大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A和其保持系的不同器官蛋白质组比较

质核互作雄性不育在杂种优势利用中起着重要作用,探讨质核互作雄性不育发生的机理具有重要的理论和实践意义.本研究开展大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A与其保持系NJCMS1B的不同器官蛋白质组比较分析.以大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A和其保持系NJCMS1B的种子、叶片和花药为材料,采用双向凝胶电泳技术对其蛋白质进行分离,考马斯亮蓝染色,获得重复性好的蛋白质双向电泳图谱,利用PDQuest软件处理分析,寻找差异表达蛋白.结果发现不育系NJCMS1A与其保持系NJCMS1B的种子2-DE图谱间存在7个差异表达蛋白点,其中3个在NJCMS1A中表达而在NJCMS1B中缺失,3个在NJCMS1A中缺失而在NJCMS1B中表达,1个在NJCMS1A中表达量明显增强;苗期叶片2-DE图谱间基本一致,没有差异表达蛋白点;单核小孢子期花药2-DE图谱间有9个差异表达蛋白点,其中3个在NJCMS1A中表达而在NJCMS1B中缺失,6个在NJCMS1A中缺失而在NJCMS1B中表达;二胞花粉期花药2-DE图谱间有24个差异表达蛋白点,其中10个在NJCMS1A中表达而在NJCMS1B中缺失,12个在NJCMS1A中缺失而在NJCMS1B中表达,2个在NJCMS1B中表达量明显增强.两系花药间存在较多差异表达蛋白点,种子间仅有少量差异表达蛋白点,而苗期叶片间基本没有差异表达蛋白点,说明不育基因表达具有时空性和器官特异性,与育性有关的蛋白主要在花药中表达.     

大豆GmAMS基因及其启动子的克隆和表达分析

bHLH(basic Helix-Loop-Helix)转录因子在植物雄配子发育中具有重要的调控作用。为探究bHLH转录因子在大豆花发育中的作用,以大豆细胞质雄性不育系NJCMS5A的花芽cDNA和叶片DNA为模板,通过RT-PCR克隆得到具有典型bHLH结构域的GmAMS基因及其启动子区域,并进行生物信息学分析和时空表达分析。生物信息学分析结果显示GmAMS基因的编码区序列全长为1 716 bp,编码571个氨基酸。亚细胞定位预测GmAMS位于细胞核中。荧光定量分析结果显示,相对于保持系NJCMS5B,在不育系NJCMS5A的花芽中GmAMS基因的表达水平显著下调。组织化学染色结果表明GmAMS启动子驱动的GUS蛋白主要集中在转基因拟南芥的幼小花药中表达。研究结果为进一步探究GmAMS在大豆花发育中的生物学功能和调控机制奠定了基础。     

辣椒胞质雄性不育系CaNAD9线粒体基因的克隆及表达分析

为了深入研究辣椒胞质雄性不育与能量代谢之间的关系,本研究以辣椒胞质雄性不育系9704A和同型保持系9704B为实验材料,克隆了线粒体基因组CaNAD9基因,比较了其一级结构在2种材料间的差异,利用实时荧光定量PCR技术分析该基因在保持系9704B不同组织中的表达模式,以及胞质雄性不育系9704A与同型保持系9704B花蕾不同发育时期的表达差异。结果表明:通过对双向测序进行分析,辣椒CaNAD9基因CDS长度为573 bp;生物信息学分析表明CaNAD9基因编码190个氨基酸残基;CaNAD9基因转录本在不育系和保持系中均未发生RNA编辑;辣椒CaNAD9基因在不同组织中的表达量存在差异,且差异较为明显,其中在种子中的表达量最高,在胎座中的表达量最低;辣椒CaNAD9基因的表达量在胞质雄性不育系与保持系花蕾不同发育阶段中存在一定差异,在花粉母细胞减数分裂期辣椒胞质雄性不育系与同型保持系中的表达差异最为显著。这种差异可能会使雄性不育系的能量代谢出现异常,从而导致辣椒雄性不育。     

大豆细胞质雄性不育系与保持系atp6基因的RNA编辑比较研究

对大豆细胞质雄性不育系NJCMS1A与其保持系NJCMS1B的atp6基因的RNA编辑进行比较研究.结果在不育系NJCMS1A与保持系NJCMS1B的atp6-3基因保守区中均发现2个编辑位点,但互不相同,并且导致了氨基酸的不同变化;mtDNA 序列分析显示,atp6-3基因转录本保守区在不育系NJCMS1A与保持系NJCMS1B间存在1个碱基的差异;另外还发现atp6-1、atp6-2和atp6-3的表达在不育系NJCMS1A与保持系NJCMS1B间存在明显差异.     

大豆△~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因GmP5CS1和GmP5CS2的克隆与过表达载体构建

利用同源克隆方法从强耐旱栽培大豆(Glycine max)品种齐黄22中克隆得到2个编码大豆△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)的基因,分别命名为Gm P5CS1和Gm P5CS2。氨基酸序列分析发现,Gm P5CS1包含1个长度为2 163 bp的ORF,编码720个氨基酸,等电点p I为6.70,分子量大小为78.38 k Da;Gm P5CS2包含1个长度为2 271 bp的ORF,编码756个氨基酸,等电点p I为6.10,分子量大小为82.18 k Da。与NCBI公布的部分物种蛋白质序列比对发现,Gm P5CS1与紫花苜蓿(Medicago sativa)的亲缘关系最高,Gm P5CS2与豇豆(Vigna unguiculata)的亲缘关系最高。组织表达分析表明,Gm P5CS1与Gm P5CS2基因在大豆的各个组织中均有表达,其中叶和根中的表达量相对较高,茎中表达量次之,花和籽粒中的表达量相对较低。利用Gateway技术得到植物过表达载体p Earley Gate103-Gm P5CS,再转入根癌农杆菌EHA105中,为Gm P5CS基因的转化及功能分析奠定了基础。     

