马铃薯转录组测序研究进展

介绍转录组测序平台、实验方法、生物信息学分析及目前在马铃薯等高等植物中的应用,讨论了转录组测序在高等植物中研究的问题和新的方向,以供参考。     

基于转录组测序解析甜玉米耐低温发芽的相关基因

[目的]通过转录组测序分析低温下萌发能力不同的甜玉米自交系,鉴定甜玉米耐低温萌发的相关基因.[方法]利用低温萌发能力强的甜玉米自交系Scil-H7th为供体构建近等基因系,获得不同低温萌发能力的材料,通过生理指标测定、转录组分析和qRT-PCR,筛选分析与低温萌发相关的基因.[结果]对自交系在不同萌发时期和同一萌发时期...     

基于转录组测序的木薯性别决定相关基因挖掘

[目的]明确木薯不同性型花的转录组差异,为深入研究木薯多开雌花和两性花及协调木薯性别比例提供理论参考.[方法]以木薯雄蕾、雌蕾和两性蕾为供试材料,采用Illumina HiSeqTM 4000测序平台对其进行转录组测序,通过生物信息学对转录本进行比较分析,预测和筛选出木薯性别决定相关基因.[结果]通过转录组分析获得高质量序列(Clean reads)64189053个,高质量碱基19.29 Gb.3种花蕾的GC含量均在43.00%左右、Q30均在95.00%左右.木薯雄蕾、雌蕾和两性蕾的Clean reads总数分别为42642272、42172402和43563432条,其中,参考基因组和单端的比对率均在77.00%左右、多位置比对率均小于0.80%,正、负链比对率均在39.00%左右;约有90.00%的序列定位于外显子,仅有5.00%的序列定位于内含子或基因间区.在雄蕾—雌蕾(前者是对照,后者是处理,下同)、雄蕾—两性蕾和雌蕾—两性蕾3个对比组中分别筛选到3629、2499和2492个差异表达基因(DEGs),注释到GO功能数据库中的DEGs分别为2544、1749和1807个,其中,雄蕾—雌蕾对比组的上调表达基因和下调表达基因数量均最多.以富集于生物学过程(主要为代谢过程和细胞过程)的DEGs最多,其次是分子功能(主要为结合和催化)和细胞组分(主要为细胞和细胞部分);无论是注释到GO功能数据库的DEGs,还是注释到生物学过程、细胞部分和分子功能等主要次级分类中的DEGs,均以雄蕾—雌蕾对比组最多.3个对比组中均以参与激素信号传导的DEGs最多;且又以富集于一般功能预测的DEGs最多,其次是富集于转录的DEGs,富集于复制、重组和修复及信号传导机制的DEGs也较多,但雄蕾—雌蕾对比组大部分GOG功能类别的DEGs明显多于雄蕾—两性蕾和雌蕾—两性蕾对比组,而雄蕾—两性蕾与雌蕾—两性蕾对比组间差异不明显.3个对比组的DEGs富集于50条KEGG信号通路,其中以富集于植物激素信号传导的DEGs最多,共筛选获得88个与激素信号转导相关的DEGs,其中log2FC>3的基因有26个,且大多数为生长素相关的基因.木薯雄蕾、雌蕾和两性蕾间差异表达的转录因子基因有196个,log2FC>3的转录因子基因有87个,主要为ERF、bHLH、WRKY和MYB四大类转录因子基因.[结论]木薯不同性型花存在较多的DEGs,其中与生长素及ERF、bHLH、WRKY和MYB转录因子相关的基因均与木薯性别决定密切相关,可能是木薯性别分化的关键调控基因.     

玉木耳转录组测序及褐变相关基因的挖掘

为了从分子水平研究玉木耳褐变的机理,对褐变和未褐变的玉木耳子实体进行了转录组测序分析,共筛选到5915个差异基因,其中有924个Unigene上调表达,有4991个Unigene下调表达。通过基因本体(Gene Ontology, GO)富集分析发现,差异基因显著富集于细胞及代谢过程、单一有机体、细胞和细胞组分、细胞器和大分子复合体、结合作用和催化活性。KEGG代谢通路富集分析表明,富集程度比较显著的通路包括翻译通路、信号转导途径、内分泌系统、折叠排序及退化、运输和分解代谢通路。挑选与组织褐变相关的差异基因进行qRT-PCR表达模式验证,获得的结果与表达谱分析结果一致。     

