巴拉圭瓜多竹CCR基因的克隆与分析

肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-Co A reductase,CCR)是木质素生物合成途径中关键酶。本研究依据转录组数据设计特异性引物,采用RT-PCR方法成功地从巴拉圭瓜多竹(Guadua paraguayanan)中克隆得到一个全新的CCR基因的全长cDNA序列,命名为GpCCR。序列分析结果表明,GpCCR包含完整的c DNA开放阅读框(ORF),由1065bp组成,编码354个氨基酸。Blast比对结果显示该蛋白质属于CCR家族蛋白;系统进化树结果显示瓜多竹与禾本科植物大麦、水稻等亲缘关系较近。荧光定量PCR检测显示GpCCR在巴拉圭瓜多竹的茎秆中表达量最高,在叶中表达量最低。     

七彩虹竹4-香豆酸辅酶A连接酶基因(Ih4CL)的克隆及功能分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)是苯丙烷类代谢途径的关键酶,在上游调控木质素代谢、黄酮代谢。本研究根据转录组数据设计的1对特异引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法从七彩红竹1年生红秆中克隆到4-香豆酸辅酶A连接酶基因Ih4CL,该基因包含1 677bp完整的c DNA开放阅读框,编码558个氨基酸;生物信息学方法对Ih4CL编码的氨基酸蛋白序列进行的分析表明,Ih4CL与禾本科植物4CL蛋白具有较近的亲缘关系,其中与短花药野生稻的同源性达88%;荧光定量PCR检测结果显示Ih4CL基因在七彩红竹的嫩叶中的表达量明显低于茎秆中的表达量。     

杉木木质素合成酶基因CCR的克隆和序列分析

以杉木(Cunninghamia lanceolata)茎叶为材料,根据已报道的肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)基因保守区设计简并引物,采用RT-PCR结合RACE的策略克隆获得杉木CCR基因的全长cDNA(命名为CLCCR),该基因cDNA序列全长1 379 bp,具有一个975 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,简称ORF),编码324个氨基酸,序列分析表明:杉木CCR基因核苷酸序列与已报道的欧洲云杉(Picea abies,CAK18610.1)CCR基因具有87%的相似性;与其他植物氨基酸序列聚类分析显示杉木与松科植物欧洲云杉、马尾松(Pinus massoniana)、火炬松(P.taeda)的亲缘关系较近。     

巴拉圭瓜多竹CAD基因的克隆与分析

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD,EC1.1.1.195)是木质素生物合成途径中的最后关键酶,在木质素的生物合成中发挥关键作用。本研究依据转录组数据设计特异性引物,采用RT-PCR方法成功地从巴拉圭瓜多竹中克隆得到一个全新CAD基因的c DNA全长序列,命名为GPCAD(Gene Bank登录为KJ784465)。序列分析结果表明,GPCAD基因片段包含完整的c DNA开放阅读框(ORF),序列全长1 080bp,编码含有359个氨基酸残基的蛋白质。Blast比对结果显示该蛋白质属于CAD家族蛋白;系统进化分析结果显示巴拉圭瓜多竹与禾本科植物亲缘关系较近;荧光定量PCR技术检测结果显示GPCAD在茎秆中表达量最高,叶中的表达量最低。本研究对巴拉圭瓜多竹CAD基因进行克隆与分析,为深入研究巴拉圭瓜多竹木质素代谢途径相关基因以及通过分子生物学手段对木质素的含量和单体比例进行调控提供科学依据。     

巨龙竹AINTEGUMENTA基因的克隆研究

为进一步探索臣龙竹速生与巨大的分子机理,研究其AINTEGUMENTA（ANT）基因功能,研究试验以巨龙竹cDNA第一链为模板,用简并引物、基因特异引物以及运用RACE技术首次克隆出巨龙竹ANT基因全长cDNA序列。其序列全长为1914bp,与水稻、玉米、小麦等植物同类基因序列相似性高达85％;并且含有一个837bp的开放阅读框,编码278个与水稻、拟南芥和烟草ANT蛋白氨基酸序列有着较高同源性的巨龙竹ANT前体蛋白氨基酸序列。     

