牛科物种FSHβ基因外显子1和外显子2遗传特征分析

 促卵泡素（follicle stimulating hormone, FSH）对刺激动物卵泡发育和促进精子生成具有重要作用,但有关牛科物种FSH基因的群体遗传特征还不十分清楚。本文针对FSHβ基因外显子1和外显子2,采用PCR SSCP结合PCR产物直接测序技术对353头水牛(来自11个水牛群体)、30头牦牛和30头大额牛样品进行了群体变异检测,并结合NCBI数据库中已发表的普通牛、山羊和绵羊等物种同源序列进行了群体遗传和生物信息学分析。在FSHβ基因外显子1中,水牛中发现1个核苷酸替换和1个缺失,即c-49A>G和c-31delG;其中,SNP49在河流型和沼泽型水牛中均存在,等位基因c-49A为优势等位基因,而c-31delG只存在于沼泽型水牛中,且为杂合状态,基因频率为0.077。在牦牛外显子1中检测到c-37G>A和c-12T>C替换,且为连锁遗传的,而在大额牛外显子1中未检测到SNP位点。在FSHβ基因外显子2中,水牛中发现c132G>A替换,该位点在河流型和沼泽型水牛均存在,但等位基因频率在两类水牛间不一致。在牦牛外显子2中检测到c9C>T和c21C>T替换,该替换也存在于普通牛中;大额牛外显子2为单态,未见SNP位点。生物信息学分析显示,在一些牛科物种FSHβ基因外显子2中发现的SNP位点均为同义替换,揭示了其序列的高度保守性。在牛科物种中,山羊和绵羊FSHβ基因第36位密码子编码氨基酸与其他物种不同,可作为区分它们的遗传标记。     

水牛ABCG2基因第9外显子群体遗传特征分析

 三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2 (ABCG2)对普通奶牛泌乳性状有直接影响。水牛中该基因的遗传特征与产奶性状间是否有遗传关联目前还不十分清楚。本文采用PCR SSCP和PCR产物直接测序相结合的技术,对4个河流型水牛群体和9个沼泽型水牛群体共计466个个体的ABCG2基因第9外显子进行了变异检测。结果表明,水牛ABCG2基因第9外显子由251个核苷酸组成,所有的河流型和沼泽型水牛序列相同,未发现SNP位点,但在第9内含子内检测到1个T>C替换(g. SNP44769 T>C)。与GenBank数据库中已发表的牛科物种同源序列比对后发现,数据库中一条河流型水牛序列该外显子第66位核苷酸处有1个G>A替换(c. SNP1018 G>A),导致所编码的氨基酸发生p. V340I的改变;与普通牛、山羊和绵羊该基因第9外显子序列的核苷酸差异位点个数分别为5,8和11个,表明水牛与其他牛科物种间具有较大的遗传差异。本文结果提示ABCG2基因第9外显子在水牛中已纯化固定,且与水牛产奶量性状间无直接关联性。     

牛生长激素基因（bGH）编码区的遗传变异特征

以普通牛、瘤牛、牦牛、大额牛、沼泽型水牛和河流型水牛的代表牛种为对象,探讨不同牛种(或亚种)GH基因编码区序列的遗传变异特征.结果表明,6个群体的GH基因编码区序列全长均为654bp,共检测到16个SNP位点,外显子1无变异位点,外显子2、外显子3、外显子4和外显子5分别有3个、5个、1个和7个变异位点,表明外显子5是编码区的高变区域,而且SNP位点在不同牛种(或亚种)中的分布存在明显差异.16个核苷酸替代位点中有13个为同义突变,仅有3个非同义突变位点,分别位于第2外显子、第4外显子和第5外显子处,并造成其所编码的氨基酸发生改变.     

牛生长激素基因（bGH）编码区的遗传变异特征*

 以普通牛、瘤牛、牦牛、大额牛、沼泽型水牛和河流型水牛的代表牛种为对象,探讨不同牛种（或亚种）GH基因编码区序列的遗传变异特征。结果表明,6个群体的GH基因编码区序列全长均为654bp,共检测到16个SNP位点,外显子1无变异位点,外显子2、外显子3、外显子4和外显子5分别有3个、5个、1个和7个变异位点,表明外显子5是编码区的高变区域,而且SNP位点在不同牛种（或亚种）中的分布存在明显差异。16个核苷酸替代位点中有13个为同义突变,仅有3个非同义突变位点,分别位于第2外显子、第4外显子和第5外显子处,并造成其所编码的氨基酸发生改变。     