玉木耳转录组测序及褐变相关基因的挖掘

为了从分子水平研究玉木耳褐变的机理,对褐变和未褐变的玉木耳子实体进行了转录组测序分析,共筛选到5915个差异基因,其中有924个Unigene上调表达,有4991个Unigene下调表达。通过基因本体(Gene Ontology, GO)富集分析发现,差异基因显著富集于细胞及代谢过程、单一有机体、细胞和细胞组分、细胞器和大分子复合体、结合作用和催化活性。KEGG代谢通路富集分析表明,富集程度比较显著的通路包括翻译通路、信号转导途径、内分泌系统、折叠排序及退化、运输和分解代谢通路。挑选与组织褐变相关的差异基因进行qRT-PCR表达模式验证,获得的结果与表达谱分析结果一致。     

基于转录组测序番茄抗南方根结线虫相关基因的挖掘

[目的]筛选番茄抗南方根结线虫侵染相关基因,为其克隆及番茄抗病育种提供参考依据.[方法]用Illumina HiSeqTM4000对南方根结线虫侵染和未侵染番茄抗性材料F5样本的转录组进行测序,基于差异表达基因本位数据库(G0)和Pathway显著性富集(KEGG)分析,挖掘参与抗南方根结线虫的相关基因.[结果]筛选到...     

葡萄牙牡蛎外套膜转录组测序及壳色基因挖掘

采用Illumina高通量测序平台对黑壳与金壳葡萄牙牡蛎(Crassostrea angulata)外套膜组织开展转录组测序研究,其中黑壳组总计产出5 857 718 092 nt数据,筛选后的干净阅读子58 004 560个;金壳组产出6 727 447 326 nt数据,干净阅读子66 614 854个。将发掘的新基因与COG、GO、KEGG、Swiss-Prot、NR数据库进行序列比对,最终得到各数据库注释的新基因数量分别为147、397、203、567、1 347个。通过对差异表达基因的序列进行生物学功能注释和聚类分析以及利用已知贝壳基质蛋白序列进行搜索,鉴定出14条可能与壳色表达有关的贝壳基质蛋白基因,其中5条下调基因可能与金壳基因表达相关。     

采后黄瓜在冷驯化处理过程中的转录组变化

采后黄瓜是冷敏性果菜类蔬菜,在低温贮藏时易发生冷害。前期研究结果表明,冷驯化处理通过诱导采后黄瓜耐冷性,减少冷害发生。为探究冷驯化处理诱导的转录组学变化,以采后黄瓜为试材,分析冷驯化处理期间的转录组变化。与贮藏前（0 h）相比,在冷驯化处理12 h和72 h时,分别鉴定到1 870和3 550个差异表达基因。基因表达验证结果表明,RT-qPCR和转录组结果高度一致,证明转录组测序数据的准确性和可靠性。GO富集分析结果显示,冷驯化处理诱导的差异表达基因主要富集在氧化还原过程、细胞膜组分和转录因子活性3个GO途径中,表明冷驯化处理通过调节细胞膜组分、细胞内氧化还原状态,增强冷藏黄瓜耐冷性。进一步分析发现,104个转录因子基因响应冷驯化低温,差异表达的转录因子主要是ERF、bZIP、WRKY和HSF家族,表明转录因子介导的转录调控在冷驯化诱导的耐冷性中发挥重要作用。研究结果为采后黄瓜诱导耐冷性提供了新见解,有助于加深对冷驯化诱导耐冷性分子机理的认识,为耐冷黄瓜培育提供了重要基因资源。     

马铃薯块茎膨大期叶片响应干旱与复水的转录组分析

以榆林市农科所提供的‘冀张薯8号’组培苗为试验材料,在马铃薯对水分比较敏感的块茎膨大期进行干旱与复水处理,利用RNA seq技术分析马铃薯叶片在干旱胁迫和水分刺激下的基因表达谱,采用q RT PCR技术验证RNA seq数据的可靠性。结果表明：随机选取的16个基因与转录组数据高度一致,进一步证明转录组数据的可靠性。在分子水平上,水分胁迫使马铃薯叶片中基因表达大幅调整,与ABA及环境胁迫诱导的基因、膜脂代谢相关基因大幅上调,复水后快速恢复。经KEGG富集分析,水分胁迫下叶片差异表达基因主要富集于次生代谢生物合成途径、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢等过程。复水后,与蛋白质合成、转录调控、吸水能力和有毒物质清除有关的基因大幅上调表达,以适应马铃薯干旱后复水的快速恢复以及补偿生长的要求。研究结果可为抗旱抗逆性的品种改良提供基因资源,同时为深层次揭示马铃薯抗旱机理提供理论基础。     

