of interest to conservation biology when one desires to regulate gene flow between two populations either by creating opportunities for increased dispersal, by relocation of individuals, or by re-introduction of a species to its natural habitat. Reproductive behaviour can also influence the effective population size and the actual population size through the Allee effect. We investigated the reproductive behaviour of individuals from two isolated populations of the red winged grasshopper, Oedipoda germanica, an endangered species in Central Europe. We detail several methods to show how several aspects of the reproductive behaviour of this species interact with the conservation of this species. Foreign males were not disfavoured in mate choice and male body size was also unimportant in mating success. Heterogamic matings were as productive as homogamic matings in terms of total number of eggs per female, egg hatching rate, or nymph survival. Therefore, we suggest that cross-matings of individuals from different populations do not positively influence population size by heterosis effects nor act they negatively in the form of outbreeding depression. We found that female O. germanica were able to store viable sperm for extended periods but egg pods showed a decrease in hatching rate when these females were deprived of additional mating opportunities. Multiple mated females laid more eggs than once-mated females. Hence, females are capable of founding new populations even after only one mating but their reproductive output may be reduced. Present-day gene flow between populations of O. germanica probably does not occur. Consequently, there is an urgent need to pursue habitat management and release programmes that maintain current population sizes of this species. With regard to the reproductive behaviour of the red-winged grasshopper, we suggest that relocation programmes release males and female together and at an early adult stage. Also, because female reproductive output increases with mating activity, the initial release should involve excess females. Because males have a shorter lifespan than females a subsequent release of males at a later time may enhance the overall success of local conservation efforts by resulting in more offspring per female.     

猪H1foo基因的克隆与真核表达载体的构建

卵特异性连接组蛋白(oocyte-specific linker histone H1,H1foo)是在哺乳动物卵母细胞与早期胚胎内特异表达的连接组蛋白,它在卵母细胞生长成熟、受精及胚胎发育中起关键性作用.本研究旨在克隆猪H1foo基因,并构建其真核表达载体.首先利用5'RACE和RT-PCR的方法获得猪H1foo基因的CDS区,并提交GenBank,登录号为HQ915640;然后将H1foo基因的CDS区连接到载体pMD19-T上,经酶切后定向克隆到表达载体pVenus上,从而构建pVenus-H1foo真核表达载体;用脂质体2000介导重组质粒pVenus-H1foo转染Hela细胞,荧光显微镜下观察、RT-PCR检测,确定重组质粒在Hela细胞内的表达和定位;最后通过体外转录试剂盒将H1foo-venus体外转录为mRNA,并显微注射至猪卵母细胞,荧光显微镜观察其表达和定位.序列分析表明猪Hlfoo基因CDS区全长1 041bp,编码346个氨基酸,蛋白分子量为36.45kD,在核苷酸水平上与牛、人和小鼠H1foo基因的相似度分别为75.7％、67.9％和54.3％;真核表达载体pVenus-H1foo转染后,能在He(l)a细胞中表达并可以准确的定位在细胞核;体外转录的H1foo-venusmRNA显微注射猪卵后其融合蛋白也能准确定位于细胞核.本研究克隆了猪H1foo基因并成功构建其真核表达载体;体外转录的H1foo-venusmRNA能在猪卵中正确表达和定位,为进一步研究H1foo在猪卵母细胞成熟以及核移植过程中的作用提供了基础资料.     

忽地笑体细胞无性系变异的ISSR分析

以外植体母株为对照,利用ISSR标记对来自同一忽地笑鳞茎诱导,通过不定芽和体胚发生途径形成的再生一代和二代植株的体细胞无性系变异进行了分析。结果表明,再生植株出现不同程度的ISSR位点变异,表现为新增加带和缺失带。体胚发生途径出现的ISSR位点变异率高于不定芽形成途径。第二世代的变异率高于第一世代。体胚发生途径形成的第...     

平阳霉素对花生体细胞胚胎发生的影响

本文对花生离体培养高频率体细胞胚(体胚)诱导方法,及平阳霉素(PYM)对体胚发生的抑制作用进行了研究,旨在为以PYM作为化学诱变剂进行花生离体诱变提供有效方法.以花生品种花育20号和花育22号成熟种子的胚小叶为外植体,在添加不同浓度2,4-D(0,5,10,15,20mg/L)的MSB5(MS无机盐+B5有机成分)培养...