油松苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

利用同源克隆的方法,从油松(Pinus tabulae ormis)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的cDNA和DNA序列,cDNA序列全长2 157 bp,编码718个氨基酸,包含有完整的ORF,命名为TaPAL(GenBank登录号:JX280460).通过核苷酸序列多重比较表明,TaPAL基因与其他植物PAL基因高度同源,预测的蛋白序列包含与水稻、玉米PAL相同的脱氨基位点和催化活性位点.PAL系统进化树显示,TaPAL与松科类植物PAL聚类关系最近.另外,对比发现TaPAL基因组DNA序列与cDNA序列完全一样,表明该基因无内含子.     

百香果苯丙氨酸解氨酶基因PePAL克隆及表达分析

为探讨百香果中苯丙氨酸解氨酶（PAL）编码基因的序列结构和蛋白质功能,以台农1号百香果（Passiflora edulis Sims）为材料,以cDNA为模板对PePAL基因进行同源克隆,同时对PePAL编码蛋白质的结构及功能进行预测。结果表明,PePAL基因cDNA全长2 499 bp,含有1个完整开放阅读框（2 124 bp）,编码707个氨基酸,蛋白质分子质量为173.43 ku。利用ProtParam、SignalP 4.1软件及TMHMM等软件对PePAL蛋白的结构预测显示,该蛋白质是一个亲水性的非分泌型蛋白,无跨膜结构域,无信号肽。PePAL主要定位于细胞核、叶绿体、细胞质、细胞膜、线粒体、液泡等部位,其二级结构由α螺旋、延伸链、β转角及无规则卷曲组成。PePAL在不同品种百香果的同一结果枝上的表达模式均呈现花中表达量最高,其次是茎,在成熟叶中表达量最低。     

枸杞苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

为研究枸杞苯丙氨酸解氨酶基因LcPAL在干旱和盐逆境中的作用,采用RT-PCR和RACE方法克隆了LcPAL基因(Genbank No.KX781247)。该基因cDNA长度为2 544bp,含有2 163bp的完整开放阅读框,编码720个氨基酸。蛋白序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIA),与其他植物的PAL蛋白有很高的同源性。系统进化树表明,枸杞LcPAL与茄科植物的PAL蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR方法检测发现,LcPAL基因在枸杞的叶中表达量最高,果实中表达量最少。其在聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)胁迫下诱导表达,但表达模式不同。研究结果推测从枸杞中克隆获得苯丙氨酸解氨酶(LcPAL),是典型的PAL家族成员,在枸杞各组织发育过程中具有重要功能,且在枸杞抗干旱和抗盐逆境过程也起一定作用。     

甘蔗苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗的苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）,分析其序列特征及其在不同组织和5种胁迫条件下的表达情况,为此基因在甘蔗抗逆育种中的应用提供理论支撑。【方法】利用串联飞行时间质谱仪对差异表达蛋白质进行质谱鉴定分析,通过RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号（ROC22）中克隆PAL,以生物信息学方法对其序列进行预测分析,利用real-time PCR分析PAL在不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。【结果】克隆获得甘蔗PAL,命名为ScPAL,GenBank登录号为KC172559。该cDNA全长2 590 bp,含有1个2 115 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码704个氨基酸。序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA）,与其它植物的PAL蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScPAL与高粱的PAL蛋白亲缘关系较近。real-time PCR分析表明PAL为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的66倍。其在低温（4℃）、聚乙二醇（PEG）、NaCl和H2O2四种外源胁迫下均诱导表达,但表达模式不同。【结论】从甘蔗品种ROC22中克隆获得苯丙氨酸解氨酶基因（ScPAL）,是典型的PAL家族成员,推测其参与了甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱和抗盐胁迫过程也起到某种作用。     

荸荠苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和表达

【目的】克隆荸荠Eleocharis tuberosa苯丙氨酸解氨酶基因(PAL),分析其序列特征及其在荸荠不同组织中和鲜切荸荠贮藏过程中的表达情况,为揭示鲜切荸荠黄化机理提供理论依据。【方法】通过RT-PCR和RACE技术从荸荠中克隆PAL基因的cDNA全长,采用生物信息学方法对其序列和所编码的蛋白进行预测分析,利用荧光定量PCR技术分析PAL基因在荸荠不同组织和鲜切荸荠贮藏过程中的表达情况。【结果】克隆得到荸荠PAL基因全长cDNA,将其命名为CwPAL,该序列长度为2 485 bp,含有1个2 142 bp的完整开放阅读框,共编码713个氨基酸。CwPAL蛋白分子式为C3437H5514N944O1058S34,相对分子质量为78 079,等电点为5.97,原子总数为10 987个。CwPAL包含PAL-HAL和PLN02457结构域及典型的PAL酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIAG)。CwPAL的二级结构以α–螺旋为主,其三维结构模型呈典型的"海马状"结构。系统进化分析表明,CwPAL与菠萝Ananas comosus和海枣Phoenix dactylifera的PAL蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明,CwPAL基因在荸荠皮中的表达量最高,鲜切荸荠贮藏过程中CwPAL基因表达量快速上升,水杨酸处理显著抑制了CwPAL基因的表达。【结论】Cw PAL属于典型的苯丙氨酸解氨酶家族,该基因可能通过调控苯丙烷代谢从而影响鲜切荸荠的黄化。     

