木薯细菌性枯萎病菌hrpG和hrpX基因的克隆和初步分析

根据黄单胞类病原菌hrpG和hrpX基因序列,设计简并引物,通过PCR扩增从我国木薯细菌性枯萎病菌中克隆到这2个基因。结果表明：10个菌株的hrpG基因编码区长度均为792 nt,编码263个氨基酸,相互之间最多有4个碱基和1个氨基酸的差异;而hrpX基因编码区长度均为1 431 nt,编码476个氨基酸,相互之间最多有4个碱基和3个氨基酸的差异。所获hrpG基因序列和辣椒斑点病菌等黄单胞菌同源基因相似性最高,核苷酸序列为95%,氨基酸序列为96%。所获hrpX基因核苷酸序列和辣椒斑点病菌等的相似性最高,为97%,而氨基酸序列和柑橘溃疡病菌等同源基因相似性最高,为99%。这2个基因的聚类分析结果表明,木薯细菌性枯萎病菌和豆褐色黄单胞菌、柑橘溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的亲缘关系最近。     

木薯细菌性枯萎病菌防控药剂的筛选

采用含毒介质法进行了13种杀菌剂对木薯细菌性枯萎病菌的室内毒力测定。结果表明,治农菌(2%三唑酮·30%乙蒜素EC),正萎舒(80%乙蒜素EC),农猎手(70%代森锰锌WP)和农用硫酸链霉素(72%硫酸链霉素SP)的最低有效浓度最小,抑菌效果最好。腈菌唑(12.5%腈菌唑SP),噻菌铜(20%噻菌铜SC)和抑阿(20%叶枯唑WP)的最低有效浓度最大,抑菌效果最差。2011年,在广东省湛江市进行了7种杀菌剂的田间试验,结果表明,中生菌素(3%中生菌素WP)、治农菌(2%三唑酮·30%乙蒜素EC)和正萎舒(80%乙蒜素EC)的防效较好,建议生产上使用。     

4种防御酶在木薯-细菌性枯萎病菌反应中的活性变化

不同木薯种质对细菌性枯萎病的抗性是不同的。本研究选择2个抗病和2个感病木薯种质,接种病原菌后评价了过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性变化。结果表明：病菌侵染后POD活性呈上升趋势,接种后6 d达最高峰,随后呈下降趋势,且抗病种质显著高于感病种质;接种时,抗病种质PPO活性显著增高,随后下降,且抗性种质高于感病种质;CAT活性变化与抗病反应之间无相关性;抗感种质的SOD活性在病菌侵染后均表现出类似的下降趋势。由此表明,POD和抗病反应具有较强的相     

国内603份木薯种质对细菌性枯萎病抗性评价

细菌性枯萎病是当前我国木薯生产中的第一大病害。比较剪叶、针刺和喷雾等接种方法,发现剪叶法适用于大批量的种质抗性评价。采用剪叶法完成了603份木薯种质的抗性评价,结果表明高抗种质仅有6份,绝大多数种质均表现出一定的感病性。在广东省开平市进行29份木薯种质的田间发病情况调查,结果表明华南系列、桂热系列等主栽种质均不抗病。     

木薯MeSAP13基因的克隆及其抗细菌性枯萎病功能鉴定

胁迫相关蛋白（stress-associated proteins, SAPs）在植物对胁迫应答和胁迫调控中起重要作用。木薯是我国重要的粮食作物和经济作物,细菌性枯萎病（cassava bacterial blight, CBB）已严重危害我国木薯产业的健康发展。为了探讨木薯MeSAP基因在抗细菌性枯萎病中的作用,本研究克隆了我国主栽木薯品种‘华南8号’（SC8）的MeSAP13基因,分析该基因在细菌性枯萎病病原菌侵染时的表达模式及其编码蛋白的基本特性。利用基于木薯花叶病毒介导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS）技术抑制了MeSAP13基因在木薯SC8叶片中的表达,通过接种细菌性枯萎病病原菌XpmHN11对MeSAP13的抗病功能进行抗性鉴定。结果发现：在病原菌XpmHN11侵染叶片3 d后MeSAP13基因表达量显著上调,说明木薯MeSAP13基因能够响应病原菌的侵染;在VIGS载体转化木薯叶片40 d后发现,与转化pCsCMV-A载体的对照叶片相比,MeSAP13在转化pCsCMV-MeSAP13叶片中的表达量显著下调了40%~60%,表明通过VIGS技术成功抑制了MeSAP13在木薯叶片中的表达。将病原菌XpmHN11接种至MeSAP13基因沉默叶片和对照植株叶片,发现MeSAP13基因沉默植株接种叶片的水渍状病斑面积显著大于对照植株接种叶片。分析侵染后0、3、6 d病原菌XpmHN11的繁殖情况发现,在侵染后3 d和6 d的MeSAP13基因沉默植株接种叶片中,其病原菌数量显著高于对照植株接种叶片。以上研究结果表明,抑制MeSAP13基因的表达,降低了木薯对细菌性枯萎病的抗性。     

