苜蓿花叶病毒复制酶(P2亚基)基因3''''端cDNA植物表达载体的构建

将克隆的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV—Ch)复制酶(R亚基)基因3’端约1／2序列及其3’端非编码区(1234bp)cDNA重组于植物表达载体pROKⅡ中，构建了其正链RNA的表达载体pAMR3T，为进一步开展转基因研究创造条件。     

苜蓿花叶病毒复制酶（P2亚基）基因全长cDNA植物表 …

利用含有苜蓿花叶病毒中国分离株（ＡＩＭＶ－Ｃｈ）复制酶（Ｐ２亚基）基因编码区５’端ｃＤＮＡ（１３０６ｂｐ）的重组质粒ｐＡＭ５和编区３’端及其非编码区（１２３４ｂｐ的重组质粒ｐＡＭ３构建了含有复制（Ｐ２亚基）基因全长ｃＤＮＡ及其３’端非编码区的重组质粒ｐＡＭ３５,并将其重组于植物表达载体ｐＧＡ６４３,构建其正链ＲＮＡ的表达载体ｐＧＡ３５,为进一步开展转基因研究创造条件。     

缺失GDD保守区的黄瓜花叶病毒复制酶基因的克隆及植物表达载体构建

以CMV亚组1株系Fny-CMV RNA2基因组为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到2.5 kb的全长复制酶基因扩增产物.对此产物进行纯化,并用NcoI和BspHI进行双酶切,得到3个片段,将不含有GDD保守区的2个片段用T4 DNA连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到2.2kb左右缺失GDD保守区的黄瓜花叶病毒复制酶基因的扩增产物.将其克隆到pGEM-T Easy Vector上,进行序列测定,结果表明GDD保守区确已缺失.该缺失不导致开放阅读框架的移码将缺失GID保守区的基因定向克隆到植物表达载体pBI121中,并经三亲交配导入根癌农杆菌中,经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入.     

白草花叶病毒基因RNAi表达载体的构建

对PenMV-B的HC基因与PenMV-C的HC基因进行同源性分析,确定HC基因的保守片段.根据保守序列设计引物,以PenMV HC-Pro基因的cDNA为模板, PCR扩增能形成"发夹结构"的正反向片段,连接后插入到质粒载体pCAMBIA3301.通过冻融法将载体直接导入农杆菌中,用于农杆菌介导的玉米转化.     

口蹄疫病毒结构蛋白P1基因植物表达载体构建及鉴定

通过RT-PCR克隆了口蹄疫病毒(FMDV)全长P1基因,然后与植物的表达盒融合构建了重组质粒pB1131SP1、pBIP1和pBIAP1,并将质粒转化到根癌农杆菌LBA4404和EHA105中,获得了植物双元表达载体。     

小麦GPX基因的克隆及植物表达载体构建

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)是植物体内清除活性氧的主要酶,与植物抗逆性紧密相关。为利用农杆菌介导法转化小麦以及提高小麦抗逆能力奠定基础,采用RT-PCR方法从小麦品种新麦26中克隆GPX基因的编码区序列,运用T-A克隆方法克隆pGM-T载体,通过酶切、连接和转化等技术构建植物表达载体。结果表明:扩增到约为500bp的GPX基因,成功构建植物表达载体pBI121-GPX,并导入农杆菌LBA4044中。     

ThIPK2基因植物表达载体的构建

为培育高度抗逆和无选择标记的转基因小麦,本研究从NCBI数据库中搜索到ThIPK2基因序列,依据该基因编码的氨基酸序列,参照小麦偏爱的密码子对该基因进行密码子优化,并将重复的和不必要的酶切位点去掉后进行人工合成。将改造后的ThIPK2基因插入到强启动子Ubiquitin和终止子AtSac66之间,然后将其插入到含有玉米Ac/Ds转座子背景骨架的植物表达载体中,获得了具有删除选择标记功能的、由玉米Ubiquitin启动子驱动ThIPK2基因的植物表达载体。经过限制性内切酶分析鉴定,该植物表达载体构建成功。     

