猪肺炎支原体P46基因的原核表达与间接ELISA方法的建立

猪肺炎支原体是猪喘气病的病原体,本研究选择猪肺炎支原体P46膜蛋白基因亲水区序列进行克隆,并将其内3个编码Trp的TGA突变成TGG,然后再克隆到pET28a(+)载体中,在大肠杆菌BL21 (DE3)细胞内实现了高效表达,表达产物相对分子质量约为31 ku,约占菌体总蛋白35％,表达形式为包涵体,通过Western blotting 证明表达产物与猪肺炎支原体高免血清具有很好的反应原性和特异性.将大肠杆菌表达的猪肺炎支原体P46重组蛋白经过洗涤、过柱纯化后,作为间接ELISA包被抗原用于检测猪血清中猪肺炎支原体抗体,通过对各参数和试剂的优化建立了rP46-ELISA方法,获得了较好的效果,通过与现有ELISA检测方法的比较,结果表明二者间具有较高的符合率.     

The 18 kDa Antigen of Theileria equi is a Specific but Less Abundant Protein Also Expressed by Parasites Cultured In Vitro

A universally applicable test has not yet been developed for the reliable diagnosis of equine theileriosis, mainly because of the paucity of specific antigens and antigenic variation between different isolates. In this study, we used Theileria equi parasites cultured in vitro to identify potential diagnostic antigens. Using preparative isoelectric focusing to resolve the proteins in a lysate of infected erythrocytes, we identified an 18 kDa component of the parasite as a specific but poorly expressed antigen. This antigen also appears to have conserved epitope(s) between the isolates from the New and the Old World, as positive sera from both European and South American horses recognize it. The recombinant replica of this antigen might be a valuable tool for inclusion in the development strategy for a diagnostic test.     

用重组核衣壳蛋白ELISA检测PRRSV抗体的研究

ＰＲＲＳＶ重组Ｎ蛋白ＥＬＩＳＡ检测人工感染猪血清７５份,与ＩＤＥＸＸ公司ＥＬＩＳＡ试剂盒及ＩＦＡ的符合率分别为９７．３％和１００％。检测疫苗免疫猪血清,阳性率１００％。在免疫后６ｄ就能检出抗体,比ＩＦＡ敏感。检测８５份我国田间猪血清,阳性率１８．８％。     

旋毛虫新生幼虫p46 000抗原基因的克隆及序列分析

应用旋毛虫感染猪血清，对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行了免疫筛选。对阳性克隆pBK-cMV-WN10的序列分析结果表明。cDNA全长为1352bp。含有1个1218bp的完整的开放阅读框架(ORF)，编码的多肽由406个氨基酸残基组成，其相对分子质量理论推导值为45900，等电点为5．43，N末端的信号肽及糖基化位点(NCS)表明其可能为分泌性糖蛋白，氨基酸序列19～156与158～295为重复区域，相似性为74％．C末端有1个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域，但旋毛虫p46000抗原与其他线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白结构有很大差异，可能已经失去半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的功能。PCR结果显示。从旋毛虫新生幼虫、肌幼虫、3日龄成虫和5日龄成虫cDNA中均扩增出此基因，表明此基因在旋毛虫各个时期均有表达。     

丝虫抗原的分离及在鹿脑脊髓丝虫病诊断中的应用

首次报道应用牛腹腔丝虫成虫破碎后 ,经SephadexG 2 0 0柱层析获得CG1 抗原 ,进行酶联免疫吸附试验 (ELISA)免疫诊断鹿脑脊髓丝虫病的新方法。结果证明 ,该种方法特异性强 ( 87 1 % ) ,敏感性高 ( 1∶640 0 )。通过对 380头假定健康鹿ELISA结果与虫检结果对比证明 ,2种诊断方法符合率为 1 0 0 %。ELISA法比虫检法检出率高 3 2 % ,因此 ,可以用ELISA代替虫检诊断鹿脑脊髓丝虫病     

用重组的牛巴贝斯虫棒状体蛋白1作为ELISA诊断抗原进行牛群中牛巴贝斯虫病的血清流行病学调查

用重组的牛巴贝斯虫棒状体蛋白1（Bc—RAP-1）作为ELISA诊断抗原,对采自青海省湟中县的120份奶牛血清样品,进行抗Bc—RAP-1特异性抗体的检测。结果检出7份阳性,阳性率为5．83％,说明该地区牛群存在牛巴贝斯虫的感染。     

