橡胶树捕光叶绿素a/b结合蛋白基因CAB2的克隆与分析

基于电子克隆结果,采用RT-PCR技术从橡胶树的叶片中分离到1条858 bp的cDNA。结果表明:该序列含有1个798 bp的开放读码框,将基因命名为HbCAB2;HbCAB2预测编码265个氨基酸,其中包含35个残基的叶绿体信号肽,成熟蛋白的理论分子量为24.66 kDa、等电点为4.99;前体蛋白含有1个保守的捕光叶绿素a/b结合蛋白结构域(Chloroa_b-bind,PF00504),包含3个跨膜螺旋和2个短螺旋、1个三聚化基序以及多个叶绿素和类胡萝卜素结合位点,可归为LHCB1亚类;HbCAB2与HbCAB1属于反式串联重复,两者在蛋白水平的序列相似性高达97.0%。表达分析显示,HbCAB2倾向于在叶片和雌花中表达,且其表达水平随着叶片的成熟而逐渐增加,但在衰老叶片中显著下调。此外,基因的表达还受病原侵染、干旱和低温胁迫抑制。     

水稻编码光系统Ⅱ相关捕光色素蛋白Lhcb2基因的克隆与表达分析

捕光复合物蛋白(LHCP)在植物光合作用过程中发挥重要的作用。基于水稻基因组信息,以亚洲栽培稻籼稻品种黄华占、长雄蕊野生稻及其杂种F_1为试验材料,克隆了水稻Lhcb2基因,并对其基因内含子信息、蛋白序列特征、进化树、蛋白结构、基因表达进行分析。结果表明:水稻Lhcb2基因全长880 bp,含有1个长98 bp的内含子。开放阅读框长度为792 bp,编码263个氨基酸;水稻LHCB2与13个其他植物的LHCB氨基酸序列一致性为68.78%。进化树分析显示,水稻LHCB2蛋白与同属禾本科的毛竹和麻竹亲缘关系最近,与低等植物团藻亲缘关系最远。水稻LHCB2蛋白属于亲水性蛋白,其理论分子量为28 495.40,理论等电点为5.62,具有2个无序化区域,无序化比例为30.04%;水稻LHCB2蛋白三级结构有2个β折叠和3个α螺旋组成。Lhcb2基因荧光定量分析结果显示,长雄蕊野生稻和杂交F_1代植株叶片中表达量分别为黄华占的1.22和1.96倍。长雄蕊野生稻中的叶绿素a和b、色素、类胡萝卜素等均高于黄华占及其杂交F_1代。长雄蕊野生稻叶绿素a的含量分别为另2份水稻材料的1.13和1.75倍,叶绿素b含量为1.10和1.60倍,色素含量则为1.13和1.72倍。     

桑树AKR2A伴侣蛋白基因的克隆及分析

通过RACE等生物学技术,从桑叶中克隆获得AKR2A同源基因。c DNA全长1 488 bp,ORF长为1 050 bp,编码349个氨基酸。编码蛋白预测分子量为37.31 ku,等电点4.43;富含螺旋结构,与同类蛋白同源性较高。盐胁迫后AKR2A在根组织中表达量上升,在不同桑树品种叶片中表达丰度存在差异。     

巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆和表达分析

以拟南芥和杨树的钙调蛋白氨基酸序列为探针,对橡胶树转录组数据库进行搜索,并设计引物进行PCR扩增,得到7个橡胶树钙调蛋白基因的c DNA序列,命名为Hb Ca M1-7。序列分析结果发现,Hb Ca M1-7的CDS序列均为450 bp,编码149个氨基酸,分子量为16.8 ku,等电点为3.95。其中,Hb Ca M1-6间氨基酸同源性为100%,Hb Ca M7与其他成员之间的氨基酸同源性为98%。在基因结构组织方面,Hb Ca M1-7均为一个内含子,且内含子的插入位置相同,但内含子的长度明显不同。从氨基酸序列同源性和进化关系分析结果可看出,钙调蛋白基因家族在进化上非常保守。在表达方面,Hb Ca M1-6在各组织中均有表达,除了Hb Ca M3在根中表达丰度相对较高,其他成员均在胶乳中表达丰度相对较高,而Hb Ca M7在各组织中的表达均比较低;乙烯利处理后,Hb Ca M2-7的表达均有一定的上升趋势,而在叶片发育过程中Hb Ca M1-5碷呈明显下调表达。由此可见,橡胶树钙调蛋白与橡胶树叶片发育、胶乳乙烯信号通路具有一定的相关性。     