草莓PLDα基因cDNA克隆及反义植物表达载体构建

【目的】获得草莓磷脂酶Dα(PLDα)的HKD2功能区基因序列构建反义植物表达载体。研究PLDα基因对草莓果实耐贮性的影响。【方法】以草莓完熟果实为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到PLDα基因的cDNA片段,将其T-A克隆至pMD19-T simple vector上,测序正确后克隆载体经双酶切消化,目的片断反向插入到植物表达载体pBI121中。【结果】构建草莓PLDα基因的反义植物表达载体pBI121-PLD。【结论】通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导入根癌农杆菌LBA44404,为进一步通过反义技术延长草莓果实贮藏的寿命奠定了基础。     

杀虫基因高效植物表达载体的构建

以质粒pCAMBIA1200、pBI121、pMMAR和pC1300MAR为基础,通过酶切连接,构建植物中间载体pC2MARHyg;再利用pAVAc质粒、载体pGA1611和中间载体pC2MARHyg,构建含有Ubi-1启动子、顺向重复MAR和杀虫基因AVAc的高效植物表达载体pC2MAR-AVAc,然后转化农杆菌EHA105,经筛选鉴定获得阳性克隆,为进一步开展植物抗虫基因工程研究奠定基础。     

马铃薯Y病毒复制酶基因植物表达载体构建及转基因烟草的培育

用ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ从重组克隆ＰＺＤ－１中切下马铃薯Ｙ病毒脉坏死株系复制酶基因，将其插入质粒ＰＲＯＤ２相庆切点中构成植物表达载体。用重组ｐＲＯＤ２转化农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株，通过重组农杆菌侵染叶盘将复制酶基因转入烟草品种ＮＣ８９中获得转基因植株。分子生物学检测结果表明，复制酶基因在转基因烟草中获得品种ＮＣ８９中获得转基因植株。分子生物学检测     

重组质粒BT24的构建

用ＢａｍＨ Ｉ从植物表达载体ｐＢＨ１９中,酶切回收含３５Ｓ启动子与Ｎｏｓ终止子的胰蛋白酶抑制因子基因（ＨＲＴＩ）片段,将其克隆到植物表达载体ｐＴＨＹ４８的ＢａｍＨＩ位点,构具潮霉素选择标记的植物表达载体ｐＢＴ２４。经Ａｇｒｏｓｅ ｇｅｌ检测和酶切鉴定,获得具有胰蛋白酶抑制因子基因和潮霉素抗性基因的植物表达载体ｐＢＴ２４。     

耐盐基因HAL1的克隆及植物表达载体的构建

对编码调节离子转运蛋白的基因HAL1进行克隆、序列测定,并对植物表达载体进行构建。基因测序分析表明：该基因含有885个核苷酸,与GenBank上公布的HAL1基因的核苷酸同源性为99.30%,氨基酸序列同源性为99.32%。利用HindⅢ和XbaⅠ切点插入质粒pBY505的Actin启动子与PIN终止子之间,构建成适宜于直接转化法转化植物的表达载体pBHAL1。     

人视黄醇结合蛋白基因的毕赤酵母表达载体构建

用PCR方法从pGEX-hRBP中扩增人视黄醇结合蛋白(retinol bingding protein，prop)，用限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ分别酶切此基因和毕赤酵母表达载体pPIC9，然后用T4连接酶将目的片段克隆到pPIC9载体中。分别用PCR方法和酶切方法验证了此载体构建成功，为下一步使用毕赤酵母进行真核表达人视黄醇结合蛋白打下基础。     

玉米ZmCBL6基因的克隆及其植物表达载体构建

类钙调磷酸酶B蛋白（calcineurin B-like proteins,CBLs）是植物中1类重要的Ca2＋结合蛋白,由其所介导的Ca2＋信号途径广泛参与植物对多种非生物胁迫和某些生长发育信号的应答反应。本论文以水稻OsCBL6序列在GenBank数据库进行TBLASTN查询,获得其在玉米中推测的同源基因ZmCBL6的全长cDNA序列,然后用RT-PCR方法对ZmCBL6基因的编码框cDNA进行了克隆,用生物信息学方法对其编码蛋白的功能域、系统进化和亚细胞定位等进行了分析,并构建了其植物表达载体,为进一步研究其亚细胞定位和通过转基因植物等验证其功能奠定了基础。     

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因反义表达载体的构建

本实验用设计好的两条75bp的长引物进行PCR反应，扩增出甜瓜PGl基因的128bp的片段，将其克隆到pMD18-T载体中，筛选反向克隆，然后将其反向构建到植物表达载体pUC38-ACC的CaMV35S启动手和TMV增强子“Ω”的下游，构建成反义表达载体pUC38-PGo用PCR鉴定重组子，并经序列分析证明获得含有反向插入PG基因片段的植物表达载体，为用花粉管法将其导入河套蜜瓜，培育转基因耐储河套蜜瓜奠定了基础。     