带有GFP标签的油松苯丙氨酸解氨酶基因表达载体的构建

利用基因重组技术,将油松的苯丙氨酸解氨酶基因（TaPAL）克隆到PBI121植物表达载体中,并且用报告基因GFP替换了GUS,构建了包含绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物重组表达载体PBI121-GFP-TaPAL,GFP标签比GUS基因更加易于检测,方便进行TaPAL功能鉴定方面的研究。利用电击法将重组表达载体成功的转化进农杆菌GV3301中。该研究可以为深入研究苯丙氨酸解氨酶的结构及功能及进一步通过导入次生代谢关键酶来提高植物的抗病育种提供基础。     

苯丙氨酸解氨酶的研究进展

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是催化苯丙烷类代谢途径第一步反应的酶,也是这个途径的关键酶和限速酶,对植物的生长具有非常重要的意义。初步阐述了PAL的分布、结构与生化性质,基因的表达调控,以及该酶在植物抗病过程中的作用。     

禹白芷苯丙氨酸解氨酶基因 AdPAL1 的克隆与表达分析

【目的】探究禹白芷中欧前胡素含量与苯丙氨酸解氨酶基因 AdPAL1 表达的相关性,并对 AdPAL1进行克隆和原核表达。【方法】使用高效液相色谱法测定禹白芷快速生长期和收获期根和叶中欧前胡素的含量,并使用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）方法测定 AdPAL1 基因在同时期根和叶中的表达情况,以观察欧前胡素含量与 AdPAL1 基因表达是否具有相关性。此外,以禹白芷转录组为基础,采用逆转录 PCR（RT-PCR）技术从禹白芷根中克隆 AdPAL1 基因,并在大肠杆菌中进行表达。【结果】禹白芷快速生长期根中的欧前胡素含量远高于叶,而 AdPAL1 基因在根中的表达量也远高于叶。与快速生长期相比,收获期根中欧前胡素含量略有下降,AdPAL1 基因在根中的表达量也同时下降。这些结果表明 AdPAL1 基因表达与欧前胡素含量具有相关性。此外,生物信息学分析显示,禹白芷 AdPAL1 基因（GenBank 登录号：OQ822236）开放阅读框长 1 764 bp,编码 557 个氨基酸,其蛋白相对分子质量为 61.10 kD,等电点为 5.92,且具有苯丙氨酸解氨酶保守结构域（IPR005922,1~547）,属于 PAL 蛋白家族成员。AdPAL1 蛋白定位于细胞质,主要由 α- 螺旋和无规则卷曲构成,与石防风属植物 KpPAL2 蛋白亲缘关系最近,序列相似性高达 99.28%。AdPAL1 基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为 84.00 kD,与预期蛋白大小一致。【结论】初步确定禹白芷根和叶中欧前胡素含量与 AdPAL1 基因表达相关,并成功克隆 AdPAL1 基因,在大肠杆菌中成功表达。上述结果为进一步研究 AdPAL1 基因在欧前胡素生物合成中的作用机制提供参考。     

梨苯丙氨酸解氨酶基因的生物信息学分析

[目的]对梨苯丙氨酸解氨酶(PAL)的基因进行生物信息学分析。[方法]以梨的苯丙氨酸解氨酶基因为研究对象,运用生物信息学方法对其编码的蛋白质结构、理化性质及功能结构域进行分析。[结果]梨pal基因的全长编码区序列(Coding sequences,CDS)长2 160 bp,编码720个氨基酸;序列比对结果显示,梨的pal基因与葡萄、树莓、甜樱桃、烟草、毛果杨、柠檬、水稻pal基因的同源性分别为86%、90%、94%、85%、88%、88%和73%;系统进化分析结果显示,梨pal基因与甜樱桃的进化关系最为密切;梨苯丙氨酸解氨酶定位于细胞基质,二级结构以随机卷曲和α-螺旋为主要构件,三维建模成功。[结论]为今后研究PAL和梨木质素合成的分子机理提供了一定的理论参考。     