沼泽型与河流型水牛Y染色体性别决定基因（SRY）编码区序列的比较分析*

 采用PCR产物直接测序技术对56头沼泽型水牛和26头河流型水牛Y染色体性别决定基因（SRY）的完整编码区及部分侧翼区序列进行了测定和比较分析,结果显示所有沼泽型水牛的SRY基因编码序列一致,所有河流型水牛的SRY基因编码序列也一致;但沼泽型水牛和河流型水牛之间SRY基因编码区序列相比在c.202位点存在一个G＞C替换,这个碱基差异属于错义突变,导致了pG68R,即编码的第68位氨基酸在沼泽型水牛为甘氨酸G,而在河流型水牛为精氨酸R;经群体检测确定SRY基因c.202G＞C变异为沼泽型水牛和河流型水牛之间普遍存在的现象,而其他牛科物种在此位置不存在差异。本研究使用的PCR引物可以作为水牛性别鉴定的特异性引物,而发现的差异位点也可以作为区分沼泽型与河流型水牛和水牛群体雄性介导基因流检测的分子标记。     

水牛DGAT1基因第8外显子群体遗传特征分析

为了阐明河流型和沼泽型水牛DGAT1基因的第8外显子的群体遗传差异和特征,采用PCR-SSCP和PCR产物直接测序技术对11个水牛群体402份样品进行了群体变异检测,并结合GenBank数据库上已发表的牛科物种DGAT1基因序列进行了比较分析。结果显示,河流型和沼泽型水牛DGAT1基因第8外显子序列一致,序列全长为75 bp;与普通奶牛序列相比,河流型和沼泽型水牛DGAT1基因第8外显子都为K等位基因,揭示其与水牛的高乳脂率、低泌乳量有关。序列比对发现K等位基因在牛科物种中普遍存在。本研究结果揭示了水牛中DGAT1基因第8外显子的遗传特征,可为其奶用性状选育利用提供遗传背景资料。     

水牛催乳素基因第3外显子群体遗传特征分析

 催乳素基因（PRL）第3外显子(exon 3)对奶牛产奶量、乳脂产量和乳蛋白产量有显著影响,但在水牛中该基因的遗传特征及其与产奶性状是否有遗传关联目前还不清楚。本研究采用PCR SSCP并结合PCR产物直接测序技术,分析了沼泽型水牛和河流型水牛共12个群体275个个体PRL exon 3的遗传变异,结果表明：水牛PRL exon 3由108个核苷酸组成,编码36个氨基酸,在水牛群体中未检测到单核苷酸多态性位点（SNPs）,PRL exon 3与水牛产奶量之间没有直接相关性。通过序列比对发现在不同物种中PRLexon 3具有高度保守性。但在PRL第2内含子（intron 2）的2265nt和2335nt分别检测到G>A突变和C>T突变,其中2335nt位点突变仅在2头槟榔江水牛中检测到。     

水牛-β-LG基因3，4外显子遗传特征分析

 本文通过PCR产物直接测序法得到水牛β-LG基因第3,4外显子及其旁侧序列后,采用PCR-RFLP和PCR-SSCP方法对属于10个群体的224头水牛该基因第4外显子进行了多态性检测,又从中随机抽取属于9个群体的69头水牛采用PCR-SSCP结合测序的方法检测了其第3外显子的遗传多态性。结果显示：河流型水牛和沼泽型水牛β-LG基因的第3外显子均为74 bp;它们的第4外显子均为111 bp;在所研究群体中,两类水牛第3,4外显子序列完全相同,并未发现具有多态现象。与牛科物种同源序列比较显示：水牛β-LG基因3,4外显子在进化上比较保守,相应于普通牛的B等位基因。由于产奶量有明显差异的河流型水牛与沼泽型水牛的β-LG基因第3,4外显子序列间无差异,提示它们对水牛产奶量无直接影响。     

