利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

【目的】CRISPR/Cas9基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑，以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以Pita、Pi21和ERF922为靶基因，构建共编辑载体pC1300-2×35S::Cas9-gPita-gPi21-gERF922 ，用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014，筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。【结果】在T0代转基因株系中，Pita、Pi21和ERF922突变频率分别为75%、85%和65%，突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代，并从中获得Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明，与野生型相比，突变株系的抗性显著提高。同时，接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此，我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。【结论】利用CRISPR/Cas9技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系，为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

[目的]CRISPR/Cas9 基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑,以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。[方法]利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术,以 Pita、Pi21 和 ERF922 为靶基因,构建共编辑载体 pC1300-2×35S::Cas9-g^Pita-g^Pi21-g^ERF922 ,用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014,筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。[结果]在T0代转基因株系中,Pita、Pi21和ERF922 突变频率分别为 75%、85%和 65%,突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含 T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代,并从中获得 Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变株系的抗性显著提高。同时,接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此,我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。[结论]利用 CRISPR/Cas9 技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系,为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

利用CRISPR/Cas9系统定向编辑水稻SD1基因

【目的】半矮秆水稻品种的选育和应用是水稻育种的最重大成果之一。半矮秆品种大多是半矮秆基因SD1(semi-dwarf1)功能缺失突变体,为了获得sd1突变体,本研究对SD1基因进行了定向编辑。【方法】利用CRISPR/Cas9系统,以SD1基因为靶基因,构建基因编辑载体CRISPR-SD1,用农杆菌介导的方法转化水稻恢复系申繁17和申繁24。【结果】在2个转化受体的T₀代均获得了纯合的sd1突变体,并且在T₁代株系中分离出了不含转基因序列的植株。2个品种的sd1突变体与各自的野生型相比,株高分别下降了25%左右。【结论】利用CRISPR/Cas9系统可以有效地对目的基因进行编辑,在水稻分子育种领域具有巨大的应用价值。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻粒长和穗粒数性状

【目的】基因组定点编辑技术已成为分子育种的重要手段。本研究拟对GS3和Gn1a功能缺失突变对目标性状的改良效应进行分析,以期为培育高产水稻提供理论基础。【方法】利用CRISPR/Cas9系统,以控制粒型基因GS3和控制每穗粒数基因Gn1a为编辑对象,构建了共敲除载体p C1300-2×35S::Cas9-g~(GS3)-g~(Gn1a)a,用农杆菌介导法转化4个优质水稻品种,分析了基因突变的特征和相应农艺性状。【结果】构建的敲除载体成功地实现了对GS3和Gn1a基因的定点编辑。在4个转化受体的T_0代均分别获得了gs3和gs3gn1a的移码突变体。对T_1 代中无选择标记突变体的农艺性状分析表明,突变体gs3和gs3gn1a与野生型相比粒长变长,千粒重增加;突变体gs3gn1a与突变体gs3相比,每穗粒数显著增加。【结论】利用CRISPR/Cas9系统进行水稻基因编辑可以快速改良品种的目标性状,在水稻品种的定向改良方面具有巨大的潜力。     

CRISPR/Cas9系统编辑水稻Wx基因

【目的】 直链淀粉含量与稻米品质密切相关。Wx基因是控制水稻直链淀粉合成的主效基因,通过对Wx基因定点编辑以获得稳定遗传、直链淀粉含量适宜的突变体。【方法】 构建CRISPR/Cas9表达载体pGK03-Wx-gRNA (靶点1和2分别在Wx基因第1和第2外显子),利用工程菌EHA105遗传转化超级稻楚粳27,潮霉素筛选获得转化株系,对转化株系及其后代进行分子检测、测序、基因表达和遗传稳定性分析以及直链淀粉含量测定。【结果】 获得9个独立的T₀代转化株系,靶点1(L1~L5) 5个株系,突变频率100%,靶点2(L6~L9) 4个株系,突变频率75%。由T₀代突变体衍生出T₁和T₂代株系,测序发现T₀、T₁和T₂代株系出现缺失(单、双、多碱基缺失)和单碱基插入两种突变类型;T₀至T₁代部分株系(L1、L2、L3和L6)发生再编辑,T₁至T₂代遗传稳定。与野生型相比,突变株系RNA水平Wx基因表达量显著下降(P<0.01),稻米直链淀粉含量显著降低(P<0.01),从17.5%降到1.93%。【结论】 利用CRISPR/Cas9系统成功编辑水稻Wx基因,获得了稳定遗传、低直链淀粉含量的突变体,为稻米品质改良提供了材料。     