杜仲PAL基因cDNA全长序列特征分析

苯丙素类化合物的合成过程中,苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物苯丙烷类合成的第1个关键酶。为了解杜仲苯丙氨酸解氨酶基因序列信息,为杜仲苯丙素类高效合成的分子调控提供科学依据,对杜仲PAL基因cDNA和基因组全长序列特征进行了系统的生物信息学分析。结果表明,杜仲的EuPAL1基因的全长cDNA,其长度为2 133 bp;该基因共编码711个aa,酶蛋白相对分子质量77.14 kD,等电点6.24,属于稳定疏水性蛋白;编码蛋白二级结构是以α-螺旋和螺环结构为主的混合型结构,属于lyase-I-like蛋白超家族。     

杉木木材形成过程扩展蛋白基因的克隆与表达分析

扩展蛋白是一类细胞壁结合蛋白,在一定的pH值下无需任何激活蛋白就可诱导细胞壁的伸展。以杉木木材形成的特异表达基因文库中获得的扩展蛋白ESTs序列为基础,通过RLM-RACE技术成功克隆到3条全长扩展蛋白基因。其中ClEXPA1 cDNA全长1033 bp,包括247个氨基酸的开放阅读框(ORF)区;ClEXPA2cDNA全长1374bp,包括268个氨基酸的开放阅读框;ClEXLA1cDNA全长1023bp,包括272个氨基酸的开放阅读框。进化树重建结果表明:ClEXPA1和ClEXPA2属于α-expansin(EXPA);ClEXLA1属于γ-expansin(EXLA)。实时定量PCR显示:ClEXPA1和ClEXPA2具有较为相同的表达模式,在形成层区域表达最高,在针叶及茎尖中度表达,成熟木质部表达较低,而根和花粉中几乎不表达;ClEXLA1在形成层及针叶中均有较高的表达,在木质部及茎尖中度表达,花粉中表达较低,而根中几乎检测不到。该组扩展蛋白的成功克隆,将为系统研究扩展蛋白在木材形成过程中的表达、功能及调控机制提供基因资源。     

杜仲MVA途径相关基因全长cDNA序列特征研究

杜仲幼果和成熟果转录组测序的基础上,分离鉴定了幼果和成熟果MVA途径ACOT、HMGS、HMGR基因全长cDNA序列,并对基因的核苷酸序列及其相应氨基酸序列的组成成分、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二、三级结构、分子系统进化等进行分析。EuACOT基因全长cDNA为1 248 bp,编码416个氨基酸,属于稳定疏水性蛋白,无明显的跨膜区,在进化上分属于不同的分类群,与烟草和番茄的ACOT蛋白间的亲缘关系最为接近;EuHMGS基因全长cDNA为1 356 bp,编码452个氨基酸,属于不稳定的疏水性蛋白,无明显的跨膜区,在进化上分属于不同的分类群,与茶树的HMGS蛋白间的亲缘关系最为接近;EuHMGR基因全长cDNA为1 770 bp,编码590个氨基酸,属于不稳定的疏水性蛋白,有两个较明显的跨膜区,在进化上分属于不同的分类群,与杜仲的HMGR蛋白间的亲缘关系最为接近;以上三个蛋白的二级结构均是以α-螺旋和螺环结构为主的混合型结构。     

白桦果胶甲酯酶抑制剂(PMEI)基因克隆及序列分析

从白桦(Betula platyphylla Suk.)cDNA文库中获得1个果胶甲酯酶抑制剂(PMEI)基因全长cDNA序列,该序列去除polyA后长946 bp,其ORF全长624 bp,编码208个氨基酸,编码蛋白的分子量22 486.4D,理论等电点为10.09,保守区分析确定其含有PMEI蛋白保守序列,属于植物PMEI超家族。该结果为研究白桦细胞壁代谢的分子调控奠定了基础。     