大额牛和牦牛胃型LYZ c基因多态性及其对消化功能的适应性分析

【目的】为了阐明大额牛和牦牛胃型LYZ c基因的多态性及其对消化功能的适应。【方法】采用PCR产物直接测序技术,对35头大额牛和33头牦牛样品胃型LYZ c基因完整编码区序列进行了变异检测,并结合已发表的牛科物种同源序列进行了其对消化功能的适应性分析。【结果】在大额牛群体内共发现6个SNP位点,分别为c.196GA、c.267TC、c.270CT、c.396CT、c.423CT和c.438CG。在牦牛群体内共发现10个SNP位点,其中6个与大额牛共享,非共享的SNP位点分别为c.336GC、c.348TG、c.351TC和c.375AC。SNP196和SNP348为异义替换,引起p.G66S和p.H116Q氨基酸替换,但它们对大额牛和牦牛LYZ c的功能没有影响。在大额牛LYZ c基因中,共定义6种单倍型,确定了2种LYZ c蛋白变异体(Gayal 1和Gayal 2);而在牦牛LYZ c基因中,共定义12种单倍型,确定了3种LYZ c变异体(Yak 1～Yak 3);变异体Gayal 1与Yak 3、Gayal 2与Yak 1相同,而变异体Yak 2为牦牛独有。大额牛、牦牛和普通牛胃型LYZ c变异体之间在氨基酸组成、理化特性与结构上基本一致,但大额牛和牦牛变异体LYZ c等电点比普通牛S3型LYZ c更低。【结论】大额牛和牦牛胃型LYZ c蛋白可能更适合胃中的酸性环境,具有分解胃中微生物的功能。     

鸡催乳素受体基因的多态性分析

[目的]研究PRLR基因对鸡就巢和产蛋性状的影响。[方法]设计10对引物,采用PCR-SSCP方法,扩增了旧院黑鸡、固始鸡、山地乌骨鸡以及新扬州鸡PRLR基因部分外显子及邻近内含子序列。[结果]检测到4个多态位点,分别为外显子3处的SNP1（A10862G,位于5’-UTR）、外显子6处的SNP2（A25670G,为同义突变）、内含子8处的SNP3（G30716A）以及外显子10处的SNP4（A31900G）。卡方独立性检验结果发现,4个多态位点不同基因型在4个群体间的分布差异极显著（P〈0.01）。[结论]PRLR基因可能是影响鸡就巢和产蛋性状的一个主效基因。     

牛生长激素基因外显子5序列变异及其分子进化特征

通过双向直接测序法测定中国5个牛种生长激素(GH)基因外显子5序列,并且在分析序列变异的基础上探讨GH基因外显子5序列的分子进化特征.序列分析表明,5个牛种GH基因外显子5的遗传变异水平较低,平均核苷酸变异率约为3.48%,而且绝大多数位点的核苷酸替换是同义突变,仅发现1个错义突变位点;从GH基因外显子5序列单倍型构建的分子进化树来看,水牛与普通牛、瘤牛、牦牛及大额牛的分化相对比较明显,其他4个牛种之间并无明显分化,还享有共同的祖先序列.研究结果也说明牛GH基因外显子5在进化过程中由于功能的约束表现相当保守,进化速率缓慢.     

贵州本地山羊STAT5A基因第10外显子SNP研究

利用黔北麻羊、贵州黑山羊和贵州白山羊构建DNA池,设计1对引物扩增其STAT5A基因第10外显子及部分内含子序列。PCR产物纯化后进行双向测序。DNAStar和BLAST分析确定多态性位点。利用生物信息学软件分析SNPs位点对STAT5A基因RNA二级结构、STAT5A蛋白二级及三级结构的影响。结果表明:在扩增的STAT5A基因中筛选到3个SNPs:C-32A、G+71A和G+158A,其中G+71A为错义突变,导致编码的丙氨酸(Ala)变为苏氨酸(Thr);C-32A和G+158A均在内含子区,不参与氨基酸编码。SNPs位点对STAT5A基因RNA二级结构和STAT5A蛋白结构均有一定影响。     

略阳乌鸡酪氨酸酶基因(TYR)遗传变异分析

试验通过PCR-SSCP技术检测略阳乌鸡酪氨酸酶基因(TYR)部分启动子区、全部外显子和部分内含子的遗传多样性,并对不同基因型进行了测序和比对分析。结果表明,略阳鸡群体在TYR位点具有较为丰富的遗传变异,在所检测的启动子区有2个单核苷酸多态(SNP)位点;外显子1有2个SNP位点,外显子2、3、4没有检测到变异位点,外显子5存在5个SNP位点;检测的部分内含子2中发现2个SNP位点。mRNA上的7个变异位点有3个发生在编码区,但都是同义突变,没有造成氨基酸变异。表明略阳乌鸡和普通鸡的酪氨酸酶没有氨基酸序列差异,TYR基因在鸡的遗传上是高度保守的。启动子区和内含子区的遗传变异是否与酪氨酸酶的转录剪接和表达量有关,进而影响乌鸡黑色素的沉积还有待进一步研究。     