拟南芥苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

苯丙烷途径是植物体内广泛存在的次生代谢途径,此代谢过程中的第1个关键酶为苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-1yase,PAL)。苯丙氨酸解氨酶通过对基因的起始转录、频率的控制和对外界诱导因子的响应来调控基因的表达,并且其表达水平对于下游黄酮类物质的合成起着非常重要的作用。在一定条件下,苯丙氨酸解氨酶可利用其特殊的酶学性质逆向催化生产L-苯丙氨酸。通过一系列的生物信息学分析,确定拟南芥中苯丙氨酸解氨酶的存在,并进行基因的克隆及表达分析,为L-苯丙氨酸的生产提供新的物种来源。     

油松光合特性的研究

通过对黄土高原常用造林树木油松的光响应曲线、ACI曲线、光合速率、气孔导度等生理特性进行测定和对比分析,结果表明:油松树种的光饱和点为750.9μmol/(m·2s),该树种在光饱和点的光合速率为5.7μmol(CO2)/(m·2s)。油松光合日进程呈单峰曲线,在一定CO2范围内,光合速率与CO2浓度呈正相关。     

性别决定基因Sry原核表达载体的构建和蛋白检测

动物的性别在畜牧业是一项很重要的经济性状,而哺乳动物的性别决定受睾丸决定基因Sry的启动,获得SRY蛋白并探索它与其他相关因子之间的相互关系对于深入了解该因子的作用机理和寻求高效经济的性别控制方法尤为重要。本研究以小鼠为实验材料,通过PCR、质粒重组、酶切和测序等方法构建小鼠Sry的原核表达载体,使用IPTG诱导蛋白表达、SDS-PAGE电泳和western blotting等方法检测重组表达载体的原核表达。PCR、酶切和测序结果一致显示成功地构建了原核表达载体pET-21b-Sry;使用anti-Sry和anti-His特异性抗体进行的western blotting实验结果验证了蛋白表达的正确性。本实验不仅实现了哺乳动物性别决定因子的Sry原核表达,而其还获得了具有生物活性的SRY蛋白,对于深入研究Sry及其他相关基因的相互作用奠定了实验基础。     

牛白细胞介素-18基因原核表达载体的构建

根据已发表的IL-18蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从ConA活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛IL-18蛋白基因,其大小为582 bp。将该基因克隆到pMD18-T载体中,经序列测定表明该基因与gengbank上发表的牛白细胞介素-18基因序列同源性为98%。将该基因从重组pMD-gIL-18质粒中亚克隆到表达载体pET-32 a（＋）质粒中,构建原核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。     

金花茶CnCHS基因原核表达载体的构建及表达分析

根据已经克隆得到的金花茶（Camellia nitidissima Chi．）查尔酮合成酶基因序列,设计引物对P1／P2扩增出该基因全长并将其构建到原核表达载体 pGEX 4T 1中,转入大肠杆菌BL21后,用浓度为0．4 mmol／L的IPTG诱导其表达。SDS PAGE电泳检测结果显示,被诱导的大肠杆菌菌体中出现了约68 ku的特异融合蛋白,表明该基因在大肠杆菌中成功表达。     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。     

油松蒸腾速率与环境因子关系的研究

研究了20a生油松的蒸腾速率与环境因子的关系。结果表明:油松生长期内的蒸腾速度呈双峰型变化,平均蒸腾速度为0.501 5 m ol/g·s;影响油松蒸腾速率的主要因子是空气相对湿度、光照、土壤含水量     

油松类型划分与优良类型选育

通过对铜川焦坪林场油松母树林母树形态特征遗传变异的研究,根据树皮颜色和开裂方式等特征将油松划分为灰色纵裂型、灰色块裂型、灰色片裂型、黄色纵裂型、黄色片裂型与黑皮型6种形态类型,不同类型在经济性状、子代幼苗生长量、硝酸还原酶活力方面均存在显著差异。其中,黄色纵裂型、灰色纵裂型、黄色片裂型为优良类型。     

拟南芥AtCOR15a抗寒基因原核表达载体的构建及蛋白表达

[目的]通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体.构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化.[结果]AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2～1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异.但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

猪RBP-4基因原核表达载体的构建及表达

为构建猪RBP-4基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达蛋白。取成年母猪正常卵巢组织提取总RNA,RT-PCR后回收扩增产物,构建表达载体pEASY-E1-RBP4,转化BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长序列与GenBank中的序列基本一致。原核表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,其以包涵体形式表达。试验成功构建了猪RBP4基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,为后续蛋白纯化及抗体的制备奠定基础。