苹果树腐烂病菌拮抗枯草芽孢杆菌E1R-j抗菌蛋白的分离纯化

【目的】从枯草芽孢杆菌E1R-j菌株的发酵液中分离纯化抗菌蛋白,分析确其对苹果树腐烂病菌菌丝的抑制作用,为更好地利用该菌株防治植物病害和研制生物农药奠定基础。【方法】采用盐酸沉淀法从E1R-j发酵液中提取粗蛋白,并筛选酸沉淀的最佳pH值,然后通过反相柱RESOURCETMRPC、凝胶柱Superdex-75、阴离子交换柱DEAE-Sepharose和脱盐柱层析技术,提取并分离纯化粗蛋白;在粗蛋白分离纯化过程中,以皿内对峙试验测定蛋白的抗菌活性;通过扫描电镜技术,观察抗菌蛋白对病原菌菌丝的抑制作用。【结果】以pH 4.0盐酸沉淀获得的粗蛋白活性最强,抑菌效果最佳。反相柱RESOURCETMRPC获得的活性峰收集物经凝胶柱Superdex-75、阴离子交换柱DEAE-Sepharose和脱盐柱层析后,得到1个对称的活性峰,其收集物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)检测为单一条带,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱中显示有2个分子质量相近的条带,表明该抗菌蛋白可能含有2个亚基,2个亚基的分子质量分别为55和60ku,将该活性蛋白命名为EP-1。扫描电镜结果显示,抗菌蛋白EP-1可使苹果树腐烂病菌菌丝出现膨大、弯曲以及原生质外渗等现象。【结论】通过盐酸沉淀及柱层析技术,从枯草芽孢杆菌E1R-j发酵液中分离纯化出一种分子质量为115ku的抗菌蛋白EP-1,其对苹果树腐烂病菌菌丝生长具有明显的抑制和破坏作用。     

布氏杆菌Ⅳ型分泌系统相关蛋白基因RicA的克隆、原核表达及免疫原性分析

为克隆并原核表达布氏杆菌(Brucella melitensis)疫苗菌株M5Ⅳ型分泌系统相关蛋白基因RicA,并进行表达蛋白的免疫原性分析,应用PCR技术从布氏杆菌疫苗菌株M5全基因组扩增RicA基因片段,亚克隆至pMD18-T载体后测序分析,构建重组表达载体pET-28a(+)-RicA,转化E.coli BL21(DE3)表达菌,以不同浓度IPTG诱导表达不同时间,SDS-PAGE鉴定表达效果,表达蛋白经AKTA蛋白纯化系统纯化,用Antheprot 5.0软件分析其理化特性及抗原性,Western Blot检测其免疫原性。结果表明:RicA基因全长528bp,编码175个氨基酸,与基因库中已知菌株的核苷酸同源性和氨基酸同源性均达到99%以上。SDS-PAGE表明,RicA融合蛋白在大约23ku处出现条带,纯化后条带单一。软件分析发现RicA蛋白融合抗原性较强,Western Blot检测证明其有较好的免疫原性。说明,成功克隆并表达布氏杆菌疫苗菌株M5 RicA基因,为进一步研究其与布氏杆菌Ⅳ型分泌系统及布氏杆菌致病机制之间的关系奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌B111中性蛋白酶基因BS2在毕赤酵母中的表达

 【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因BS2,并在毕赤酵母中获得有效表达。重组BS2蛋白分子量约69 kD,表达水平29.77 mg?L-1,水解酪素酶活力27 800 U?g-1,并显示抗黄萎病菌活性。【结论】纯化鉴定了一个具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶BS2,克隆其编码基因BS2,并成功实现在酵母中的有效表达。     