坏死梭杆菌亚单位疫苗候选抗原蛋白的筛选、表达及免疫原性分析

试验旨在筛选坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum,Fn)外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)中的候选抗原蛋白,为Fn的亚单位疫苗研究奠定基础。采用Uniprot对Fn Omp序列进行预测,基于预测结果筛选拟表达蛋白,并根据GenBank中登录的Fn Omp相应基因序列设计特异性引物,以QL03株为模板进行PCR扩增、原核表达,以及SDS-PAGE和Western blotting分析,并通过血清杀菌试验和小鼠免疫攻毒保护试验,鉴定重组蛋白的免疫原性,筛选最佳候选蛋白。结果显示,预测得到121个蛋白,顺次命名为1-Fn～121-Fn,根据预测结果筛选出8-Fn、11-Fn、41-Fn、95-Fn和102-Fn 5个候选蛋白,其PCR扩增产物大小分别为672、1 164、570、1 059、729bp。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,除8-Fn未表达外,其余4个蛋白均成功表达,大小分别为60、39、59、44ku,命名为P11-Fn、P41-Fn、P95-Fn和P102-Fn,均能与Fn阳性血清反应。血清杀菌试验结果显示,4个重组蛋白均有一定杀菌效果,其中抗P102-Fn血清的杀菌效果最佳,杀菌率可达40.49%。小鼠免疫保护试验结果显示,P11-Fn、P41-Fn、P95-Fn和P102-Fn对小鼠均具有一定的保护效果,其中P102-Fn保护效率最高,达60%。结果表明,P11-Fn、P41-Fn、P95-Fn和P102-Fn均具有良好的免疫原性,其中P102-Fn的免疫原性及诱导机体产生保护免疫反应能力最佳,最有望成为Fn亚单位疫苗的候选蛋白。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白间接ELISA诊断方法的建立和应用

以纯化的原核表达的猪圆环病毒2型（PCV-2）重组结构蛋白（rCap蛋白）为包被抗原,建立PCV-2间接ELISA诊断方法;对抗原最适包被浓度、待检血清稀释浓度、重组抗原包被条件、封闭液的筛选、阴阳性临界值等条件进行了优化;对优化后的ELISA检测方法进行特异性试验、临床应用试验;组装试剂盒并进行试剂盒保存期试验。优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2.815 μg/mL,抗原最佳包被条件为37 ℃ 2 h;血清最适稀释度为1∶40,酶标抗体最适稀释度为1∶500,最佳封闭液为1% BSA;阴阳性临界值判定标准为D450 nm≥0.33,判为阳性,D450 nm＜0.33,判为阴性。特异性试验结果表明,只有PCV-2阳性血清反应后的D450 nm＞0.33,包括抗PCV-1阳性血清在内的其他5种抗血清反应后的D450 nm＜0.33,说明所建立的ELISA方法具有良好的特异性。经对临床疑似PCV-2感染的100份血清样品进行检测,阳性检出率为69%。组装试剂盒在4 ℃条件下至少可保存12个月以上,说明所建立的诊断方法可以在生产中大量推广应用。本研究成功建立了能特异性检测抗PCV-2血清抗体的ELISA检测方法。     

口蹄疫病毒特异性抗体间接ELISA检测方法的建立

以Chap10-VP1融合蛋白为包被抗原。建立了检测口蹄疫病毒特异性抗的间接ELISA方法。抗原包被浓度为50μg／L时。血清最佳稀释度为1：400，病毒与阳性血清的反应可被Chap10-VP1蛋白阻断，检测的灵敏度为1：1600。     

绵羊高繁殖力候选基因BMPR-IA的研究

以骨形态发生蛋白受体IA（bone morphogenetic protein receptor IA，BMPR-IA）基因为候选基因，采用PCR—SSCP技术检测该基因在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊、湖羊）以及低繁殖力绵羊品种（多赛特羊、特克塞尔羊、德国肉用美利奴羊）中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明：在小尾寒羊中检测到AA、AB两种基因型，在湖羊中只检测到一种基因型BB，而在低繁殖力的3个绵羊品种中只检测到一种基因型AA。统计结果表明：小尾寒羊A等位基因频率为0．964，B等位基因频率为0．036。测序结果表明：BB型与AA型相比有6处核苷酸发生了突变。独立性检验表明：外尾寒羊与低繁殖力绵羊品种间基因型分布差异不显著（P〉0．05），而湖羊与小尾寒羊、低繁殖力绵羊品种间基因型分布差异极显著（P〈0．001）。AB基因型小尾寒羊平均产羔数比AA基因型多0．15只，但差异不显著（P〉0．05）。研究表明：BMPR-IA基因不是小尾寒羊和湖羊高繁殖力的主效基因。     

泰氏锥虫抗原制备及实验室诊断研究

应用体外培养的泰氏锥虫制备可溶性抗原Ⅰ、抗原Ⅱ和代谢抗原.经测定,其蛋白含量每毫升分别为6.5mg、7.4mg和7.1mg.薄层等电聚焦电泳测定结果表明,抗原Ⅰ出现22条区带,抗原Ⅱ21条区带,代谢抗原28条区带,对照的伊氏锥虫琼脂免疫扩散抗原14条区带.经分析,泰氏锥虫抗原和伊氏锥虫抗原有4条区带在同一迁移率上.琼脂免疫扩散反应中,3种泰氏锥虫抗原均与相应免疫兔血清发生沉淀反应,抗原Ⅰ出现1条致密沉淀线,抗原Ⅱ和代谢抗原出现2～3条沉淀线,抗原效价为1:4～16.免疫电泳显示了类似的结果,抗原Ⅰ与免疫兔血清出现1条弧形沉淀线,抗原Ⅱ和代谢抗原与免疫兔血清出现了3条弧形沉淀线.间接血凝试验结果表明,泰氏锥虫自然感染牛血清效价为1:20～40,免疫兔血清为1:1280～5120.所制泰氏锥虫抗原对伊氏锥虫和媾疫锥虫血清也能很好地发生交叉反应,3份伊氏锥虫病马血清和3份伊氏锥虫人工感染兔血清血凝效价分别为1:10～40和1:8～1024;5份媾疫马血清有4份血凝效价为1:20～320.4份环形泰勒虫病牛血清均为阴性.     