茶树CsLhcb4基因的电子克隆与生物信息学分析

采用电子克隆方法获得茶树CP29蛋白的c DNA序列(Cs Lhcb4),并进行相关生物信息学分析。结果表明,该基因包含1个858 bp的开放阅读框,编码285个氨基酸,分子量为31.1 ku,理论等电位点5.79。该基因为亲水蛋白,可能位于叶绿体上,属于叶绿素a/b连接蛋白超家族成员,其二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲,三级结构构建模型为单体形式。序列进化分析表明,茶树CsLhcb4基因编码蛋白与大豆、欧洲大叶杨和陆地棉进化距离最近。以上结果为进一步分析CsLhcb4的功能及花青素代谢中的作用奠定基础。     

马铃薯StPYL1和StPYL8基因的分子克隆与表达分析

PYL(Pyrabactin resistance like)是最新发现的一种ABA受体蛋白,在ABA信号转导过程中起着重要的作用。本研究采用RT-PCR方法从马铃薯品种Désirée中克隆St PYL1和St PYL8 c DNA序列(Gen Bank登录号:KJ660844、KJ660845)。St PYL1 c DNA开放阅读框长度为696 bp,编码一个由231个氨基酸残基组成的蛋白;St PYL8 c DNA开放阅读框长度为561 bp,编码一个由186个氨基酸残基组成的蛋白。结构分析显示:St PYL1蛋白含有3个α螺旋、3个β折叠;St PYL8蛋白含有2个α螺旋、4个β折叠;二者均含有START-like结构域;蛋白三级结构比较显示,St PYL1与拟南芥At PYL1相似,St PYL8与拟南芥At PYL9相似。系统进化树分析发现,St PYL1与苜蓿Mt PYR1、St PYL8与拟南芥At PYL8亲缘关系较近。组织表达分析结果表明,St PYL1和St PYL8在茎叶中均有表达,St PYL1在茎中表达最高,St PYL8在叶中表达强于茎。St PYL1和St PYL8在马铃薯块茎中都有所表达,但整个块茎发育阶段St PYL8表达量高于St PYL1。外源ABA处理诱导St PYL1和St PYL8上调表达,盐和干旱胁迫对St PYL8表达的影响大于对St PYL1的影响。     

橡胶树乳管表达多酚氧化酶基因HbPPO1的克隆与分析

根据EST序列设计引物,应用RACE和RT-PCR技术从橡胶树的胶乳(乳管细胞的胞质成分)中分离到1条长2 102 bp的c DNA,该序列包含1个1 803 bp的开放读码框(ORF),81 bp的5’UTR和218 bp的3’UTR;ORF预测编码600个氨基酸,其理论分子量为67.88 k Da,等电点为8.56,质体定位;蛋白含有多酚氧化酶特有的Tyrosinase、PPO1_DWL和PPO1_KFDV结构域;蛋白与木薯、蓖麻、麻疯树和胡杨中同源蛋白的相似性分别为85.2%、82.0%、79.8%和78.2%,将基因命名为Hb PPO1。结果表明,在所分析的胶乳、树皮和叶片组织中,基因在胶乳中的表达丰度最高,且其表达水平受乙烯利显著抑制。     

橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因HbCP3的克隆与表达特性分析

半胱氨酸蛋白酶是一类重要蛋白水解酶,其广泛参与植物的生长发育及各种生物与非生物胁迫的应答。根据EST序列信息设计引物,从橡胶树的根中分离到1条1 056 bp的c DNA。该序列包含1个1 023 bp的开放阅读框(ORF),13 bp的5'UTR和20 bp的3'UTR。ORF预测编码340个氨基酸,相对分子质量为37 350,等电点为5.24,属于液泡定位的分泌型蛋白。该蛋白含有1个Inhibitor_I29和1个Peptidase_C1A结构域,可归为木瓜蛋白酶C1家族。该蛋白与蓖麻(Ricinus communis)和杨树(Populus trichocarpa)中同源蛋白的相似性都在80%以上,将基因命名为Hb CP3。表达分析显示,在橡胶树的根、树皮、木质部、芽、叶片、叶柄和乳管等组织中,基因仅在根中表达。     

东亚飞蝗储存蛋白基因LmiHex-2的克隆与表达分析

昆虫储存蛋白是在昆虫体内普遍存在的一种特异性淋巴蛋白,在昆虫的生长发育过程中发挥着重要作用。为分析东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis储存蛋白基因Lmi Hex-2的结构和时空表达特性,通过RACE技术获得了Lmi Hex-2基因2 171 bp全长c DNA序列,其中开放阅读框2 022 bp,编码673个氨基酸,预测分子量78.79 k Da。序列比对结果显示Lmi Hex-2基因c DNA序列与直翅目蝗总科储存蛋白基因c DNA序列的相似性达到82%~89%。RT-PCR结果显示Lmi Hex-2基因在东亚飞蝗卵和若虫阶段均有表达,5龄6 d时表达量最大;成虫中脂肪体表达量最高。通过贝叶斯法构建的系统发育树显示直翅目储存蛋白为单系群,昆虫血蓝蛋白与昆虫储存蛋白聚为姐妹群,二者均由甲壳纲血蓝蛋白进化而来。     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的c DNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因c DNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因c DNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。     

蝴蝶兰热激蛋白基因PhHsp70序列分析及对冷胁迫的响应

通过RT-PCR和RACE相结合的方法从蝴蝶兰叶片中克隆了一个热激蛋白基因PhHsp70 c DNA序列(Gen Bank登录号为MG214259),该基因全长为2 239 bp,编码647个氨基酸,与多种植物的HSP70基因具有94%以上的相似性;其编码蛋白包含HSP70结构域,属于胞质型HSP70;系统进化分析显示,该蛋白与铁皮石斛的HSP70蛋白亲缘关系最近;PhHsp70基因在营养器官和生殖器官中均有表达,其中在根中表达水平最高,在花器官中表达水平较低;PhHsp70基因在4℃冷胁迫处理0.5 h表达水平下降,冷胁迫1 h后,表达水平升高,在处理24 h时表达水平最高。由此推测,PhHsp70基因参与蝴蝶兰4℃冷胁迫的生理反应。研究结果可为研究蝴蝶兰热激蛋白在低温胁迫响应中的调控机理提供理论基础。     

小麦α-双加氧酶cDNA克隆及表达分析

以普通小麦陕225为材料,同源克隆小麦脂肪酸α-双加氧酶基因(TaDOX)cDNA,全面分析其基因结构、染色体定位、进化关系及蛋白结构特征,并利用实时定量RT-PCR分析其在PEG和盐胁迫下的表达模式。克隆的cDNA片段长1 854bp,编码617个氨基酸残基的小麦脂肪酸α-双加氧酶。TaDOX基因组DNA长5 529bp,位于小麦5D染色体长臂,包含10个外显子。小麦、水稻等禾本科植物α-DOX序列高度同源,聚集在同一独立进化枝,而双子叶植物存在2类DOX蛋白,聚集在另外2个分枝中。TaDOX具有脂肪酸α-双加氧酶以α-螺旋为主的空间结构特征,包含血红素结合位点及保守氨基酸His310、Thr315、Tyr378、Arg558组成的活性中心。TaDOX主要在叶和根中表达,花序和种子中也有痕量表达;叶片中TaDOX的表达在PEG和盐胁迫条件均明显下降;根中TaDOX的表达在PEG胁迫条件下无显著变化,但在盐胁迫条件下表达水平急剧升高。     