尾叶桉GLU4肉桂酰-辅酶A还原酶基因克隆及原核表达

肉桂酰-辅酶A还原酶(Cinnamoyl Co-A Reductase,CCR)是木质素合成中的关键酶,根据植物中CCR保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4嫩茎为材料克隆到其CCR基因,命名为Eu CCR。该基因g DNA长2 918bp,c DNA长1 045 bp,CDS区编码336个氨基酸。EuCCR核酸序列与Gen Bank已登录的桉属植物CCR基因同源性达到96%以上,与伞房属、杯果木属植物CCR的同源性达85%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整FR_SDR_e结构域及NADP结合位点和底物结合位点,与可可树等植物中CCR基因编码序列同源性也在84%以上,确定为CCR基因。对EuCCR蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA软件对基因序列进行系统进化树分析。采用pQE30/M15系统对EuCCR进行原核表达,重组质粒成功表达分子量约36 kD的目的蛋白。本研究从尾叶桉GLU4中克隆得到EuCCR基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。     

超声-弱碱协同作用下巨龙竹木质素的分离及表征

巨龙竹是一种具有极高研究和开发价值的大型经济用材竹种,其基础理化性质有待进一步解析研究。为表征巨龙竹木质素的化学结构,在超声-弱碱协同作用下处理竹材原料,脱蜡竹粉在2%NaOH溶液中分别经超声处理5,20,40,60和90 min,并设置仅在2%NaOH溶液中抽提90 min的对照组,最后得到6个木质素样品L_1~L_6。采用红外光谱(FTIR)、核磁共振碳谱(~(13)C NMR)和二维核磁共振(2D HSQC)分别对分离得到的巨龙竹木质素进行结构分析。结果表明:超声-弱碱协同处理对竹材木质素具有良好的促溶效果,随着超声作用时间的增加,木质素得率从6.6%提高到22.9%;巨龙竹木质素大分子主要由愈创木基(G)、紫丁香基(S)和对羟基苯基(H)结构单元构成,属于禾草类木质素(GSH型);巨龙竹木质素大分子的主要联接键为β-O-4'醚键,其次是β-β'和β-5'结构;但随着超声处理时间的增加,巨龙竹木质素中一定量的β-O-4'联接键会被打断。     

七彩红竹MYB转录因子基因的克隆与分析

MYB基因是最大的植物转录因子家族成员之一,在植物次生代谢、生长及发育过程中发挥着重要作用。利用RACE方法,从七彩红竹中克隆得到1个与MYB同源的基因,命名为Ih MYB4,并利用RTPCR检测Ih MYB4在不同组织部分表达情况。序列分析表明:Ih MYB4序列全长1044 bp,编码347个氨基酸,该蛋白含有2个MYB功能结构域,属于R2R3-MYB家族。系统进化分析表明:Ih MYB4蛋白可能是一类参与花青素生物合成调控相关的蛋白。RT-PCR检测表明Ih MYB4只有在微红的幼嫩竹秆中才表达,说明Ih MYB4参与七彩红竹中花青素生物合成的调控。     

油桐ALDH22A1和ALDH2C4基因克隆及其序列分析

为给油桐ALDH基因的结构与功能研究提供理论依据,以葡萄桐的近成熟种子为材料,根据油桐转录组测序结果设计引物,采用RT-PCR技术克隆了油桐ALDH22A1基因和ALDH2C4基因的全长cDNA序列。ALDH22A1的cDNA序列全长1 782 bp,编码593个氨基酸,该基因编码蛋白质的相对分子质量为65.60 kDa,理论等电点为6.62,蛋白二级结构以α螺旋为主,具有1个明显的跨膜结构,是稳定的非分泌蛋白。ALDH2C4的cDNA序列全长1 506 bp,编码501个氨基酸,该基因编码蛋白质的相对分子质量为54.82 kDa,理论等电点为6.58,蛋白二级结构以α螺旋为主,是不具有跨膜结构的膜外蛋白。BLASTp分析结果表明,这2个基因所编码序列与麻疯树、蓖麻的乙醛脱氢酶一致性最高,高达80%以上,含有醛脱氢酶基因家族的保守结构域。     