云南红河流域木薯细菌性枯萎病发生危害动态研究

采用定点监测、分级调查法对红河流域不同区域的木薯细菌性枯萎病发生情况进行研究。结果表明：(1)木薯细菌性枯萎病在红河流域进入雨季后(5月)开始发病,整个雨季中(5～9月)病害发生较为严重,尤其是进入夏季后温度满足病原菌的发病条件时,病情指数变化曲线和降雨量曲线出现了同升、同降的现象。(2)同一海拔高度下,病情指数呈现出下游大于上游和中游,而危害率则出现相反的趋势,250～300 m海拔观测点的病情指数大小顺序为下游(2.03)＞中游(1.96)＞上游(1.77),危害率为下游(64.57%)＜中游(66.86%)＜上游(70.00%);450～500 m海拔观测点的病情指数大小顺序为下游(2.01)＞中游(1.77)＞上游(1.76),危害率为下游(64.57%)＜中游(66.29%)＜上游(69.14%)。(3)同一区域则表现出低海拔地区的病情指数和危害率均高于高海拔地区。     

防治木薯细菌性枯萎病的生防菌株筛选和防效测定

从木薯8个不同生境分离到298株细菌,测定其产酶、次生代谢物和颉颃活性,结果表明,产蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶和生长素的菌株和比例分别为160(53.69%)、57(19.13%)、11(3.69%)和150(50.34%),产嗜铁素菌株最多203个,比例达68.12%;产几丁质酶的菌株最少7株,比例仅为2.35%;其中,9株菌株对木薯细菌性枯萎病菌具有颉颃活性,比例为3.02%。通过赋值选择88个得分较高的菌株,对其16S r RNA测序及ARDRA-PCR和BOX-PCR聚类分析,发现可分成21个簇,且每个簇的种群丰度较高。优选11个菌株进行日光温室大棚盆栽防效测定,其中,HWY-3-1防效为100%,防效在60%以上的菌株有DBS-5(85.96%)、HS-4-3(82.88%)、DHWP-1(79.37%)、HWYT-3-2(77.88%)、HWS-4-3(77.84%)、DHNS-3-5(65.34%)、DHWR-5-1(61.83%),和对照防效相比,差异显著;进一步选择5个防效较好的潜力菌株测定其田间防效,结果显示,HWY-3-1(Bacillus pumilus)平均防效为38.11%,与对照的防效存在显著差异。试验筛选策略可行,初步找到1株对CBB防效较稳定的生防菌株Bacillus pumilus。     

3种常用杀菌剂对不同来源木薯细菌性萎蔫病菌的毒力测定

细菌性萎蔫病是世界范围内木薯种植中的重要病害,但防控技术研究较少。采用含毒介质法评价了3种常用杀菌剂对不同来源的29个病菌菌株的抑菌作用。结果表明,供试菌株对净刹(80%乙蒜素EC)和农用硫酸链霉素(72%硫酸链霉素SP)敏感性较高,而对可杀得贰仟(53.8%氢氧化铜WG)表现出不同程度的抗性。建议生产中使用乙蒜素和硫酸链霉素对该病进行防治。     

木薯细菌性萎蔫病菌抗铜性评价及抗铜相关基因簇分子分析

细菌性萎蔫病是世界范围内木薯种植中的重要病害,也是中国木薯种植中为害最严重的病害。前期研究发现铜基杀菌剂对国内木薯细菌性萎蔫病防效欠佳,随即开展了病菌抗铜性评价及抗铜相关基因簇的分子分析工作。评价了42个不同来源病原菌菌株对硫酸铜的抗性,发现其抑菌最低有效浓度均在1.35~1.75 mmol/L之间。通过和已报道黄单胞菌类抗铜相关基因的比对分析,发现来自广西的菌株GX11携带有cop TAB和Xme RSA2个抗铜基因簇。对来自南美州、非洲和亚洲67个菌株的基因组序列分析发现绝大多数菌株均带有这2个基因簇,聚类分析发现相关基因在菌株之间具高度的同源性。     