转录组测序筛选萨湖杂交羊肌肉和生长性能提升的关键基因

为解析萨湖杂交羊较湖羊肌肉和生长性能提升的关键基因和调控通路,本研究对出生2日龄和8月龄的萨福克和湖羊的杂种F₁代（SH）和纯繁湖羊（H）的体重、体高、体长、胸围和管围等生长数据进行比较分析。选取2日龄和8月龄绵羊每组各3只（共12只）,利用RNA-seq对背最长肌进行转录组测序,并对测序数据进行生物信息学分析。随机选取10个差异表达基因,通过qRT-PCR对其表达量进行验证。结果表明：1）出生2日龄和8个月的SH的体重、胸围、管围均极显著高于H（P<0.001）。2）在2日龄和8月龄SH与H中分别筛选得到684和248个基因显著差异表达,包括与骨骼肌生长发育相关的CDH1、GSTA1-1、GPX2、CDH17和MX2等基因。3）GO和KEGG分析结果显示2日龄SH和H差异表达基因主要富集在控制肌肉生长发育的细胞分化、核小体组织、肌动蛋白丝调控等类别中,8月龄SH和H差异表达基因主要富集在细胞-细胞粘附、谷胱甘肽代谢和PPAR信号通路等类别中。4）qRT-PCR试验结果与转录组测序相一致。综上,萨湖杂交羊在生长性能方面优于湖羊,CDH1、GSTA1-1和GPX2等基因通过G蛋白偶联受体、细胞-细胞粘附、谷胱甘肽代谢通路在萨湖杂交羊肌肉发育过程中发挥重要作用,本研究为探究调控杂交绵羊生长性能的关键基因和功能通路提供参考。     

基于Illumina平台转录组测序筛选牛卵泡发育调控基因

运用超声波监测技术,采集母牛发情期出现偏差前的第一大卵泡PDF1和出现偏差后的第二大卵泡ODF2,分别分离卵泡颗粒细胞(GCs),构建RNA文库,用Illumina2000测序;测序结果经数据库搜索和差异表达筛选,采用DAVID软件GO和KEGG pathway分析,经Genecards功能查询,筛选牛卵泡发育相关基因。结果表明:数据库搜索共获得35 325个基因,其中有意义的表达基因15 645个,从中筛选获得差异表达基因608个;GO分析表明,608个差异表达基因中参与生物过程的基因占60.46%,细胞组分的基因占20.08%,分子功能的基因占11.46%;KEGG pathway分析表明,608个差异表达基因通过9条信号通路参与牛卵泡发育调控(P0.05),经Genecards功能筛选,共获得11个与牛卵泡发育密切相关的调控基因——SESN3、COL3A1、CCNE1、CAV1、CACNA1H、ITPR1、PIK3R3、MYC、PTGFR、CDK6、GAPDH,它们直接参与细胞增殖分化及信号通路调节。     

转录组测序研究兰州百合抗冻关键基因及途径

【目的】百合 (Lilium) 是国家卫生部首批公布的药食同源植物,也是著名的观赏植物。低温冻害严 重影响植物的产量和分布,探究兰州百合对零下低温胁迫应答的分子机制。【方法】采用高通量 Illumina Hiseq 测序平台对兰州百合的 20℃常温对照与 -4℃寒冷处理 (D) 进行测序,并对测序数据进行分析研究。【结果】处 理 24 h 后检测到 24 465 个差异表达的基因,筛选后获得 4 143 个表达量上升的基因和 4 415 个表达量下降的基因, 占差异表达基因总数的 10.27%。【结论】经富集分析认为,与蛋白激酶、蛋白磷酸酶、碳代谢以及 ABA 等相关 的基因可作为研究兰州百合零下低温响应机制的主要研究对象。qRT-PCR 分析表明,随机选出的 10 个差异性 表达基因的表达趋势与高通量测序结果相一致。此外,吲哚 -3- 甘油磷酸合成酶、蛋白磷酸酶、已糖激酶、钙 结合蛋白、叶绿素 a/b 结合蛋白等基因可作为与兰州百合寒冷响应相关的应答候选基因,为揭示兰州百合抗冻分 子机制奠定了基础。     