动物乳腺特异表达载体的构建及其表达特性研究

为了研制动物乳腺生物反应器,用中国奶山羊β-乳球蛋白基因的5′、3′-侧翼区和β-酪蛋白基因的第1内含子构建动物乳腺特异表达载体p205C3.细胞表达试验结果显示,p205C3载体能够指导lacZ基因在SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞中表达,不能指导该基因在COS-1细胞和山羊成纤维细胞中表达.将人激肽释放酶(hKLK1) cDNA克隆入p205C3载体,用获得的重组载体p205C3KLK1注射哺乳期小鼠,然后取其心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、胰腺和乳汁,酶活性测定结果显示,乳汁中的酶活性高达255.65 U·mL-1,其他组织中的酶活性与正常小鼠无差异.结果表明p205C3载体不仅能有效地指导外源基因在山羊乳腺细胞和小鼠乳腺中表达,而且表达具有较好的组织特异性,可以用于动物乳腺生物反应器的研制.     

金黄色葡萄球菌fbB基因D2-D3编码区克隆及其植物表达载体构建

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要致病菌,其表面的纤连素结合蛋白(FnBP)在介导金黄色葡萄球菌侵入寄主细胞的过程中发挥着重要作用.因此,FnBP成为奶牛乳腺炎亚单位疫苗研究中的重要靶标.本研究根据Genbank中纤连素结合蛋白B基因(fnbB)D区编码序列设计引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,PCR扩增D2-D3区,将该片段回收后与pCAMBIA3301植物表达载体同时进行Nco Ⅰ和Eco 065 Ⅰ(BstEⅡ)双酶切,酶切片段回收后进行连接,将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,通过菌落PCR、酶切鉴定等方法筛选阳性克隆,将阳性克隆送公司测序确定DNA序列.结果表明,阅读框架正确,氨基酸序列无突变,成功构建金黄色葡萄球菌fnbB基因D2-D3区植物表达载体.该研究为研制奶牛乳腺炎转基因植物口服疫苗奠定了基础.     

FR 02全长基因的克隆表达载体的构建及转化苹果

从铁胁迫诱导的拟南芥植株根中克隆了全长的FR02（Fe^3＋-螯合物还原酶）基因,并将FR02基因构建到了植物高效表达载体pCB302中。通过农杆菌介导的转化和PCR及Southern blot检测证明FR02基因正向的插入了苹果基因组中。以破坏生长点的茎尖为外植体的苹果基因转化方法转化率高达10．8％。FR02全长基因的成功克隆、构建和转化为高铁、抗黄化苹果和其他高铁作物新品种的培育开辟了一条新路。     

FR 02全长基因的克隆表达载体的构建及转化苹果

从铁胁迫诱导的拟南芥植株根中克隆了全长的FR 02(Fe3+-螯合物还原酶)基因,并将FR 02基因构建到了植物高效表达载体pCB 302中.通过农杆菌介导的转化和PCR及Southern blot检测证明FR 02基因正向的插入了苹果基因组中.以破坏生长点的茎尖为外植体的苹果基因转化方法转化率高达10.8%.FR 02全长基因的成功克隆、构建和转化为高铁、抗黄化苹果和其他高铁作物新品种的培育开辟了一条新路.     

里氏木霉Rut-C30β-甘露聚糖酶基因表达载体的构建

将含有β-甘露聚糖酶基因的重组质粒p^GEM-ManI经EcoRI、绿豆芽核酸酶、HindⅢ酶切处理和纯化后，与含有Ω序列和17启动子以及信号肽OmpT序列的分泌型表达载体p^TCO2连接，将质粒p^GEM-ManI中的β-甘露聚糖酶基因连接在p^TCO2质粒信号肽OmpT之后，构建成表达载体p^TCO2-ManI。将表达载体p^TCO2-ManI转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，克隆转化子，pCR测序，结果获得了β-甘露聚糖酶编码的成熟肽cDNA，其序列与GeneBank报道完全一样。并从该克隆转化的大肠杆菌的周质中检测到了β-甘露聚糖酶的活性同时，证明β-甘露聚糖酶基因在分泌型过程中得到正确加工。