Bacillus velezensis SWUJ1拮抗物质分离纯化及抑菌机理研究

为探究具潜在生物防治作用的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis SWUJ1)菌株的抑菌机理,通过全基因组测序,寻找该菌潜在的抑菌物质合成基因簇,推测可能合成的抑菌活性产物;并通过检测拮抗菌株发酵滤液热稳定性,初步判断抑菌物质类型,进而结合酸沉淀法和液质联用(LC-MS)和高效液相色谱(HPLC)等方法,对菌株发酵液抑菌活性物质进行分离纯化和鉴定,并测定抑菌组分的最低抑菌浓度(MIC),观察其对病原菌生长的影响.全基因组分析结果显示:B.velezensis SWUJ1具有13个次级代谢产物合成基因簇,以非核糖体肽合成酶途径合成的脂肽类抗生素为主;拮抗菌活性发酵滤液具有较好的热稳定性. LC-MS分析结果显示:其活性发酵液提取物中含有脂肽类化合物表面活性素、丰原素和伊枯草菌素;经硅胶柱层析、 HPLC和凝胶柱层析,获得一单峰组分,其MIC为200μg/mL,该组分可使病原菌丝扭曲、畸形、肿大.     

解淀粉芽孢杆菌ASR-12粗蛋白对多种植物病菌的抑制作用

为探究解淀粉芽孢杆菌ASR-12可能存在的拮抗作用机制,采用硫酸铵沉淀法从生防菌ASR-12发酵液中提取粗蛋白,以软腐病原菌作指示菌,测定其理化性质,并采用牛津杯法检测粗蛋白对8种病原真菌的抑制作用,同时以小麦雪腐病原菌作指示菌观察粗蛋白对病原菌的抑制作用。结果表明,该抗菌蛋白耐高温、耐紫外,最适pH值为7.0,对蛋白酶K和胰蛋白酶不敏感;它同时可以抑制大白菜软腐病菌和8种病原真菌;可抑制孢子萌发,降解菌丝细胞壁,造成菌丝畸形、膨大、扭曲。表明解淀粉芽孢杆菌ASR-12可产生至少一种理化性质稳定的抗菌蛋白,来有效地抑制多种植物病原菌。     

鮰爱德华菌hcp基因的克隆及重组表达

通过克隆获得鮰爱德华菌Edwardsiella ictaluri LH51溶血素共调节蛋白(Hcp)编码基因hcp,该基因全长为489 bp,编码163个氨基酸,hcp编码蛋白的理论相对分子质量为17 800,等电点为5.21。氨基酸序列分析结果表明,鮰爱德华菌hcp基因与迟钝爱德华菌Edwardsiella tarda毒力蛋白EvpC(Hcp同源物)、发光杆菌Photorhabdus luminescens hcp基因等具有高度同源性。将鮰爱德华菌Hcp氨基酸序列连接至pGS-21a表达载体中,成功构建了pGS-21 a-hcp原核表达质粒;再将表达质粒转化至BL21(DE3)菌株后,经IPTG诱导、镍柱层析纯化获得大量携带GST和组氨酸双标签的融合蛋白。经SDS-PAGE和Western blot分析,确认获得了相对分子质量约为45 000的融合蛋白,并成功制备了具有较高效价的多克隆抗体。     

产抗生素siomycin A放线菌株13-12抗菌活性探究及菌种鉴定

采用平板纸片法测定药用植物刺五加内生放线菌菌株13-12发酵液抑菌活性及稳定性;PCR扩增、克隆并测序分析菌株活性物质合成相关功能基因;并通过生理生化、培养特征及16SrRNA进行分类鉴定。结果表明:菌株13-12发酵液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、草分枝杆菌、MRSA均有不同程度的抑制作用,在4～20℃、pH6.0～8.0及光照48h条件下发酵液抑菌活性稳定;菌株基因组含有NRPS、Halo基因;通过菌株表型特征及分子特征初步鉴定该放线菌为游动单胞菌属(Planomonospora)有效发表种球形浮游动单胞菌(Planomonospora sphaerica)的一个菌株。菌株有合成β-内酰胺类抗生素等多种活性物质的潜能,具有进一步开发利用价值。     