甘蓝型油菜BnTIR1基因的克隆和表达特征分析

植物的转运抑制应答因子1(transport inhibitor response 1,TIR1)作为生长素的受体,在生长素信号的感知与转导过程中发挥重要作用。采用RACE技术从中双9号中克隆了甘蓝型油菜BnTIR1全长c DNA序列和基因组序列。BnTIR1的DNA序列为2 502 bp,包含2个内含子;c DNA序列为2 355 bp,ORF为1 824 bp,其编码蛋白含607个氨基酸。预测发现,BnTIR1蛋白存在AMN1保守结构域。qRT-PCR结果表明,BnTIR1在甘蓝型油菜根、茎、叶、芽、花、角果中均有表达,但表达水平不同,在叶中表达水平最高,花中最低;干旱和ABA均可诱导BnTIR1表达,暗示其可能参与植物逆境胁迫响应过程。     

花生AhFAD2-2基因的克隆与表达分析

脂肪酸脱氢酶(FAD)能够调节膜脂中不饱和脂肪酸的水平来提高植物对不良环境的耐受性。本研究利用RT-PCR方法从花生中克隆到2个脂肪酸脱氢酶基因,命名为AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2。序列分析结果显示,2个基因的ORF区均为1 152 bp,编码383个氨基酸;c DNA水平上有12个碱基差异位点,其中只有483位和720位的碱基差异引起氨基酸的改变;它们的基因组序列大小分别为5 089 bp和5 090 bp,在5'UTR区分别存在一个3 821 bp和3 822 bp的内含子。qRT-PCR分析结果显示,这两个基因为组成型表达,其中在叶片中的表达量最高,花和根中次之,茎与种子中表达量最低。低温处理下,幼苗叶片中AhFAD2-2基因的表达量在0.5 h时迅速增加,至12 h达最高值,随后表达量逐渐下降,说明AhFAD2-2的表达响应低温胁迫诱导。本研究结果可为花生的抗寒性遗传改良提供理论依据。     

甘蔗细胞色素b6-f复合体铁硫亚基(SoCYT)基因的克隆和表达分析

以甘蔗叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增细胞色素b6-f复合体铁硫亚基基因的c DNA,采用生物信息学软件分析所克隆基因的编码蛋白特性,并用荧光定量PCR分析该基因的表达情况。结果表明:克隆得到的c DNA片段长度为796 bp,包括1个579 bp的开放阅读框,编码192个氨基酸。甘蔗与高粱CYT基因c DNA序列的同源性为94.0%,氨基酸序列同源性为99.0%;该基因推导的蛋白分子量大小为20.67KD,等电点为6.24,疏水性分值在0.50~2.11;蛋白二级结构中α-螺旋占17.19%,随机卷曲占53.12%,延伸链占21.53%,β-转角只占8.33%,Gen Bank登录号为JQ712582。实时荧光定量分析结果表明,随着甘蔗干旱胁迫时间的延长,So CYT基因表达均呈下降的趋势,PEG与PEG加Si处理的So CYT基因的表达量有显著差异,加硅可减缓So CYT基因表达的下降速度和对细胞色素b6/f复合体的结构的损伤和影响。     

青天葵PAL基因序列特征和表达分析

在前期完成的青天葵(Nervilia fordii)转录组测序数据的基础上,采用生物信息学方法对3个青天葵PAL基因家族成员(NfPAL1、NfPAL2和NfPAL3)的c DNA序列及其编码蛋白质的氨基酸序列进行特征分析,并计算这些基因在青天葵叶片和球茎中的表达量。结果表明,从转录组数据中获得的3个青天葵PAL基因家族成员c DNA序列长度为1 743~2 091 bp,编码581~697个氨基酸。这些PAL基因编码包含苯丙氨酸解氨酶多功能域,并且不含跨膜结构域、信号肽和转运肽的亲水性稳定蛋白。3个青天葵PAL基因在青天葵中的表达呈组织特异性,其中,NfPAL1和NfPAL3在球茎中的表达量较高,而NfPAL2在叶片中具有较高的表达水平。     