毛竹肉桂酰辅酶A还原酶基因PeCCR功能初步研究

[目的]为研究肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)基因表达对竹子木质素生物合成的影响,对毛竹(Phyllostachys edulis (Carrière) J. Houz.)中PeCCR基因的表达情况进行分析,并对PeCCR基因功能进行研究,以期为利用CCR基因在竹子中开展基因工程育种提供参考依据。[方法]采用实时定量PCR(qRT-PCR)方法对PeCCR基因在毛竹不同组织以及不同高度笋中的表达进行了分析,采用RT-PCR方法克隆了PeCCR基因的编码区,构建了基因过量表达载体,采用蘸花法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),采用溴乙酰法测定转基因植株茎木质素的含量。[结果]qRT-PCR结果表明:在毛竹实生苗根中PeCCR的表达量最高,其次是笋中,而未展开叶中最低;在野外随着笋高度的增加,木质化程度加强,PeCCR基因的表达量呈上升趋势,在6.7 m笋中达到最高。克隆获得PeCCR编码区长度为1 026 bp,编码一个341 aa的蛋白,具有家族蛋白特有的保守结构域"NWYCYGK"。与野生型拟南芥相比,转PeCCR基因植株叶片明显增大,且抽苔时间提前3～4 d。...     

巨龙竹木质素化学结构研究

为解析巨龙竹木质素化学结构特征,采用高效阴离子交换色谱、凝胶色谱、傅里叶变换红外光谱、核磁共振等现代仪器分析技术,对巨龙竹木质素样品进行检测。结果表明:弱酸性环境有利于打断巨龙竹木质素与半纤维素之间的化学联接而使木质素更易于分离,且对木质素中的主要联接键破坏较小;巨龙竹木质素含有紫丁香基(S)、愈创木基(G)以及对羟基苯基(H)3种基本结构单元,属于禾草类木质素;巨龙竹木质素基本单元间化学联接键以β-O-4′结构为主,并存在一定量的β-β′、β-5′、β-1′化学联接。     

杜仲C4H基因cDNA全长序列特征分析

杜仲肉桂酸-4-羟化酶(C4H)是植物苯丙素类物质合成的关键酶之一。为了探明生物合成杜仲绿原酸的分子调控机制,对杜仲C4H基因全长cDNA进行了系统的生物信息学研究,鉴定了2个基因家族成员,分别为EuC4H1和EuC4H2,其全长cDNA分别为1 641 bp和1 611 bp;编码547和537个氨基酸,相对分子质量分别为62.94 kD和60.96 kD,等电点分别为9.34和8.85,均为疏水性不稳定蛋白质,其中EuC4H2是分泌蛋白;二级结构均是以α-螺旋、β-折叠、螺环结构并存的混合型结构,都属于Cypx超家族。     

1个油茶Y2SK2型脱水素的全长cDNA克隆及生理功能的预测

以构建的油茶EST文库为基础,采用电子克隆技术,分离克隆一个脱水素基因的全长cDNA序列,该基因的cDNA全长1 406 bp,含一个600 bp的CDS,编码200明的小分子蛋白.推测该基因编码蛋白的分子质量为21 ku,等电点7,暂命名为CoDHNI.同源性分析发现该基因的编码蛋白具有2个Y-片段(DEYGNP),1个S-片段(SGSSSSSS),2个K-片段(KIKEKLPG),属于典型的Y2sIQ型脱水素.经Blast比对,发现富含苏氨酸的Thr-区在各物种间变异显著,推测该区为油茶所特有,有利于在被保护的大分子表面形成水合层;同时还发现一个十分保守的基序:EDDGQGGRRKK,可能有利于脱水素的磷酸化和亚细胞定位.通过与柑桔和拟南芥的脱水素比较,提出CoDHNI有可能缓冲种子脱水胁迫响应时钙离子的瞬时增高,并可结合重金属离子,以减轻活性氧的危害.     