重组N蛋白抗原检测PPRV抗体ELISA的研究——试剂盒阴阳性临界值的测定及其与OIE参考实验室试剂盒的比较

对临床上采集的244份不同背景的羊血清样本,用纯化的重组N蛋白为包被抗原建立的检测小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体的间接ELISA进行检测,运用统计学方法摸清了检测结果的分布规律,并同时用OIE参考实验室抗体检测试剂盒进行检测,结果表明,两种检测方法的符合率为91.73%。利用TG-ROC软件分析了ELISA抗体检测临界值,该试剂盒与国外试剂盒相比,其相对特异性和敏感性分别为98.6%和85.4%。     

Prokaryotic Expression and Immunogenicity Identification of Bluetongue Virus VP7 Protein

To obtain VP7 protein of bluetongue virus (25 type), VP7 gene was amplified and cloned in pET-24b(+) expression vector.The pET-24b-BTV-VP7 recombinant plasmid was transformed into BL21 (DE3), then the VP7 protein of bluetongue virus was expressed using IPTG and purified by nickel affinity chromatography in vitro.Immunogenicity of VP7 protein was determined by Western blotting and ELISA.The results showed that the molecular weight of VP7 protein was about 40 ku and it could react with goat positive serum specifically.This study laid the foundation for establishing protein chip detection methods in the future.     

蓝舌病病毒VP7蛋白的原核表达及免疫原性鉴定

为获得蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)25型的VP7原核表达蛋白,本试验以蓝舌病病毒重组质粒为模板,PCR扩增VP7基因,将其克隆于pET-24b(+)表达载体中,获得pET-24b-BTV-VP7重组质粒。经酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达His-BTV-VP7蛋白。在变性条件下用镍亲和层析柱纯化His-BTV-VP7蛋白,经Western blotting及ELISA鉴定其免疫原性。结果显示,His-BTV-VP7蛋白以包涵体形式表达,大小约为40 ku;Western blotting和ELISA检测此原核表达蛋白能与山羊阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性。本研究为后续建立蛋白芯片检测方法奠定了基础。     

Detection of pseudorabies virus antibody in swine serum and oral fluid specimens using a recombinant gE glycoprotein dual-matrix indirect ELISA

Pseudorabies (Aujeszky disease) virus (PRV) was eliminated from domestic swine in many countries using glycoprotein E (gE)-deleted vaccines and serum antibody gE ELISAs, but PRV continues to circulate in some regions and in most feral swine populations in the world. We created a dual-matrix (serum and oral fluid) indirect IgG gE ELISA (iELISA) and evaluated its performance using samples from 4 groups of 10 pigs each: negative control (NC), vaccination (MLV), PRV inoculation (PRV), and vaccination followed by challenge (MLV-PRV). All serum and oral fluid samples collected before PRV challenge and all NC samples throughout the study were negative for gE antibodies by commercial blocking ELISA (bELISA) and our iELISA. Nasal swab samples from 9 of 10 animals in the PRV group were gB quantitative PRC (qPCR) positive at 2 days post-inoculation (dpi). The oral fluid iELISA detected a significant S/P response in the PRV (p = 0.03) and MLV-PRV (p = 0.01) groups by 6 dpi. ROC analyses of serum bELISA (n = 428), serum iELISA (n = 426), and oral fluid iELISA (n = 247) showed no significant differences in performance (p > 0.05). Our data support the concept of PRV surveillance based on oral fluid samples tested by an indirect gE ELISA.     

猪生殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及其用作诊断抗原的研究

对猪生殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）核衣壳蛋白（Ｎ）作为ＥＬＩＳＡ抗原进行了研究，将编码ＰＲＲＳＶＮ蛋白的基因０ＲＦ７ｃＤＮＡ插入杆状病毒表达载体ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａ，通过同源重组获得了重组杆状病毒ＯＲＦ７－ＡｃＭＮＰＶ，感染昆虫细胞ＳＦ９表达了Ｎ蛋白，占细胞总蛋白的７．０７％，纯化后作为抗原建立了间接ＥＬＩＳＡ，与ＩＤＥＸＸ公司的ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒有９６％的符合率，与ＩＦＡ有１００％的符合率。试验证实：ＰＲＲＳＶＮ蛋白在昆虫细胞中得到高效表达且是检测ＰＲＲＳＶ抗体的良好抗原。