柑橘溃疡病菌LAMP实时浊度检测方法的建立及应用

以柑橘溃疡病菌特异性高的假定蛋白基因（登录号：AE008923.1）为靶标,设计并筛选4条引物来特异性识别靶标序列中的6个独立区域,建立柑橘溃疡病菌LAMP实时浊度检测方法。该方法利用实时浊度仪检测反应过程中产生的焦磷酸镁白色沉淀,实现对LAMP整个反应过程的实时监控。从镁离子浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、引物浓度和反应温度5个变量参数对 LAMP检测体系进行优化,并对方法的特异性、灵敏度、稳定性及实际样品检测效果进行评价。结果显示,该体系经优化后稳定性良好,可在66 ℃ 恒温条件下,60 min内完成检测;DNA检测下限可达0.02 ng/μL,灵敏度与荧光定量PCR方法相同,比常规PCR方法高1个数量级;能快速、准确地对田间疑似样品进行检测,与荧光定量PCR方法的检出情况一致,没有漏检。结果说明柑橘溃疡病菌实时浊度LAMP检测方法操作简便、所需时间短,特异性与灵敏度高,为柑橘溃疡病菌的快速筛查提供较好的途径。     

水稻白叶枯病(Xanthomonas campestris pv.oryzae)抗性遗传研究 Ⅱ.水稻品种对五个菌系的抗性遗传分析

研究了5个水稻品种邳早15、蚌珠芒、南粳15、中百4号和青华矮6号对3个水稻白叶枯病菌系的抗性遗传和抗性基因等位关系。这5个品种分别与感病品种沈农1033杂交,对各组合的F_1、F_2和B_1F_1群体的抗性测试表明:邳早15和蚌珠芒由一对显性基因控制其抗性。南粳15和中百4号均由两对连锁的显性基因控制,交换值为30%。等位性测定表明:邳早15和蚌珠芒的一对显性基因与Xα-3等位,南粳15和中百4号也均有一对显性基因与Xα-3等位;青华矮6号的一对不完全显性基因与Xα-4是等位的。     

水稻白叶枯病(Xanthomonas campestris pv．oryzae)抗性遗传研究:II．水稻品种对五个菌系的抗性遗传分析

 研究了5个水稻品种邳早l5、蚌珠芒、南粳l5、中百4号和青华矮6号对3个水稻白叶枯病菌系的抗性遗传和抗性基因等位关系。这5个品种分别与感病品种沈农lO33杂交，对各组合的F1、F2和B1F1群体的抗性测试表明：邳早l5和蚌珠芒由一对显性基因控制其抗性。南粳l5和中百4号均由两对连锁的显性基因控制，交换值为30％。等位性测定表明，邳早15和蚌珠芒的一对显性基因与Xa-3等位，南粳l5和中百4号也均有一对显性基因与Xa-3等位；青华矮6号的一对不完全显性基因与Xa-3是等位的。     

芒果细菌性黑斑病菌XcmR基因的克隆与序列分析

根据黄单孢菌属LuxR基因的同源性设计简并引物XF/XR,采用同源克隆法从芒果细菌性黑斑病菌(Xanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae)中获得了约1.4 kb的DNA片段。经测序和序列同源性分析表明,该基因片段长1 422 bp含有一个完整的LuxR同源基因,并命名为XcmR。生物信息学分析表明,XcmR基因完整ORF(开放阅读框)全长765 bp,编码254个氨基酸,分子质量和等电点分别约为28.2 ku和8.9,与GenBank中公布的Xanthomonas属LuxR或AhyR/AsaR氨基酸序列具有86%~99%相似性。系统聚类结果表明,XcmR与来源于柑桔溃疡病菌(X.axonopodis pv.citri)、番茄疮痂病菌(X.c.pv.vesicatoria)、水稻白叶枯菌(X.oryzae pv.oryzae)和甘蓝黑腐病菌(X.c.pv.campestris)的LuxR蛋白聚成一支。NCBI网站蛋白质保守结构域搜索表明,XcmR是LuxR蛋白家族的一员,具有LuxR蛋白相似结构。     