巨龙竹cDNA文库的构建

为了分离与鉴定巨龙竹速生巨大相关基因,以巨龙竹当年所发新叶为材料,用植物叶RNA抽提试剂盒提取了总RNA;采用C reatorTMSM ARTIMcDNA L ibrary construction k it所提供的方法,合成及纯化cDNA,并将cDNA连接到质粒载体上,通过C aC l2法将重组质粒转化到DH 5a中,成功构建了巨龙竹cDNA文库。文库容量为1.04×105,PCR检测表明大多数插入片段均大于1 000 bp,表明构建的巨龙竹cDNA文库质量较高,为进一步进行EST测序和全长基因克隆打下了基础。     

猴头菌MnP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆猴头菌 CB1锰过氧化物酶( MnP)基因,用于分析 He-mnp1基因及蛋白序列、基因的结构与功能,为研究猴头菌 MnPs基因功能、转录调控和构建优良工程菌株提供参考。【方法】根据 GenBank 中已报道的白腐菌MnPs基因cDNA序列的保守区域设计引物,采用简并PCR、逆转录RT-PCR、cDNA末端的快速扩增( RACE)等方法扩增出全长 cDNA基因序列,命名为 He-mnp1( GenBank 登录号为 HM116841.3),并对其猴头菌 He-mnp1基因进行生物信息学的分析。通过 NCBI 数据库进行 BLAST 同源搜索; ORF Finder 查找该基因的完整开放阅读框( ORF);利用Expasy数据库和BioEdit软件预测He-mnp1蛋白质的理化特性及氨基酸的组成;同时进行亲/疏水性及跨膜区的分析;采用 SignalP 4.1软件进行蛋白信号肽的预测;并利用 Clustal W 和 MEGA 5.1软件对 He-mnp1蛋白序列同源性比对和构建白腐菌MnPs系统发育树;利用数据库Conserved Domain Database( CDD)蛋白保守结构域的预测,查看 He-mnp1血红素、基质及锰、钙等结合位点;采用 PredictProtein 软件和 SWISS-MODEL 软件进行He-mnp1蛋白二级结构的预测和同源三维建模。【结果】该基因 He-mnp1的 cDNA 全长1279 bp,完整开放阅读框1080 bp,起始密码子 ATG,终止密码子 TAA,5'端非翻译区有68个核苷酸,3'端非翻译区有131个核苷酸,编码蛋白359 aa;生物信息学分析表明,猴头菌 He-mnp1氨基酸组成中丙氨酸含量最高,无酪氨酸,分子量为38.18 kDa,等电点为4.35,He-mnp1的蛋白有明显的亲水区,存在81－105、121－141间有2处疏水区域,此蛋白为亲水蛋白。He-mnp1蛋白质多肽前体包含1个18 aa的信号肽及1个5 aa的中间前导短肽。【结论】蛋白系统进化分析表明He-mnp1分布在第2组群,与平菇侧耳、冬生多孔菌、变色栓菌的 MnPs亲缘关系最为接近。He-mnp1基因存在1个保守结构域,分析显示为 Class Ⅱ类的真菌血红素过氧化物酶蛋白家族。He-mnp1蛋白二级结构预测α－螺旋占30.99%,β－折叠占3.38%,无规则卷曲占65.63%,属于稳定蛋白。He-mnp1蛋白三维建模,结果得到1个 Fe 血红素,2个 Ca2+、1个 Mn2+的结合位点及组氨酸残基等。     

欧美杨107木质素生物合成酶CCR基因的克隆及其鉴定

木质素作为草类饲料消化性的限制因子,直接影响饲料的利用率,而CCR是木质素生物合成关键酶之一。从正在分化的2a生欧美杨107次生木质部RT-PCR扩增出的基因片段,与pMD20-T载体连接,重组质粒经限制性内切酶酶切、特异引物PCR扩增和测序鉴定。结果表明该扩增片段长为961bp,含一个编码301氨基酸的完整开放阅读框,其核苷酸序列与Leple等发表的白杨杂种Populus trichocarpa CCR的cDNA序列(AJ224986)同源性达到98.2%,并且反向插入到pMD20-T载体,因此构建了CCR的反义大肠杆菌表达载体,为后续的基因操作打下基础。该基因序列已提交国际核苷酸序列库,登录号为AM921698。