红叶芥叶色性状的cDNA-AFLP研究

利用cDNA-AFLP技术分析红叶芥叶片变红前后的基因表达差异, 共发现60条目标条带, 随机选取5 条差异片段进行了克隆测序. 结果发现其中TDFV1T2(149 bp)属于芥菜叶绿体基因片段, 另外4条序列分别与拟南芥中编码二酰基甘油激酶、半胱氨酸肽酶、肽基脯氨酰顺反异构酶亲环型家族蛋白、阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶等具有一定的同源性.     

鲤鱼CD74同源基因的原核表达及多克隆抗体制备

通过PCR扩增出鲤鱼CD74同源基因的胞外片段trcIclp1和trcIclp2,将其克隆到原核表达载体pQE-30中,并在大肠杆菌菌株M15中经IPTG诱导表达,经过变性,Ni-NTA柱亲和纯化,透析复性,得到可溶性纯化蛋白。将纯化后的蛋白免疫NIH小鼠制备多克隆抗体,经Western鉴定,ELISA法测其效价分别高达1∶51 200和1∶12 800。     

红叶芥叶色性状的cDNA-AFLP研究

利用cDNA-AFLP技术分析红叶芥叶片变红前后的基因表达差异,共发现60条目标条带,随机选取5条差异片段进行了克隆测序.结果发现其中TDFV1T2（149 bp）属于芥菜叶绿体基因片段,另外4条序列分别与拟南芥中编码二酰基甘油激酶、半胱氨酸肽酶、肽基脯氨酰顺反异构酶亲环型家族蛋白、阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶等具有一定的同源性.     

产销通路的建立及招商引资意见

针对大陆农业发展存在的不足有必要建立产销通路 ,并提及物流在流通环节的重要性。最后就大陆各地的招商引资提出了意见     

植物学与分子生物学研究创新型实验项目的设计与实施

以农杆菌渗入烟草表皮瞬间表达绿色荧光蛋白的观察实验为例,对植物学与分子生物学研究创新型实验的选题设计、教学过程和效果进行了探讨。该实验项目的实施培养了学生的团队精神、科学素养和创新意识,提高了实验设计和实际操作能力,是生物科学特色专业实验教学改革的有益尝试。     

耐低温兼性厌氧蛋白酶产生菌192的筛选、鉴定及酶学性质

为了提高厌氧水解效率,采用双层平板法筛选出一株耐低温兼性厌氧蛋白酶产生菌192.经形态、生理生化和16S rDNA序列分析鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),对其产酶条件进行了初步研究.结果表明,该茵的最适生长温度为30℃,生长8～12h达对数期,初始pH 7.5时酶活力最高.蛋白酶最适反应温度为45℃、pH 7.0,酶活力最高达39.3 U/mL.该酶在50℃以下,pH 6.0～9.0性能稳定.在60℃以上热稳定性很差,70℃保存lh酶活力全部丧失.     

苦荞的成分功能研究与开发应用

苦荞具有丰富的营养价值 ,它既能食用 ,又能防病、治病 ,为许多其它主要食物所不及。我国有丰富的苦荞资源 ,对苦荞的深入研究和开发应用有利于改善和提高人们的食物结构 ,同时也有助于促进贫困山区的脱贫致富。本文就苦荞的营养价值、药用价值和开发应用等方面的问题进行了阐述     

《机械原理》与《机械设计》实验教学改革实践

《机械原理》和《机械设计》两门课程的实验教学在培养学生的综合设计、创新设计能力等方面,有其他课程不可替代的重要作用,针对两门课程传统实验教学中存在的问题,提出了以独立设课为中心的实验教学改革和实践方案,取得了显著的效果。     