利用CRISPR/Cas9技术创制高效抗除草剂水稻

【目的】培育抗除草剂品种在水稻育种中具有重要意义。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以黑龙江优质粳稻品种为材料,编辑乙酰乳酸合酶ALS基因,创制具有抗除草剂特性的水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9技术,以乙酰乳酸合酶ALS为靶基因,构建单碱基突变载体pH-nCas9-PBE-ALS,以松粳22、龙粳46和绥粳18为转化材料,利用农杆菌介导转化获得转基因植株,通过对转基因植株的突变位点进行测序结合除草剂喷施试验,鉴定基因型及表型。【结果】经分子水平检测验证,获得ALS^S627N突变植株10株,ALS^S627N且¹⁸⁸⁴G-A但第628位氨基酸未改变突变植株1株,ALS^S627N/G628E突变植株1株。相较于野生型,以上三类突变植株均具有较强抗除草剂特性。【结论】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得具有抗除草剂特性,能够稳定遗传,不含转基因标记的纯合株系,可为抗除草剂水稻育种提供基础材料。     

利用CRISPR/Cas9技术高效创制长粒香型水稻

【目的】CRISPR/Cas9基因编辑技术已成为水稻分子育种的重要手段。为了促进水稻育种的发展,本研究以非香型粳稻品种龙粳11为试验材料,对GS3、GS9和Badh2基因进行编辑,以期获得能稳定遗传的长粒香水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9技术,以GS3、GS9和Badh2为靶基因,构建敲除载体pYLCRISPR/Cas9-GS3/ GS9/Badh2-gRNA,通过农杆菌介导法,在龙粳11的GS3、GS9和Badh2基因中引入了特定的突变。【结果】T₂代无转基因的gs3/gs9/badh2纯合突变体与野生型龙粳11相比,粒长增加26.43%~27.01%,单株产量增加10.82%~12.11%,千粒重增加18.34%~41.36%,稻米变香,高效地将圆粒水稻变成长粒香型水稻。【结论】利用CRISPR/Cas9技术获得能够稳定遗传并具有长粒香品质的纯合突变株系,为组合多个品质性状提供了一种方便有效的方法,从育种角度加快了新品系创制过程。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑BADH2定向改良宁粳50号的香味

宁粳50号是宁夏黄河灌区的主栽品种,生产上表现产量高、稻瘟病抗性好,稻米品质优,但缺乏香味。利用基因编辑技术对宁粳50号的香味基因BADH2进行定向敲除,获得了3个阳性克隆。经过田间综合农艺性状的对比和筛选,经4代自交选育出生育期、有效穗数、株高等综合农艺性状与宁粳50号相当,稻米具有明显香味,精米垩白粒率和垩白度等品质性状无明显改变的改良株系T1、T2和T3,实现了对宁粳50号的稻米香味性状的定向改良。     

利用分子育种技术改良水稻稻瘟病抗性

为选育具有稻瘟病持久抗性的水稻新品系提供可利用资源,1993 年以小粒野生稻为外源DNA供体,采用花粉管通道法,将其稻瘟病抗性导入栽培稻24D中。经过4 年连续6 代的选择,成功地将小粒野生稻稻瘟病抗性转移到栽培稻中,获得了9 份苗叶瘟和穗颈瘟均得到改良的抗性材料。因此,利用分子育种技术改良水稻抗病性是可行的。     

利用CRISPR/Cas9技术创制抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系

【目的】创制新型抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系,为高产优质杂交水稻选育提供资源。【方法】利用CRISPP/Cas9技术在水稻稻瘟病基因Pi21、温敏不育基因TMS5和香味基因Badh2的第1外显子处设计靶位点,构建多基因表达载体pC1300-2×35S::g^TMS5-g^Badh2-g^Pi21,转化优质常规籼稻品种中早70,测序鉴定分析获得纯合阳性稳定株系。利用稻瘟病喷雾接种和打孔接种方法对稻瘟病基因Pi21的纯合突变株系进行稻瘟病抗性鉴定,利用GC-MS技术对Badh2纯合突变株系的香味物质2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量进行测定。【结果】在T₀转基因株系中,Pi21、TMS5和Badh2突变频率分别为87.5%、80.0%和87.5%,突变类型多为双等位突变。从T₁代中筛选不含载体骨架的纯合突变株系,获得两种三突变纯合株系。稻瘟病接种结果表明,与野生型相比,T₂代Pi21纯合变异株系的抗性显著提高。同时,接种后纯合突变体株系内相关防卫基因的表达量显著上调,ROS积累量也显著增加。tms5纯合变异株系表现出典型的温敏不育特性,TMS5基因的表达水平与野生型相比显著降低,高温下Ub_L404基因的表达水平明显高于野生型。与野生型相比,在Badh2纯合突变体植株中Badh2的表达水平显著下调,并且香味物质2-AP含量极显著增加。【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功对Pi21、TMS5和Badh2基因同时进行定向编辑,获得了具有高抗稻瘟病的香型温敏不育系,为高抗、香型不育系材料的选育提供参考,加快高产优质杂交水稻的选育。     