大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A与其保持系NJCMS1B的生理生化特性比较分析

以大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A及其保持系NJCMS1B的花芽为试验材料,利用试剂盒法和紫外分光光度计测定分析了糖分含量(可溶性糖和淀粉)和总ATPase、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、抗坏血酸氧化酶(AO)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)以及过氧化物酶(POD)等酶活性的变化情况。结果表明:相较于保持系NJCMS1B,总ATPase、PEPCK、AO和CAT活性在不育系NJCMS1A中显著下降;糖分含量、SPS和SOD活性在不育系NJCMS1A中下降水平不显著;POD活性在不育系NJCMS1A中显著上升。根据结果分析推测,与能量代谢或胁迫响应等相关的物质或酶活性在不育系NJCMS1A中的亏损现象可能是NJCMS1A花粉败育的主要原因。     

大豆GmABCG40基因的功能预测及表达分析

通过在大豆基因组数据库中检索拟南芥At ABCG40在大豆中的同源基因,获得了Gm ABCG40基因序列。通过对Gm ABCG40基因编码的氨基酸序列及启动子序列进行生物信息学分析,结果表明:Gm ABCG40基因CDS序列全长4 284 bp,编码1 427个氨基酸。Gm ABCG40编码的蛋白为疏水性蛋白,具有多个N-糖基化位点、激酶磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、2个ATP/GTP结合位点基序A和1个速激肽家族信号。结构域分析表明Gm ABCG40含有2个核苷酸结合域与2个跨膜结构域,形成NBD1-TMD1-NBD2-TMD2结构,属于ABCG亚家族的成员。Gm ABCG40预测的启动子区域含有与激素、胁迫、光应答、胚乳表达和转录因子结合相关的顺式作用元件。系统进化分析表明Gm ABCG40与菜豆、红豆、木豆、百脉根等豆科植物亲缘关系较近。组织特异性表达分析结果显示Gm DABCG40在叶片中表达量最低,在根中表达量最高,推测其可能参与根中ABA的转运过程。     

大豆雄性不育系和大豆资源有关开花授粉性状的研究

以大豆质核互作和核雄性不育材料有关开花授粉性状的研究表明，花粉传媒花蓟马密度在可育株与不育株之间无显著差异。同一材料内不育株的龙骨瓣开张度比可育株大；NJCMS2A与NJCMS1A间、N69－2772（ms2）与N69－2771（ms1）、N69－2773（ms3）间的龙骨瓣开张度无明显差异。NJCMS2A的异交率比NJCMS1A高，恰好NJCMS2B的散粉性比NJCMS1B好。类似地，N69－2772不育株的异交率高于其他两个核雄性不育材料，恰好N69－2772可育株的散粉性也比其他两个核雄性不育材料的可育株好，NJCMS1A的柱头活力可以保持2.5天，花瓣对柱头的活力有保护作用。NJCMS1A的BC5：7家系间以及单株间雌性育性存在显著差异，且筛选到雌性育性较好的家系，对大豆资源有关开花授粉性状的研究表明，大豆资源中花瓣大小、龙骨瓣开张度、散粉性、单花花粉量、花蓟马密度等性状存在很大变异。野生大豆的花远小于栽培豆，野生豆的花蓟马密度、龙骨瓣花张度等性状与栽培豆无显著差异，野生豆的散粉性比栽培豆好；从310份种质资源中筛选到30份散粉性较好的材料、16份龙骨瓣开张度较大的材料以及4份两者均较好的材料。     

大豆核孔蛋白GmNup96基因的克隆及生物信息学分析

从大豆品种天隆1号的叶片中克隆Gm Nup96基因的c DNA序列,对其编码的氨基酸序列、蛋白质理化性质、一级结构、二级结构、亚细胞定位等进行了生物信息学分析。结果表明:Gm Nup96基因编码1 022个氨基酸,为具有一定亲水能力的酸性蛋白,不具有信号肽,相对分子量为116.199 7 k Da;二级结构预测结果显示,Gm Nup96序列存在α-螺旋(46.87%)、无规则卷曲(26.32%)、延伸链(17.03%)和β-转角(9.78%),并无其它二级结构;系统进化树分析表明,大豆Gm Nup96基因与野生大豆、芸豆、绿豆、红小豆之间的亲缘关系更近。     

向日葵谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆及抗病功能研究

为探讨谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因在向日葵抗病机制中的作用,在核盘菌诱导向日葵转录组文库的基础上从向日葵耐病品种龙食葵2号中克隆了1个GST的c DNA序列,并进行了表达和功能分析。结果表明:该基因开放阅读框为675bp,编码224个氨基酸残基,分子量为55.45k D,等电点为5.16,命名为Ha GSTU1(Gen Bank登录号为KR071872);Ha GSTU1蛋白属于GST的Tau家族,推测是一种无信号肽的细胞质蛋白,其N端结构域包含结合GSH的G位点,C端结构域包含特异结合底物的H位点;Ha GSTU1与一个橡胶树GST蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的相似性为72%。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在叶中表达量最高,其次是花、根、种子和茎,在盘中的表达量最低;干旱、盐、草酸、核盘菌及其代谢物均能诱导向日葵Ha GSTU1基因的表达量出现显著变化。利用农杆菌介导法将该基因导入烟草,提高了转基因烟草叶片对核盘菌的抗性。对抗性株系烟草GST和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性测定发现,转基因烟草叶片中GST和GPX酶活性较野生型提高约2倍,并随着接菌时间的延长,两种酶活性显著升高。初步推断Ha GSTU1具有抗核盘菌的功能。