禾谷镰刀菌甾醇14α脱甲基酶基因cDNA克隆及生物信息学分析

克隆获得禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)2个甾醇14α脱甲基酶CYP51蛋白(CYP51A、CYP51B)基因c DNA序列,明确其氨基酸序列典型特征,为研究蛋白质结构及其抗药性机制奠定基础。采用RT-PCR技术,克隆2个CYP51蛋白基因c DNA序列,利用相关生物信息软件对其序列进行生物信息学分析。结果克隆到2条c DNA序列,长度分别为1 524、1 581 bp,分别编码507、526个氨基酸;2个蛋白分子量分别为57.5、59.3 ku,等电点分别为6.93、7.08,不稳定系数分别为49.43、39.05;2个蛋白均含有细胞色素P450家族成员典型的保守结构域;不具有信号肽的属于非分泌性蛋白,具有跨膜结构域,是亲水性蛋白;蛋白质二级结构最主要的结构元件是α螺旋、无规则卷曲,并散布于整个蛋白中;亚细胞定位预测显示,CYP51A蛋白主要位于内质网及高尔基体等细胞器中,而CYP51B主要位于细胞质中。研究结果将为进一步研究CYP51蛋白生物学功能及其蛋白结构生物学提供参考。     

橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因HbCP2的克隆与表达特性分析

根据EST和基因组序列设计引物,应用RT-PCR技术从橡胶树的根组织中分离到1条长1056 bp的cDNA,该序列包含了1023 bp的开放读码框（ORF）,17 bp的5’UTR和16 bp的3’UTR;ORF预测编码340个氨基酸,理论分子量为37.52 kD,等电点为5.25,属于液泡定位的分泌型蛋白;蛋白含有1个Inhibitor_I29和1个Peptidase_C1A结构域,隶属于木瓜蛋白酶C1家族;蛋白与蓖麻、杨树中同源蛋白的相似性均在80％以上,将基因命名为Hb CP2。表达分析显示,在所分析的根、树皮、木质部、芽、叶片、叶柄和乳管等组织中,HbCP2仅在根中被检测到,表现出明显的组织特异性。     

巴西橡胶树锌指蛋白基因的克隆及功能鉴定

锌指蛋白是一类能与DNA/RNA结合并调控基因表达的蛋白。前期笔者通过酵母双杂技术筛选到1个可能与JAZ蛋白互作的巴西橡胶树锌指蛋白(命名为Hbzinc-finger),该基因的c DNA全长序列有2 262bp,编码753个氨基酸。该蛋白碳末端有1个PB1结构域,在336~381处氨基酸序列编码1个Zn F_ZZ锌离子结合结构域。红色荧光蛋白亚细胞定位结果表明,Hbzinc-finger定位于细胞核,酵母自转录激活显示该蛋白有自转录活性。该基因的表达受创伤影响,表明橡胶锌指蛋白的表达可能受茉莉酸信号调控。     

紫蕚S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(HvSAMS)的克隆与表达分析

利用RACE结合RT-PCR技术从紫蕚花中克隆出S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长,命名为Hv SAMS。该c DNA全长1 704 bp,ORF为1 191 bp,不含内含子,编码396个氨基酸的多肽。多种植物SAMS的氨基酸序列多重比较分析表明,Hv SAMS与牛奶子、木石斛和石蒜的同源性高达95%,具有SAMS蛋白典型的保守域,且与唐菖蒲的亲缘关系最近。半定量RT-PCR分析显示,Hv SAMS在花和叶中的表达高于根,茎中表达弱;Hv SAMS表达水平在衰花期呈极显著下降,在机械伤害的叶片中迅速显著上升。因其表达变化与乙烯的释放量相关性不大,表明Hv SAMS没有参与乙烯的生物合成。