利用CRISPR/Cas9技术创制广亲和水稻温敏雄性不育系

【目的】为突破传统杂交转育方法对水稻两系不育系选育的限制,利用CRISPR/Cas9技术对籼型恢复系台恢31的温敏雄性核不育基因TMS5进行编辑,以获得全新水稻温敏雄性不育系。【方法】选择水稻温敏不育基因TMS5第1外显子的2段序列作为靶点,构建双靶点pHUE411-TMS5-gRNA载体,通过农杆菌侵染获得116株T0代转基因植株。【结果】经鉴定获得3种类型纯合突变体tms5-1、tms5-2和tms5-3,每一种突变均导致TMS5氨基酸序列的缺失。分期播种试验结果显示,幼穗分化敏感期温度为27℃时,tms5-1和tms5-3自交结实率分别为0.56%、0.03%,表现为高度不育,而tms5-2则完全不育。与野生型台恢31相比,不育系TB52S(即tms5-2)单株穗数增多,穗长变短,株高及每穗总粒数相较WT均下降25%,花药发白瘦小,无花粉粒充实,柱头、颖壳没有显著差异。TB52S幼穗分化4期时进行温度处理,确认TB52S的育性转换温度为26℃。TB52S分别与籼、粳型恢复系配组,F₁的结实率超过90%。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对籼型恢复系台恢3...     

利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻Pi21基因的效率分析

利用CRISPR/Cas9技术,针对Pi21基因的两个靶位点(靶位1和靶位2),构建基因敲除载体,转化水稻品种南粳9108。经PCR鉴定,获得了28株T0代阳性转基因植株。对靶位点酶切检测发现,靶位1突变效率为78.57%,靶位2突变效率为92.86%;靶位1和靶位2同时突变的效率为78.57%,突变效率较高。通过对靶位点进行测序,发现靶位点突变类型较多,包括碱基缺失、碱基插入、碱基缺失后插入其他碱基和大片段DNA缺失等类型。对突变株系进行氨基酸预测,发现大部分株系都存在移码突变现象而使基因突变彻底,少数株系表现为部分氨基酸的缺失或变异。成功敲除了水稻Pi21基因,并对突变效率和类型进行了分析,为进一步验证Pi21基因功能、培育广谱抗稻瘟病的水稻新品系奠定了基础。     

利用 CRISPR/Cas9 系统编辑拟南芥 2 个双链结合蛋白

CRSPR/Cas9 系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的方向。本研究在双链结合蛋白（dsRNA-binding protein,DRB）DRB3 和 DRB5 两个基因外显子的保守序列设计 2 个靶点,并构建与 tRNA 串联的双靶点 CRISPR/Cas9 表达载体。通过一次转化,获得了 DRB3 或 DRB5 单独被编辑或同时被编辑的拟南芥突变体 dcl2drb4 转基因 T1 代植株,为研究 DRB3、DRB5 是否参与 DCL4 介导的抗病毒 RNA 沉默通路奠定基础。     

CRISPR/Cas9系统在植物育种中的应用

人工核酸酶系统是在特定的基因组位点,进行切割进而利用生物内源的修复系统对目标基因进行编辑,创造新基因型的基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统是原核生物抵御噬菌体侵染的天然适应性免疫系统。经过优化的CRISPR/Cas9编辑系统凭借操作简单,突变效率高,成本低等特点优越于其他核酸酶系统,比如锌指核酸酶系统和TALE核酸酶系统。目前,优化改造后的CRISPR/Cas9编辑系统已经在植物功能基因研究和新材料创制中得到了广泛地应用。本研究简述了CRISPR/Cas9编辑系统的结构和作用机理,归纳并论述了CRISPR/Cas9系统在植物中的编辑效率与脱靶效应和在改良作物农艺性状中的应用。最后,总结了CRISPR/Cas9系统在功能基因组学研究中应用扩展,以及展望了该系统在作物育种中的发展前景及应用价值,期望为高效利用CRISPR/Cas9系统进行新材料创制、作物品种改良提供参考。      