牦牛PPARδ基因多态性与生长性状的相关性

【目的】揭示牦牛PPARδ基因的遗传变异特征,发现与牦牛生长性状显著相关的候选分子标记,为牦牛分子育种积累基础资料.【方法】以96头牦牛血样为材料,运用DNA池测序和PCR-HRM等技术检测PPARδ基因的序列变异.【结果】检测到牦牛PPARδ基因内含子中2个SNPs.遗传变异特征分析显示,SNP1(g.10045A/G)和SNP2(g.10226A/G)位点属于中度多态性.连锁不平衡和单倍型分析表明,牦牛PPARδ基因2个多态位点之间为弱连锁,单倍型AA属于优势单倍型(频率为42.2%).方差分析表明,单个的SNP与牦牛生长性状有着显著或极显著的关联.【结论】牦牛PPARδ基因的2个SNPs与其生长性状显著相关,此结果可以应用于牦牛的分子育种实践.     

槟榔江水牛LALBA基因克隆及序列特征分析

【目的】α-乳清蛋白由LALBA基因编码,在乳糖合成中起着重要作用。近年在普通奶牛中发现该基因与泌乳性状关系密切,但在水牛中研究较少。为了揭示水牛LALBA基因的序列特征。【方法】本研究采用RT-PCR测序法对槟榔江水牛LALBA基因的编码区序列进行了克隆和生物信息学分析。【结果】槟榔江水牛LALBA基因的编码区全长429 bp,编码蛋白含142个氨基酸。其α-LA含有1个C型溶菌酶/乳蛋白家族结构域(AA20~138)和1个信号肽序列(AA19~20),无跨膜结构,是胞外分泌的亲水蛋白;其N末端疏水,C末端亲水;有4类功能活性位点。基于LALBA基因编码区序列的系统发育分析表明,槟榔江水牛与牛亚科物种聚在一起,揭示它们LALBA基因功能的相似性。在LALBA基因编码区共检测到5个SNP位点:c.63AG、c.107AG、c.147AG、c.249CT、c.291TC。这些变异位点全部处于Hardy-Weinberg不平衡状态,只有SNP107为异义替换,导致编码氨基酸由天冬氨酸变为甘氨酸。功能分析显示SNP107对槟榔江水牛α-LA功能没有影响。【结论】水牛LALBA基因的序列与其他牛科物种长度相同,其编码产物的结构、功能与其他牛科物种相似。本研究可为进一步研究LALBA基因在水牛泌乳过程中的作用机制奠定基础。     

贵州黑山羊STAT5A基因第13外显子SNP研究

利用贵州黑山羊构建DNA池,设计引物扩增STAT5A基因第13外显子及部分内含子序列。利用生物信息学软件分析SNPs位点对STAT5A基因RNA二级结构、STAT5A蛋白二级及三级结构的影响。结果表明,在扩增的STAT5A基因中筛选到2个SNPs:T+1641G和G+1248T,其中T+1641G为脯氨酸(Pro)的同义突变,G+1248T为错义突变,导致编码的缬氨酸(Val)变为苯丙氨酸(Phe)。SNPs位点对STAT5A基因RNA二级结构和STAT5A蛋白结构均有一定影响。     

基于线粒体控制区变异的水牛群体遗传分析

为探讨沼泽型水牛与河流型水牛之间的线粒体D-loop区差异与进化关系,对26头广西本地水牛、8头贵州贵阳水牛、11头广西水牛与河流型水牛杂交后代、9头尼里拉菲和12头摩拉水牛(共5个群体66头水牛个体)的线粒体全长D-loop序列进行了扩增测序分析.结果发现66头水牛912 bp的D-loop多重序列比较有147个多态位点,形成58个单体型,沼泽型水牛与河流型水牛单体型明显分成2簇.以牛为外群构建的单体型进化树显示,沼泽型与河流型水牛分成明显2大支,河流型水牛聚成1支,而沼泽型水牛内部又分成2个侧支.通过Median joining net-work分析亦发现3个不同的簇,与进化树分析结果一致.对该区碱基错配分布分析表明,水牛群体在历史上发生2次独立的群体扩增事件.为进一步验证试验结果,从GenBank下载了211条水牛D-loop序列与笔者研究获得的序列整合分析,在共有序列878 bp区域中,包含了158个多态位点和129个单体型,以牛为外群的进化树分析与单体型网络分析表明,沼泽型水牛分成2簇,所有的河流型水牛聚集成紧密的1簇.碱基错配分布分析结果呈现2个明显的峰,进一步推断水牛群体在历史上发生过2次较大的群体扩增事件.综合上述研究结果推断,沼泽型水牛与河流型水牛来自不同的家养化事件,沼泽型水牛起源于中国,其祖先可能存在2个基因池.     