副猪嗜血杆菌分离鉴定与PCR检测方法的建立及应用

从养猪场送检的猪肺病料中分离到3株疑似副猪嗜血杆菌(HPS)可疑菌株。经形态镜检、染色特性、生化和部分生物学特性试验,初步鉴定为HPS。在细菌学鉴定基础上,设计合成3对引物,分别以3株分离菌株的DNA为模板进行PCR扩增,结果均扩增出822 bp8、24 bp和1.9 kb的预期特异性条带。以HPS GD株作为参考阳性菌株,以P1、P2为引物,设计优化PCR反应程序,建立HPS PCR检测方法,并应用于临床病料检测。结果表明,所建立的HPS PCR检测方法特异与敏感性高、适用性强,可应用于HPS感染的诊断和检测。     

万寿菊病虫害的发生与防治措施

万寿菊又名金盏花、臭芙蓉 ,千寿菊、蜂窝菊 ,属菊科万寿菊属一年生草本植物。黑龙江省八五三农场人工栽培万寿菊主要是取其花朵作为提取黄色素的原料。在正常条件下 ,种植万寿菊可实现公顷产鲜花 2 2 .5t以上、产值可达 135 0 0元左右、利润可达6 0 0 0元左右 ,经济效益较好。     

土壤铅、镉单一和复合污染及与钙、锌交互作用对韭菜生长和铅镉积累特性的影响

通过盆栽试验研究了重金属铅、镉单一和复合污染及其与常量元素钙、微量元素锌的交互作用对韭菜植株生长发育和Pb、Cd在其根、叶中迁移富集规律的影响。韭菜中Pb、Cd的含量用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测得。结果表明,韭菜对Pb或Cd的吸收量与土壤单一Pb或Cd污染程度正相关;Pb/Cd之间存在复杂的交互作用,低浓度复合时相互促进吸收,高浓度复合时优先吸收Cd而抑制韭菜对Pb的吸收;锌在高浓度Pb/Cd污染时表现出优良的拮抗作用,可有效降低Pb、Cd的生物有效性并促进韭菜生长。韭菜根是富集Pb、Cd的主要部位,但受代谢方式、迁移率等因素的影响,因而在根、叶中的分布存在差异;根与叶中Cd的浓度比为1.5左右,Pb浓度比主要为2.5~4.5之间,显示Cd更易迁移至韭菜叶组织中。     

秦川牛GH 、INS 的测定及体尺、体重分析

随机选取14头秦川牛(其中1.5岁的公、母牛各4头,2.0岁的公、母牛各3头),按性别分为两组。采用放射免疫法测定血液中生长激素(GH)、胰岛素(INS)的水平,并对每头牛的体高、体斜长、胸围、胸深、尻宽、腰角宽等体尺指标及体重进行测量并分析,结果表明:在1.5时公、母秦川牛体内的生长激素和胰岛素差异不显著(P>0.05);而在2.0岁时公、母秦川牛体内的生长激素和胰岛素差异显著(P<0.05);并且随着年龄的增加,秦川牛体内的生长激素呈下降趋势而胰岛素则呈增加趋势,且生长激素和胰岛素呈差异不显著的负相关(P>0.05)。通过对体尺指数进行分析得出:较1.5岁而言,2.0岁秦川牛体躯发育程度更大,胸围更宽,尻部增幅明显,骨骼等体躯部分生长速度相对减慢,而肌肉等体量部分增长速度则相对加快,符合肉牛的生长发育规律以及秦川牛中、晚熟的特点。将实测体重与经济性能划分标准比较,发现秦川牛仍属于役肉兼用型品种,但经过近几年的选育,体重有了很大的增加。     

秸秆切碎灭茬机的设计与试验

针对双轴击切式破碎秸秆和根茬所存在的问题，本文提出单轴压切原理和非等长刀切碎模型，并对秸杆切碎灭茬机的关键参数进行了优化设计。该机田间试验表明切碎率达91．4％，根茬破碎率达86．5％。该机的应用必将促进一年两熟平作旱区保护性耕作技术的发展。