水稻白叶枯病菌hrcU基因缺失突变体构建及功能研究

 通过基因敲除方式,构建了水稻白叶枯病菌hrcU基因的缺失突变体。突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主植物上的过敏反应。携带hrcU基因的黏粒完全互补了hrcU突变菌株的表型,互补菌在水稻组织中的生长能力也与野生型菌株相当。免疫杂交结果显示,hrcU基因突变后,水稻白叶枯病菌的Harpin蛋白Hpa1不能从细胞内分泌到胞外。这些结果表明,水稻白叶枯病菌hrcU基因的主要功能是形成Ⅲ型分泌系统,将效应分子分泌到病原细菌胞外,从而决定了在非寄主上的过敏反应和在水稻上的致病性。     

Cecropin B转基因水稻及其后代抗白叶枯病研究初报

 就单株自交繁殖得到的京引119的Cecropin B转基因水稻T0代到T5代共6个世代的不同单株株系对白叶枯病的抗性进行了初步研究。结果表明,Cecropin B转基因水稻对白叶枯病的抗病性在后代中出现分离,但能传递到高世代,在T4代中得到两个抗病性提高的株系。从白叶枯病菌侵染抗病性不同的株系的动态变化结果表明,Cecropin B转基因水稻能抵抗白叶枯病的轻度感染,但要彻底改进转基因水稻抗病性,必须有高水平的杀灭病菌的物质表达。     

中国水稻白叶枯病菌群体结构的初步分析

 用两个DNA探针pJEL101和pBSavrxa10，测定了78个来自18个地区的水稻白叶枯病菌系的RFLP型，其中主要来自华北、东北和少数来自华中、华南，以分析其群体结构和遗传多样性。各菌系的基因组DNA分别用限制性内切酶EcoR I和BamH I酶切探针pJEL101或pBSavrxa10。通过分子杂交，分别鉴定出16种RFLP型。病原型1、2和6的多数来自华北和东北菌系表现14种RFLP型。它们之间多数只有一带之差，或有3～4个带位不同。然而，它们与来自广东和云南的菌系相比，差别较大，有7～8条带位不同。根据参试菌系的RFLP带型分簇（Cluster），如以彼此之间的带位相似率达85%为界，可分为6簇，多数病原型1、2和6的菌系为簇1，少数几个菌系，LN43、GD1358和YN5分别为簇4、5和6。参试的菌系群体遗传变异为0.77（pJEL101）和0.83（pBSavrxa10）。也分析了亚群体的各病原型内的遗传变异，初步分析表明中国的水稻白叶枯病菌系的遗传变异多种多样。但尚需测试更多的来自华南；华中和西南地区的菌系，方能较系统地分析全国菌系的群体结构及其遗传关系。     

脂氢过氧化物裂解酶基因对生菜遗传转化的研究

枸橘(Ponarus trifoliata)是一类含植物气味成分较高的植物。从枸橘中分离气味物质合成的关键基因—脂氢过氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase,HPL)基因,并构建35S启动子驱动下的表达载体,通过农杆菌介导的方法将其导入生菜中,经PCR和Southern杂交检测。结果显示:有数十个阳性植株,且经RT-PCR和Northern杂交鉴定HPL基因可在生菜中正常转录。     

云南高原粳稻区白叶枯病菌的致病型初步鉴定

利用采自云南高原粳稻区病叶分离的17份水稻白叶枯病菌株,在30份水稻品种上接种进行致病型初步鉴定。研究表明可以将17个菌株分为7个致病型（Ⅰ~Ⅶ）,其中Ⅴ型菌为云南高原粳稻区的优势菌群。初步构建了一套包含7个品种（黄玉、毫糯扬、TN1、珍珠矮、IR26、南粳33、金南风）的高原粳稻白叶枯病菌的鉴别品种,明确了7个致病型在这套鉴别品种上的反应型。早生爱国3号(Xa-3)、IR1545-339(xa-5)、IRBB21（Xa-21）、扎昌龙（Xa-22t,Xa-24t）对所接种菌均表现抗病,在云南高原粳稻育种中具有较好的利用前景。