利用CRISPR/Cas9技术编辑AFP1基因提高水稻耐逆性

目的 为鉴定水稻AFP1在非生物胁迫响应中的作用,创制非生物胁迫抗性的水稻新材料。方法 以优异籼稻恢复系华占为转化受体,利用CRISPR/Cas9技术创制afp1突变体,并对afp1突变体的耐逆性进行初步鉴定。结果 AFP1靶点1和靶点2的编辑效率分别为66.67%和75.00%。所有突变株系中,突变类型仅有插入和缺失突变,90%突变株系的突变长度为小片段突变（<5bp）。获得了6种无转基因成分的afp1纯合突变体。正常条件下,afp1突变体株高和结实率降低,有效分蘖增加,穗长显著升高,单株产量在-4.06%和11.75%之间变化。和野生型相比,afp1突变体的ABA敏感性和叶片水分散失率降低,耐干旱、热和渗透胁迫能力提高。结论 编辑AFP1基因可提高水稻多种非生物胁迫抗性。     

利用CRISPR/Cas9技术创制Rc基因恢复红稻

【目的】将栽培稻品种恢复为米质优、抗逆性强的红稻具有较大的研究价值。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,编辑原花青素转录调节因子Rc基因,恢复红种皮特性,以改良水稻米质,提升抗逆性。【方法】利用CRISPR/Cas9技术,以Rc为靶基因,构建突变载体p YLCRISPR/Cas9-Rc-g RNA,以空育180、上育453为材料,转化获得转基因植株,通过测序手段和表型观察验证成果。【结果】分子水平检测获得Rc突变材料2种,其中KY-1在1414―1417bp缺失4个碱基,终止子突变为苯丙氨酸;SY-1在1411bp处缺失1个碱基,终止子突变为天冬氨酸。2种编辑材料均恢复为红米表型,且具有一定耐盐碱能力。【结论】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得恢复红种皮表型的纯合株系,为红米改良提供基础材料。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术优化作物育种

介绍1项目前应用广泛的基因编辑技术CRISPR/Cas9。CRISPR是细菌有效防止病毒和噬菌体侵入的手段。在sgRNA的指导下,Cas9定点切割DNA,导致双链DNA断开,随即可以直接对细胞进行基因编辑。CRISPR/Cas9是一种创造性的分析和编辑植物基因序列的新技术。其高效性和快捷性对农业生产具有重大的发展意义。科学家可以利用其高度靶向的特点对基因进行定位和编辑,在不改变作物农艺性状的同时优化它们的产量、营养品质和对环境的适应性。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑AFP1基因提高水稻耐逆性

[目的]为鉴定水稻AFP1在非生物胁迫响应中的作用,创制非生物胁迫抗性的水稻新材料.[方法]以优异籼稻恢复系华占为转化受体,利用CRISPR/Cas9技术创制afp1突变体,并对afp1突变体的耐逆性进行初步鉴定.[结果]AFP1靶点1和靶点2的编辑效率分别为66.67％和75.00％.所有突变株系中,突变类型仅有插入...     

利用发根农杆菌体系检测大豆CRISPR/Cas9系统的靶点

作为一种基因编辑的新技术,CRISPR/Cas系统已被广泛应用于各种生物的基因工程中.但CRISPR/Cas9基因编辑系统还存在着一定的脱靶现象,确定基因编辑靶点选择的可行性可提高基因编辑效率.本研究选用大豆GmCO基因为靶标,使用CRISPR/Cas9基因编辑系统来构建靶点的基因敲除载体,并且利用发根农杆菌K599菌...     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除水稻NRR基因促进根系生长的研究

水稻营养应答和根生长基因NRR(Nutrition response and root growth)是一个多效基因,负调控水稻根系生长并参与调控营养组织淀粉合成。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻品种空育131的NRR基因进行编辑,获得2个NRR基因敲除的非转基因纯合突变体。突变体植株在各种营养条件下(有氮磷钾、无氮、无磷、无钾、无氮磷以及无氮磷钾)其幼苗主根长度、单株根数和根鲜重都显著高于野生型,这说明敲除NRR基因能够显著改良水稻的根系生长,为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术快速改良水稻品种的根系生长提供了一种有效策略。