基于高通量测序的杂交鳢转录组数据分析

运用高通量技术对杂交鳢进行转录本测序和数据分析,经拼接与组装,最终获得52 065条unigenes,长度范围201～12 407 bp,序列平均长度为710 bp。从长度分布、GC含量和基因表达量等方面对unigenes进行评估,数据显示测序质量较好。进一步的数据分析,共鉴定出20 535个CDS,37 324个SNP位点和7 830个微卫星。用6大数据库Swiss–Prot、Nr、Pfam、KEGG、KOG和GO注释杂交鳢转录组unigenes,分别对应有20 955、28 938、19 339、14 052、19 358和18 635条unigenes获得注释。根据GO数据库的注释,可将这些unigenes分为生物过程、细胞组分和分子功能3大类共50亚类。KEGG代谢通路分析表明,这些unigenes参与了5大类30亚类共268个代谢通路,其中,参与信号转导通路的unigenes数量最多,有1 716条。     

高粱苗期耐盐性转录组分析和基因挖掘

【目的】探究高粱耐盐胁迫响应机制,挖掘高粱耐盐胁迫基因,为高粱耐盐育种提供理论基础。【方法】 以高粱感盐品种L甜和耐盐品种石红137为供试材料,采用水培试验。待高粱植株长至三叶一心期,使用2%NaCl溶液对幼苗进行盐胁迫,分别设置0（对照）、1和24 h处理,每个处理3次重复。测定不同处理样品株高、根长、干物重、Na ⁺含量和叶绿素相对含量（SPAD值）,并依托Illumina HiSeq 2000平台进行转录组测序分析。利用FPKM方法计算基因表达量,在差异表达基因检测过程中,将差异表达倍数（fold change）≥2且FDR<0.001作为筛选标准。通过Gene Ontology和KEGG Pathway数据库对参与高粱不同时间盐胁迫差异表达基因进行分析注释。 【结果】 盐胁迫处理对高粱株高、根长、干物重等性状无显著影响,对钠离子含量和SPAD值影响显著。石红137株高、根长、钠离子含量和SPAD值均高于L甜。转录组测序结果鉴定得到已知基因26 628个,新基因866个。石红137中的差异基因数目高于L甜。石红137中,0 h VS 1 h、0 h VS 24 h、1 h VS 24 h三组的差异基因数目分别为375、4 206和3 750个。感盐品种L甜中,0 h VS 1 h、0 h VS 24 h、1 h VS 24 h三组的差异基因数目分别为167、2 534和1 612个。GO分析共获得25个功能注释,分别为光合作用、细胞物质代谢、翻译过程以及激素合成等与盐胁迫相关的差异表达基因。KEGG分析发现盐胁迫1 h表达差异基因富集在植物激素信号转导途径,涉及脱落酸（abscisic acid,ABA）、生长素（auxin,AUX）、细胞分裂素（cytokinin,CTK）、赤霉素（gibberellins,GS）、乙烯（ethylene,ETH）过程等共71个基因。盐胁迫24 h表达差异基因富集于光合作用相关途径,涉及Lhca、Lhcb、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase,PPC）、磷酸核酮糖激酶（phosphorylribonucleic kinase,PRK）等20个基因。类黄酮生物合成代谢途径差异可能是引起石红137和L甜的耐盐能力差异的原因之一,花青素还原酶（anthocyanidin reductase,ANR）和黄酮醇合成酶（flavonol synthase,FLS）参与类黄酮生物合成途径。【结论】 高粱的盐胁迫过程是一个复杂的生物过程,依赖于多个基因在复杂网络中的平衡表达。盐胁迫条件下,高粱应对环境刺激受到激素信号转导和光合作用的控制。类黄酮生物合成途径在耐盐品种中起到了重要作用。     

基于转录组测序与定量PCR技术挖掘北沙柳株型相关候选基因

为构建北沙柳株型分子辅助育种体系实现高效定向育种,采用水培群体转录组测序与野外训练群体定量PCR分析相结合的方法,以RNA-Seq分析中的基因表达量(FPKM值)与冠高比(株型特征值)的相关系数作为预测值,探讨北沙柳株型相关候选基因挖掘技术。结果表明,北沙柳冠高比与FPKM值间存在相关性,在水培预测群体和野外训练群体中保持基本一致的趋势。文献中已报道的株型(或者分枝)相关基因(TAC2、LAZY1b、ZFP4、TB1、SPA2、ABF2和PYL1)的预测值在0～0.6,ATX1、RFK1和FHY1基因(未报道与株型相关)的预测值较高(0.6～1.0),按照“基因个数最少,相关系数最高”的原则,选择双基因组合ATX1+FHY1作为鉴别北沙柳株形的基因。将形态学、转录组学作为一个整体来挖掘株型性状相关基因是本研究特色,研究结果也可为其他植物、其他性状的分子辅助育种提供理论基础。     