牦牛VGLL2基因多态性与体尺性状的关联性分析

【目的】为进一步揭示VGLL2基因多态性与牦牛体尺性状的相关性,通过筛查候选基因SNP位点,为牦牛优良性状选育提供参考。【方法】选取四川麦洼牦牛,西藏类乌齐牦牛、申扎牦牛、帕里牦牛和斯布牦牛5个群体共238头个体,运用DNA池测序法筛选VGLL2基因SNP位点,直接测序法检测牦牛VGLL2基因的SNP位点,分析其与体尺性状的关联性。【结果】牦牛VGLL2基因第二内含子存在3个SNP位点(C4868T、C4872G和G4889A),第二外显子包含1个SNP位点G5000A;4个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态。遗传多态性分析显示,C4868T、C4872G和G4889A属于低度多态性,G5000A为中度多态性。4个SNP位点不同基因型与体高、体斜长、胸围、管围和体重等生长性状进行相关性分析结果表明,位点C4868T与体高、体斜长、胸围和体重显著相关;位点C4872G、G4889A和G5000A与体高、体斜长、胸围、管围和体重不相关。【结论】牦牛VGLL2基因的C4868T位点与体高、体斜长、胸围和体重显著相关,可将VGLL2基因作为影响牦牛生长性状的主效基因,为牦牛选育工作提供理论依据。     

沼泽型水牛VASA基因启动子的克隆及转录活性检测

【目的】克隆沼泽型水牛VASA基因5′侧翼序列,对启动子进行生物信息学分析及转录活性检测,为后续水牛繁殖性能的分子机理研究奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的河流型水牛(Bubalus bubalis)的VASA5′侧翼序列,经过同源比对,设计PCR引物。以沼泽型水牛血液基因组为模板扩增VASA基因5′侧翼序列并进行测序和生物信息学分析。将扩增的VASA基因5′侧翼片段插入pEGFP-1多克隆位点处,构建pVASA-EGFP-1载体。载体经脂质体转染HEK-293T和CHO细胞系,分析其转录活性。【结果】成功克隆沼泽型水牛VASA 5′侧翼序列及部分CDS区序列,共3 081bp,同源性分析表明,沼泽型水牛VASA基因5′侧翼序列与河流型水牛、黄牛、绵羊、山羊、小鼠和人的相似性分别为99%,96%,93%,95%,90%和79%。对其5′侧翼序列2 000bp进行启动子预测及转录因子结合位点预测,发现在其翻译起始位点上游-635--586处存在TATA box,启动子区存在Nobox、Stat1、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6、Gata3、Smad2、Smad3和Smad4等反式作用因子结合位点,其中Stat家族基因在VASA启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个Stats基因结合的情况。水牛VASA启动子能启动EGFP在HEK-293T细胞中的表达,但非常微弱;能启动EGFP在CHO细胞中表达,且启动活性与CMV启动子相似。【结论】成功克隆了沼泽型水牛VASA基因启动子,分析了其启动子序列特征并成功验证其组织特异性和转录活性。     

水牛DGAT1基因第17外显子多态性及其与乳成分含量的关联性分析

 二酰甘油酰基转移酶1（DGAT1）在乳脂合成过程中发挥重要作用,但水牛DGAT1基因第17外显子遗传多态性及其与产奶性状的关联性还不清楚。本文采用PCR-SSCP结合DNA测序方法对48头德宏水牛和93头产奶杂交水牛（F1: 摩拉水牛×德宏水牛）的第17外显子进行了多态性检测并结合乳成分数据进行了关联分析。在水牛DGAT1基因第17外显子发现1个SNP位点,即c.1350C＞G,其为同义替换。该SNP位点在德宏乳用和非乳用水牛中群体遗传组成相近,且不同基因型个体间的乳糖率、乳脂率及乳蛋白率无显著差异（P>0.05）。表明该SNP对水牛乳糖率、乳脂率及乳蛋白率等无显著影响。序列比对显示,水牛、普通牛、瘤牛、山羊和绵羊DGAT1基因第17外显子间仅存在1个编码氨基酸差异,揭示其具有较高的保守性。