冬瓜高通量转录组测序及分析

【目的】获得冬瓜转录组序列、遗传变异等信息,从中挖掘冬瓜基因数据及SSR分子标记,为冬瓜后续研究提供数据支撑。【方法】以冬瓜嫩叶为材料,利用Illumina HiSeq~(TM)2000技术对冬瓜进行转录组测序,构建数据库从中获得干净序列。经De novo拼接组装后,将获得的单基因簇(Unigene)数据在非冗余蛋白数据库(nonredundant protein database,Nr)、蛋白质序列数据库(Swiss Prot protein database,Swiss Prot)、基因本体论数据库(gene ontology,GO)、蛋白质真核同源数据库(eukaryotic orthologous groups,KOG)、东京基因与基金组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)、蛋白质家族域数据库(protein families database,Pfam)6个公共数据库中进行比对,最终得到冬瓜单基因簇注释信息。利用MISA软件对转录组单基因簇进行搜索,获得单基因簇中的SSR位点。【结果】从冬瓜嫩叶中得到62 021 032条高品质序列,组装后获得40 611条单基因簇,平均长度955 bp。将所有单基因簇在Nr和Swiss Prot数据库中进行比对,结果分别比对到27 474及19 573条单基因簇;在GO数据库中,所注释到的10 659条单基因簇分别匹配到生物功能、分子功能和细胞组分3个本体的47个功能组中;与KOG数据库进行注释比对,根据其功能将注释到的单基因簇划分为25类;KEGG数据库比对注释到10 799条冬瓜的单基因簇,可分为5个大类、19个亚类、125条代谢途径;在Pfam数据库中比对到17 990条单基因簇,分属于369个类群。SSR位点搜索发现,有5 086条单基因簇包含SSR序列,获得5 474个SSR位点。【结论】利用高通量测序获得大量冬瓜转录组信息,有助于从分子水平对冬瓜进行深入研究。     

玉米穗发芽突变体vp-like4的转录组分析

穗发芽是威胁粮食安全的全球性重要灾害.以玉米穗发芽突变体(viviparous) vp-like4与自交系郑58、Mo17组配的F2分离群体为材料,利用转录组测序技术(RNA-seq),结合生物信息学方法,比较野生型和与之对应的突变体的差异表达基因,并分析差异基因功能以及相关的代谢通路,探索调控玉米穗发芽发生的分子机制...     

CaCl2处理对铁棍山药块茎采后品质的影响

试验研究了CaCl2处理对铁棍山药采后贮藏过程中块茎品质的影响。结果表明:块茎含水量快速下降是其品质降低的关键因素。用适宜浓度(0.1%~1.0%)的CaCl2处理,可明显抑制贮藏期间铁棍山药块茎含水量的下降,使块茎褐变率大大降低,可溶性蛋白和可溶性总糖含量维持在较高的水平,而较高浓度(2.0%)的CaCl2处理则作用相反。     

基于转录组学测序的长白落叶松材性表达基因1）

基于边合成边测序（ Sequencing By Synthesis ,SBS）技术,使用Illumina HiSeq2500高通量测序平台对长白落叶松cDNA文库进行测序。共获得非重复序列基因58683条,总长度为55283938 bp。将得到的转录本使用BLAST软件将非重复序列基因序列与NR、Swiss－Prot、GO、COG、KEGG数据库比对,通过选择BLAST参数E－value不大于10－5,最终获得29350个有注释信息的基因序列,其中19292个转录本注释GO编号,有9112个转录本在COG数据库中被注释并分为25个功能分类,同时注释到120条KEGG代谢途径。在得到注释的转录本中搜索到木质素相关基因共68条,其中与木质素合成相关基因29条,与木质素分解代谢相关基因27条;找到了147条纤维素相关基因,其中与纤维素合成相关基因103条,与纤维素分解代谢相关基因44条。